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este slide está aqui se eu tinha uma maneira de bloqueá-lo, eu posso imediatamente perguntar um quiz e ver se você se lembra, então onde você encontrará o cap 5 '? No início da UTR. Então qual será a relação do local de início da transcrição com a relação com os exons e intrôos? Por isso, a UTR 5 pode muito bem estar começando no local de início da transcrição para que ele possa estar no exon também. Tudo bem, vamos fazer mais quizzes depois sobre isso. Então, agora mesmo, vamos continuar nisso, então hoje vamos nos concentrar principalmente em técnicas de biologia molecular, algumas das quais você pode ter aprendido em outros cursos, e alguns deles podem ser novos. Porque alguns deles são técnicas baseadas em organismo inteiro e que você pode não ter ouvido em outro lugar. Por isso, essencialmente, o foco principal são as técnicas pelas quais tentamos compreender a expressão gênica diferencial. Então, esse vai ser o foco desta palestra assim como a próxima. (Consulte O Tempo De Deslizamento: 01:43) Então, isso está continuando refrescando nossa memória da estrutura de genes eucarióticos. Por isso, o anterior era um desenho; esta é uma sequência real do gene beta-globina. Assim você tem os elementos de promoter upstream como a caixa TATA, e esta é a sequência de -70. Por isso, estes estão lá na maioria dos promotores; é por isso que fazem parte da estrutura do núcleo aqui. Portanto, esta é a sequência que sinaliza a adição de cap. E os coloridos são exons os cinzentos são os intrôos. Então você vê que o UTR é um exon e lá você tem o boné, iniciar o codon ATG, depois o nucleotídeo real e a sequência de aminoácidos traduzidos. Aí você tem o início de uma intron e fim de uma intron e então assim por diante. Mais tarde, no final, você tem o códon de parada, e então você tem 3 ' UTR. Então então você tem o AATAAA, este é um sinal de poly-A canônica, mas outras variantes deste também funcionam como sinal de poliadenilação. Por isso, ajudam na identificação do site de clivagem também. Por isso, na verdade, o maquinário que faz o decote, aqui o decote significa, a transcrição do pré mRNA ou nascente pode ser mais longa na década de 3 ' do que a madura no citoplasma tendo a cauda poly-A. Por isso, no decote de final de 3 acontece, por isso, alguma quantidade do mRNA transcrito é removida, e para o restante, poly-A cauda é adicionada. Sendo assim, esse é um grande complexo e altamente regulado; é tão grande quanto um ribossomo. Outro complexo tão grande é o spliceossomo, o maquinário splicing. Portanto, estes são grandes complexos de proteína que operam. (Consulte O Tempo De Deslizamento: 03:45) Então, a seguir, estamos olhando para a transcrição em si, então este é o primeiro passo aqui, então você tem a transcrição. Assim, assim que a nascente mRNA ou RNA nuclear sai, você tem a tampa adicionada, cap Trimetil G. Nessa fase, a emenda ainda está para acontecer; é o que eu quero destacar, essas adições ajudam na proteção do RNA. Mas não tenho certeza por que esse passo é rápido, mas essas adições acontecem em ambas as extremadas antes do início da emenda. Então, então você tem processamento, que é essencialmente emenda. (Consulte O Tempo De Deslizamento: 04:28) Então você tem o RNA mensageiro ou mRNA maduro, então isso entra no citoplasma onde ele é traduzido, então você tem a cadeia de proteína. E então isso tem que passar por duas coisas; uma dobradona adequada à conformação nativa e também modificação pós-traducional. Então, aqui, por exemplo, o grupo protético é adicionado, esta é uma proteína de quatro subunidades, é um heterodimer. Por isso, beta-globina, alfa-globina, cada um se unem para fazer a molécula funcional. Por isso, todos esses passos colocados juntos é o que você chama como expressão gênica. Portanto, não assuma que só a transcrição é expressão gênica, e isso é algo como nível de proteína, a coisa toda é expressão gênica. Quando se fala de gene, a definição de um gene é uma função biológica que é o fenótipo, portanto, a proteína é responsável por ela. Por isso, não distinguimos esses passos, partindo das modificações da estrutura cromatina; como da heterocromatina à transformação