Fundamentos de la cromatografía

Cuando estudie los fundamentos de la cromatografía, explorará el hecho de que es una técnica que permite a los científicos separar las moléculas de interés de una mezcla de crudo. El propósito de la cromatografía es separar una mezcla compleja en componentes individuales explotando el efecto de partición que distribuye las moléculas en diferentes fases, también será discutido. Usted encontrará que en la cromatografía de intercambio catiónico, el matric tiene un grupo funcional cargado negativamente con una afinidad hacia las moléculas cargadas positivamente. Usted será introducido al concepto de cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC), que explota la capacidad de interacciones fuertes entre el grupo hidrofóbico unido a la matriz y los parches hidrofóbicos presentes en un analito tal como una proteína. Usted aprenderá que en presencia de una gran cantidad de sal, la molécula de agua que protege las cadenas laterales de proteínas, se desplaza completamente con una exposición de parches hidrofóbicos en la superficie de la proteína para inducir la precipitación de proteínas o una reducción en la solubilidad de la proteína. Usted descubrirá que la adición de una baja cantidad de sal a la solución de la proteína resulta en el desplazamiento de las moléculas de agua unidas con un aumento en la solubilidad de la proteína. Las demostraciones, problemas, ejemplos y preguntas de evaluación en este curso basado en vídeo guiado por el instructor, están diseñados para proporcionarle una base integral en la cromatografía.

El material le presenta los mecanismos de separación en la cromatografía y las diferentes propiedades físicas que se pueden utilizar para separar las moléculas. Luego, se discutirán las proteínas, que tienen mínima solubilidad en soluciones con un pH que corresponde a su Pi y que a menudo se precipitan fuera de solución. Usted explorará el hecho de que el peso molecular y el tamaño de una proteína está relacionado con la forma de la molécula y la relación entre su peso molecular y el radio de la giración. Descubrirá el hecho de que el tiempo de retención se refiere al tiempo que tarda un analito en salir de la columna. Se aclarará que las dos formas principales de cromatografía son cromatografía de partición y cromatografía de adsorción. Usted descubrirá que en la cromatografía de columnas, una fase estacionaria se llena en un tubo cilíndrico formado por vidrio o acero. También aprenderá que la trama del volumen de elución, junto con la absorbancia, se conoce como un cromatograma. Usted encontrará que el término resolución, se refiere a la capacidad de una columna de cromatografía para separar dos picos de analitos entre sí.

A continuación, usted aprenderá que para el instrumento de cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC) las columnas de plástico son las más apropiadas para usar, mientras que para el instrumento de cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) las columnas de acero inoxidable son las más apropiadas para usar. Obtendrá información sobre el hecho de que el tamaño del bucle depende de la cantidad de proteína que desea inyectar y de la capacidad de la columna. A continuación, descubrirá que las cuatro propiedades de una molécula de proteína son la carga, la superficie, la afinidad y su hidrofobicidad. Se le enseñará que las diferentes técnicas de cromatografía que puede utilizar para explotar las propiedades de una molécula de proteína son cromatografía de intercambio iónico (IEX), HIC, cromatografía de filtración en gel y cromatografía de afinidad. Usted descubrirá que al preparar cuentas de matriz para la cromatografía, el primer paso es hinchar el medio, seguido por la eliminación de partículas muy pequeñas y el último paso es el equilibrio con los iones de contra. Finalmente, usted estudiará técnicas de cromatografía, conexiones de columna, amortiguadores de cromatografía de intercambio catiónico, y métodos de análisis de eluyentes. Este curso será de interés para los estudiantes de biotecnología, o aquellos profesionales en biotecnología experimental que quieran perfeccionar sus conocimientos técnicos.