I fondamenti della cromatografia

Quando studierai i fondamenti della cromatografia, imparerai come questa tecnica consente agli scienziati di separare le molecole di interesse da una miscela grezza. Lo scopo della cromatografia è quello di separare una miscela complessa in singoli componenti sfruttando l'effetto di partizione che distribuisce le molecole in diverse fasi. Scoprirai che nella cromatografia a scambio cationico, la matrice ha un gruppo funzionale caricato negativamente con un'affinità verso le molecole caricate positivamente. Verrà introdotto il concetto di cromatografia a interazione idrofobica (HIC), che sfrutta la capacità di forti interazioni tra il gruppo idrofobo attaccato alla matrice e le macchie idrofobe presenti su un analita come una proteina. Imparerai che in presenza di un'elevata quantità di sale, la molecola d'acqua che protegge le catene laterali delle proteine viene completamente spostata con un'esposizione di chiazze idrofobe sulla superficie della proteina per indurre la precipitazione proteica o una riduzione della solubilità proteica. Scoprirai che l'aggiunta di una bassa quantità di sale alla soluzione proteica provoca lo spostamento delle molecole d'acqua legate con un aumento della solubilità proteica. Le dimostrazioni, i problemi, gli esempi e le domande di valutazione in questo corso basato su video con istruttore sono progettati per fornirti una base completa sulla cromatografia

Il materiale introduce ai meccanismi di separazione nella cromatografia e alle diverse proprietà fisiche che possono essere utilizzate per separare le molecole. Quindi, verranno discusse le proteine, che hanno una solubilità minima in soluzioni con un pH corrispondente al loro Pi e spesso precipitano fuori soluzione. Esplorerai il fatto che il peso molecolare e la dimensione di una proteina sono correlati alla forma della molecola e alla relazione tra il suo peso molecolare e il raggio di rotazione. Scoprirai che il tempo di ritenzione si riferisce al tempo impiegato da un analita per uscire dalla colonna. Si chiarirà che le due principali forme di cromatografia sono la cromatografia di partizione e la cromatografia ad adsorbimento. Scoprirete che nella cromatografia su colonna, una fase stazionaria viene inserita in un tubo cilindrico di vetro o acciaio. Imparerai anche che il grafico del volume di eluizione, insieme all'assorbanza, è noto come cromatogramma. Scoprirai che il termine risoluzione si riferisce alla capacità di una colonna cromatografica di separare due picchi di analiti l'uno

Successivamente, imparerai che per lo strumento di cromatografia liquida proteica veloce (FPLC) le colonne di plastica sono le più appropriate da usare, mentre per lo strumento di cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) le colonne fisse in acciaio inossidabile sono le più appropriate da usare. Comprenderai che la dimensione dell'ansa dipende dalla quantità di proteine che vuoi iniettare e dalla capacità della colonna. Scoprirai quindi che le quattro proprietà di una molecola proteica sono la carica, l'area superficiale, l'affinità e la sua idrofobicità. Ti verrà insegnato che le diverse tecniche cromatografiche che puoi utilizzare per sfruttare le proprietà di una molecola proteica sono la cromatografia a scambio ionico (IEX), l'HIC, la cromatografia con filtrazione su gel e la cromatografia di affinità. Scoprirai che quando si preparano le sfere di matrice per la cromatografia, il primo passo è gonfiare il mezzo, seguito dalla rimozione di particelle molto piccole e l'ultimo passaggio è l'equilibrio con controioni. Infine, studierai tecniche cromatografiche, connessioni su colonna, tamponi cromatografici a scambio cationico e metodi di analisi degli eluenti. Questo corso interesserà gli studenti di numerose discipline scientifiche, tra cui