eucromatina que acontece devido à remoção de grupos de metilo e adição de grupos de acetilo e de grupos de metilo específicos à cauda H3; começando de lá para a proteína ativa ou inativa pós-translacionalmente modificada. Então, até isso, os passos inteiros são chamados de expressão gênica; cada um é um passo na expressão gênica. Por isso, agora sabemos o que é um gene e qual é a sua forma funcional final. (Consulte O Slide Time: 06:13) Então agora deixe-nos olhar novamente estamos atualizando alguns outros passos, ainda não estamos entrando em expressão de gene diferenciado. Para isso, queremos nos familiarizar com o que acontece, para sabermos onde os regulamentos podem acontecer. Por isso, a primeira coisa é que vamos olhar para a própria iniciação de transcrição, por isso a iniciação de transcrição neste desenho vai com alguns detalhes. Ainda assim, o resumo é que um conjunto de proteínas tem que se ligar em uma sequência específica para ativar a polimerase de RNA para iniciar a transcrição. Por isso, a montagem inicial e o recrutamento da polimerase de RNA para o promotor é o que você chama como iniciação de transcrição. Então aqui você tem TF2D, fator de transcrição 2D, de modo que tem primeiro que ligar, ele liga a caixa TATA então recruta 2A, então você tem B e H, essas estruturas de pinças. (Consulte O Tempo De Deslizamento: 07:14) Eles adicionam e, em seguida, somente você tem pol II recrutado, e para a pol II, você tem o E e F já ligando para ele, e quando ele liga esse domínio carboxil-terminal, o CTD desempenha um papel significativo na regulação. De modo que está ligado à estrutura 2D, a molécula principal. (Consulte O Tempo De Deslizamento: 07:39) E assim é assim que é, então isso já está definido, mas é um não ir. Portanto, isso requer fosforilação de CTD. Por isso, a fosforilação ou não a fosforilação é um passo para lá. Se a fosforilação não acontecer, então a transcrição não será iniciada, embora tudo tenha vinculado. Portanto, esse é um passo onde a regulação muitas vezes acontece. Por isso, certos resíduos de serina são críticos para a fosforilação. Por isso, os biólogos desenvolvimentistas usam aqueles anticorpos específicos de serina fosforilados ou anticorpos específicos de CTD fosforilados para medir se a transcrição está acontecendo em um determinado núcleo ou não. Assim, com aqueles anticorpos fosforilados específicos fosforilados ou CTD específicos, se você não detectar um sinal provavelmente, não há transcrição de mRNA acontecendo. Por isso, lembre-se que estamos falando apenas de mRNA porque é pol II anticorpos específicos, mas outra transcrição poderia estar acontecendo. Então uma vez pol II fosforilado, então ele é liberado a partir de TF2D, e ele está pronto para alongar. Então iniciação então alongamento, então esta é a etapa de iniciação, e isso é alongamento. E mesmo no alongamento, ele pode ser pausado às vezes, por isso não vamos entrar nesses detalhes, mas isso é bom o suficiente para saber que se trata de um passo em potencial para a regulação. (Consulte O Tempo De Deslizamento: 09:17) Certo, então agora nós somos feitos com esses básicos. Por isso, vamos agora analisar uma série de experimentos que nos ajudam a identificar seqüências na região do promotor e assim como em outros lugares nas proximidades do gene que poderiam estar contribuindo para a transcrição um, e segundo, vamos também olhar como é que se encontra fatores de transcrição? Ou seja, transagindo fatores como proteínas. A sequência de DNA é chamada de Cis porque ela está na mesma molécula que o quadro de leitura aberta e a proteína é codificada em outro lugar, e ela vem como uma molécula diferente diferente daquela peça de DNA onde você tem o gene, então, portanto, ele se chama Trans. Por isso, quando se diz fatores transatores, está falando de fatores que não a uma dada sequência de genes que influencia essa expressão gênica. Portanto, este é um Assay muito usado; as pessoas o utilizam para vários contextos onde você deseja testar a interação de proteína do ácido nucléico. Por isso, neste momento, estamos analisando a interação com DNA-proteína para descobrir os elementos promotora que podem estar envolvidos na interação com um