Les principes fondamentaux de la chromatographie

En étudiant les principes fondamentaux de la chromatographie, vous découvrirez comment cette technique permet aux scientifiques de séparer les molécules d'intérêt d'un mélange brut. Le but de la chromatographie est de séparer un mélange complexe en composants individuels en exploitant l'effet de partage qui distribue les molécules en différentes phases. Vous découvrirez qu'en chromatographie échangeuse de cations, la matrice possède un groupe fonctionnel chargé négativement avec une affinité pour les molécules chargées positivement. Vous serez initié au concept de chromatographie d'interaction hydrophobe (HIC), qui exploite la capacité d'interactions fortes entre le groupe hydrophobe attaché à la matrice et les patchs hydrophobes présents sur un analyte tel qu'une protéine. Vous apprendrez qu'en présence d'une grande quantité de sel, la molécule d'eau protégeant les chaînes latérales des protéines est complètement déplacée par l'exposition de plaques hydrophobes à la surface de la protéine pour induire la précipitation des protéines ou une réduction de leur solubilité. Vous découvrirez que l'ajout d'une faible quantité de sel à la solution protéique entraîne le déplacement des molécules d'eau liées avec une augmentation de la solubilité des protéines. Les démonstrations, les problèmes, les exemples et les questions d'évaluation de ce cours vidéo dirigé par un instructeur sont conçus pour vous fournir une base complète en chromatographie

Le matériau vous présente les mécanismes de séparation en chromatographie et les différentes propriétés physiques qui peuvent être utilisées pour séparer des molécules. Ensuite, les protéines seront discutées, qui ont une solubilité minimale dans les solutions dont le pH correspond à leur Pi et qui précipitent souvent hors de la solution. Vous explorerez le fait que le poids moléculaire et la taille d'une protéine sont liés à la forme de la molécule et à la relation entre son poids moléculaire et le rayon de giration. Vous découvrirez que le temps de rétention fait référence au temps qu'il faut à un analyte pour sortir de la colonne. Il sera précisé que les deux principales formes de chromatographie sont la chromatographie de partition et la chromatographie d'adsorption. Vous découvrirez qu'en chromatographie sur colonne, une phase stationnaire est introduite dans un tube cylindrique en verre ou en acier. Vous apprendrez également que le graphique du volume d'élution, ainsi que de l'absorbance, est appelé chromatogramme. Vous découvrirez que le terme résolution fait référence à la capacité d'une colonne de chromatographie à séparer deux pics d'analyte l'un de l'autre

Ensuite, vous apprendrez que pour l'instrument de chromatographie liquide rapide des protéines (FPLC), les colonnes en plastique sont les plus appropriées, tandis que pour l'instrument de chromatographie liquide à haute performance (HPLC), les colonnes fixes en acier inoxydable sont les plus appropriées. Vous comprendrez que la taille de la boucle dépend de la quantité de protéines que vous souhaitez injecter et de la capacité de la colonne. Vous découvrirez alors que les quatre propriétés d'une molécule de protéine sont la charge, la surface, l'affinité et son hydrophobicité. Vous apprendrez que les différentes techniques de chromatographie que vous pouvez utiliser pour exploiter les propriétés d'une molécule de protéine sont la chromatographie échangeuse d'ions (IEX), la HIC, la chromatographie par filtration sur gel et la chromatographie d'affinité. Vous découvrirez que lors de la préparation des billes matricielles pour la chromatographie, la première étape consiste à gonfler le milieu, puis à éliminer les très petites particules et la dernière étape est l'équilibrage avec des contre-ions. Enfin, vous étudierez les techniques de chromatographie, les connexions de colonnes, les tampons de chromatographie échangeuse de cations et les méthodes d'analyse des éluants. Ce cours intéressera les étudiants de plusieurs disciplines scientifiques, notamment la chimie analytique et la biologie.