The Fundamentals of Chromatography

Lorsque vous étudiez les principes de base de la chromatographie, vous apprendrez comment cette technique permet aux scientifiques de séparer les molécules d'intérêt d'un mélange brut. Le but de la chromatographie est de séparer un mélange complexe en composants individuels exploitant l'effet de partition qui distribue les molécules en différentes phases. Vous découvrirez que la chromatographie d'échange cationique a un groupe fonctionnel chargé négativement avec une affinité pour les molécules chargées positivement. Vous serez introduit dans le concept de chromatographie d'interaction hydrophobe (HIC), qui exploite la capacité d'interactions fortes entre le groupe hydrophobe attaché à la matrice et les taches hydrophobes présentes sur un analyte tel qu'une protéine. Vous apprendrez qu'en présence d'une grande quantité de sel, la molécule d'eau qui protège les chaînes latérales des protéines est complètement déplacée avec une exposition de taches hydrophobes sur la surface des protéines pour induire des précipitations protéiques ou une réduction de la solubilité des protéines. Vous découvrirez que l'addition d'une faible quantité de sel à la solution protéique résulte en déplacement de molécules d'eau cautionnées avec une augmentation de la solubilité des protéines. Des démonstrations, des problèmes, des exemples et des questions d'évaluation dans ce cours de formation vidéo dirigé par un instructeur sont conçus pour vous fournir une base complète en chromatographie.

Le matériau vous présente les mécanismes de séparation en chromatographie et les différentes propriétés physiques qui peuvent être utilisées pour séparer les molécules. Ensuite, les protéines seront discutées, qui ont une solubilité minimale dans les solutions avec un pH qui correspond à leur Pi et elles précipitent souvent hors de la solution. Vous allez explorer le fait que le poids moléculaire et la taille d'une protéine sont liés à la forme de la molécule et à la relation entre son poids moléculaire et le rayon de giration. Vous découvrirez le fait que le temps de rétention désigne le temps qu'il faut à un analyte pour sortir de la colonne. On précisera que les deux principales formes de chromatographie sont la chromatographie sur partition et la chromatographie d'adsorption. Vous découvrirez qu'en chromatographie sur colonne, une phase stationnaire est remplie dans un tube cylindrique constitué de verre ou d'acier. Vous apprendrez également que le tracé du volume d'élution, avec l'absorbance, est connu sous le nom de chromatogramme. Vous découvrirez que le terme résolution fait référence à la capacité d'une colonne de chromatographie de séparer deux pics d'analyte les uns des autres.

Ensuite, vous apprendrez que pour l'instrument de chromatographie en phase liquide rapide (FPLC), les colonnes en plastique sont les plus appropriées à l'utilisation, tandis que pour l'instrument de chromatographie liquide à haute performance (HPLC), les colonnes inoxydasiques sont les plus appropriées à utiliser. Vous en apprendrez davantage sur le fait que la taille de la boucle dépend de la quantité de protéines que vous voulez injecter et de la capacité de la colonne. Vous découvrirez alors que les quatre propriétés d'une molécule de protéine sont la charge, la surface, l'affinité et son hydrophobicité. On vous enseignera que les différentes techniques de chromatographie que vous pouvez utiliser pour exploiter les propriétés d'une molécule de protéine sont la chromatographie d'échange d'ions (IEX), HIC, la chromatographie de filtration sur gel et la chromatographie d'affinité. Vous découvrirez que lors de la préparation des billes de matrice pour la chromatographie, la première étape consiste à gonfler le milieu, suivie par l'enlèvement de très petites particules et la dernière étape est l'équilibre avec les ions de compteur. Enfin, vous étudierez les techniques de chromatographie, les connexions de colonnes, les tampons de chromatographie échangeuse de cations et les méthodes d'analyse des éluants. Ce cours intéressera les étudiants d'un certain nombre de disciplines scientifiques, dont la chimie analytique et la biologie.