fator de transcrição específico. Assim, esses fatores de transcrição mostrados na cor azul estão auxiliando no recrutamento do RNA pol II para o promotor, e são fatores de transcrição, portanto, esses fatores são listados aqui e nomeados; estes estão lá para cada gene. Estes são fatores de transcrição do núcleo, e há fatores de transcrição específicos do gene que aprenderão mais tarde, e assim como testar se um dado fator de transagem interage com um determinado elemento de DNA ou não? Portanto, para testar isso é usamos este experimento chamado gel shift assay ou gel mobilidade shift assay ou gel retardation Assay; há vários nomes para ele. O termo mais comumente usado é o deslocamento de mobilidade eletroforética Assay ou E M S A ou EMSA. Por isso, alguns laboratórios chamam a EMSA, ou alguns laboratórios chamam E M S A, alguns laboratórios nem sequer dizem que dizem deslocamento de mobilidade ou turno de gel. Trata-se de uma técnica direta. Então o que você está fazendo é pegar uma versão radiolabada mostrada aqui nesta, seja qual for a cor que vem naquela tela aqui para mim ela parece roxa. Então você pega uma versão radiolabólica do fragmento de DNA que você quer testar se ele interage com uma determinada proteína. Depois, você incuba o DNA com a proteína; pode ser proteína purificada, ou é um liso celular onde a proteína pode estar presente, então você incuba com ela, e aí você corre em um gel. Se a proteína se liga a esse fragmento de DNA, o tamanho complexo é maior do que o ácido nucléico individual, portanto, a mobilidade é reduzida. Já que no gel você vê como um deslocamento, um deslocamento para cima você o chama como gel shift shift assay ou já que ele retarda a mobilidade do ácido nucléico você chama como gel retardation assay, então todos esses nomes são válidos. Então é assim que se vê. Portanto, aqui neste caso específico, Pax 6 é um fator de transcrição sobre o qual veremos mais algum. E sem que o ácido nucléico livre chamamos de sonda livre, por isso sonda livre por um tempo determinado em uma dada condição de gel, por exemplo, tamanho de poro de gel, etc. Ele movimenta uma certa distância, e quando você adiciiza o fator de transcrição que liga esse fragmento de DNA específico, sua mobilidade é deslocada; já que ela é radiolabólica, você pode detectá-lo por autoradiografia então este é um experimento muito versátil e muito útil. Em nosso laboratório, usamos principalmente para encontrar proteínas de ligação de RNA que interagem com a 3 ' UTR e regulam a tradução. Sendo assim, esse é o contexto em que utilizamos, portanto, portanto, ele é útil para a interação do ácido nucléico-a interação proteína em diferentes configurações. Então na pista 3 você tem Pax6 adicionado, então ele se desloca, e na pista 4 também Pax6 é adicionado; é um experimento de controle. Por isso, a interpretação aqui tem duas explicações alternativas uma talvez seja uma proteína que ligaria qualquer ácido nucléico, non especificamente. Ele pode não ser de sequência específica, para testar que o que você faz é adicionar um excesso de molar significativo do mesmo fragmento de ácido nucléico mas sem radiolabeling. Então agora o que vai acontecer é dependendo do que é o excesso de molar; digamos que eu tenho um excesso de molar de 10 vezes ou 100 vezes de excesso de molar, então essa intensidade vai cair por aqui. Só tem um porque é um desenho animado e só te mostrando o esquema. Mas em um experimento real, teremos 2-fold, 4-fold, 10-fold, 100-dobra como seriado aumentado sem rótulo o mesmo ácido nucléico. Assim, isso também teria uma tendência igual de se ligar; é mais como um inibidor competitivo. Então agora você tem a banda lá, mas isso não é ter radioatividade, então você não detecta. Então, então outro controle que não é mostrado aqui é você adicionar excesso de molar semelhante de um número similar de nucleotídeos o mesmo comprimento do ácido nucléico mas uma sequência não específica. E isso não vai competir fora se for encadernação específica de sequência, mesma sequência não rotulada irá competir a radiolabel lá, mas uma sequência diferente não vai competir. Por isso mesmo que seja em excesso, essa proteína ainda o vinculará a essa sequência específica. (Consulte Slide Time: 15:41) Certo, então o próximo é Proteção de DNase Assay, então esta foto se você ver, não estamos mais fazendo sequenciamento de DNA por este método mas de outra forma supor como quando eu era aluno este é um gel de rotina, então esse tipo de imagem que vemos todos os dias se estamos fazendo sequenciamento de DNA. Então, naqueles dias, nós não fizemos um lote inteiro em biologia desenvolvimentista. Por isso, esses experimentos de biologia molecular são o que a maioria das pessoas fez, então é assim que se faz o sequenciamento de DNA. Então você tem oligo radiolabado para começar, e em cada reação, você tem dideoxia desse nucleotídeo, assim você terá quatro pistas que vai correr quatro pistas em um gel. E aí você olha em qual pista você tem o menor fragmento, e a partir daí progressivamente, você conta para cima, e é assim que se consegue a sequência de DNA. Então, este é um tal gel sequenciador de DNA, mas aqui você não está sequenciando o próprio DNA. Por isso, em vez disso, o DNA é incubado com uma proteína que se liga a alguma região do DNA, portanto, este é realmente grande fragmento comparado com o que é usado em assado em gel shift. Então aqui você está tentando encontrar qual sequência na sequência maior do DNA, liga-se à proteína. Em seguida, uma vez que a proteína se liga ao DNA, você adiciiza uma nuclease, um tratamento controlado por nuclease é feito. Então agora o fragmento que é protegido pela primeira proteína que está ligada ao DNA, protege essa sequência, e o resto ele fica clemente. E quando você corre um gel, já que ela é controlada a digestão e você tem digestão parcial para cada comprimento nucleotídeo. Por isso, na pista de controle, você vê bandas por toda a extensão porque em todos os lugares que poderiam ser digeridas. Mas se você olhar para esta porção nessas duas pistas e depois aqui, você vê bandas desaparecidas ao adicionar Pax6. Então, se você comparar as duas primeiras pistas com a pista de controle que não tem pax-6, indique que pax6 se liga a essa região, principalmente você está testando qual porção do DNA é protegida por sua proteína do decote da nuclease. Então, isso também é feito com a proteção RNAse para encontrar parte do RNA onde o RNA encadernação de proteína liga. Assim, trata-se de um ensaio de proteção DNAse, que também é chamado de pegada de pegada porque é como uma pegada, a pegada proteica ’ s. (Consulte O Tempo De Deslizamento: 18:32) Assim, antes de entrarmos no próximo conjunto de técnicas, vamos observar uma parte do gene que é um elemento regulatório, eles não pertencem à parte de codificação do gene, e pode estar em qualquer lugar de fato não precisa estar sempre na região do promotor, pode estar a uma distância considerável, pode ser a jusante do local de iniciação da transcrição também. Então é isso que nós vamos olhar, e eles são chamados de aprimorancers. Então, o que são os aprimorancers? O primeiro ponto diz que controlam a eficiência e a taxa de transcrição. Então, eles podem aumentar a taxa, ou em alguns lugares, eles especificam muito estritamente a expressão espacial ou temporal de um gene, de modo que é mostrado aqui neste. No cartoon promoter Pax6, estes bares ou bandas de cor laranjinha, são os exons. Este vermelho é o próprio promotor, então este verde é o realçador, e você vê realçador presente aqui quatro fragmentos ou quatro partes, e um deles está na verdade em uma intron. Então, 1, 2, 3, 4, 5, 5a, 6, 7, são exon e entre esses são intrôos, portanto, um dos aperfeiçoadores faz parte de uma intromia também. Então, todos esses aprimorancers, como mencionei, eles controlam eficiência e taxa e, às vezes, rigoroso regulamento temporal e espacial. E aqui vemos tais informações de regulação espacial, por exemplo, este aprimorador entre exon 4 e 5 confere expressão de Pax6 na retina e este exon específico aqui pouco antes do início da transcrição é um realçador de tubo neural que tem certeza que esta proteína é expressa em tubos neurais. E o outro lente e córnea, se você não tiver, não vai se expressar lá e o outro o upstream mais é pancreas-específico. Por isso, cada um desses quatro tem quatro expressões específicas de tecido desse gene. Assim, você pode ter o principal promotor, fator de transcrição do núcleo tudo, mas você não vai ter uma transcrição, se você não tiver esses reforçadores e aqueles fatores de transcrição específicos do aprimorador. Então, vamos vê-los um por um. Por isso, essa sequência real informa em uma parte dessa sequência de aprimoramento pancreático onde você vê sites de ligação para dois fatores de transcrição diferentes. (Consulte O Slide Time: 21:28) Então, um pouco mais de detalhes sobre isso veremos em dois slides depois. Há muitas maneiras pelas quais um identifica aprimorancers, e uma técnica fácil de entender e muito poderosa é a armadilha do aprimorador. Então, envolve ter um promotor principal conduzindo um gene repórter, tudo isso embutido em um elemento transponível. Então, essa técnica é útil em um organismo em que existem elementos transponíveis endógenos naturais. Esses elementos pulam e pulam para fora dependendo do contexto, onde eles estão ativos ou não; dependendo disso, eles se movimentarão ao redor do genoma. E geralmente, para que elementos transponíveis sejam inseridos, eles precisam de sequências repetitivas, e onde quer que isso esteja lá eles irão. Portanto, se você usa os elementos transponíveis como um veículo para carregar este repórter com o promotor principal, sem nenhum elemento regulatório como nenhum enhista ou qualquer coisa e se você fornecer o contexto em que elementos transponíveis estão ativos, por um determinado período e se você olhar para ele encontrará diferentes inserções. Trata-se de uma espécie de mutagênese utilizando elementos transponíveis, em vez de algum outro mutagênico. Por isso, em um determinado organismo, o elemento transponível estará presente em diferentes partes do genoma. Se este repórter transcriptício for inserido nas proximidades de um enhador como você vê nesta foto aqui. Se esse aprimorador influencia a expressão deste repórter, isso se expressa onde um gene é geralmente expresso, e então você pode detectá-lo desta forma na figura. Trata-se de um embrião de drosophila na figura, portanto onde você vê o padrão de expressão. Por isso, essencialmente, você está prendendo um realçador com a ajuda de um gene repórter. Então, o gene repórter tem um promotor fraco; ele apenas tem o núcleo básico um, e não vai se expressar por conta própria sem vir sob a influência do enhancer. Então, quando você faz a inserção aleatória, se o repórter fica inserido perto de um enhancer, e se o repórter expressa onde aquele aprimorador ativa a transcrição de um gene, tipicamente, ele mostra que esse aprimorador funciona neste tecido específico. Então mais tarde isso pode ser verificado por outros métodos também, o gene repórter aqui é o LacZ. Então, isso é feito em uma era muito antes de a GFP ser descoberta. Para que você descubra com o sequenciamento da região de flanqueamento, isso não será difícil, mas o ponto é você ter prensado um enhador. Por isso, o objetivo principal novamente são esses processos de pensamento estão vindo da genética; na genética, você não se preocupa com a molécula. Primeiro, você vê se você atingiu uma molécula que é responsável por uma função, então você pode procurar e encontrar a molécula; isso é muito mais fácil do que ter um buquinho de moléculas como você pode pegar qualquer organismo e esmagá-lo e enviá-lo para uma empresa. E vão dar a você todas as proteínas produzidas lá, todo o mRNA produzido lá, mas o que você fará com ele sem se conectar à função? Então, costumamos chamar que uma grande lista de lavanderia, mas você não sabe o que fazer com ela, muitas dessas listas estão penduradas nos últimos 20 anos sem que as pessoas tenham feito progresso, isso não é uma menosinha a utilidade disso. Isso é apenas para destacar a importância de se conectar diretamente ao fenótipo porque é direto fazer um PCR inverso e sequenciar a sequência vizinha. Já que você conhece a sequência, assim você pode digerir com enzimas de restrição, e algumas podem cortar em algum lugar aqui e ali. Sob uma condição muito diluída, se você ligá-lo, a ligação intramolecular vai acontecer. Então, ele vai ficar circularizado, aí você toma a sequência que você sabe então você usa primers indo na direção contrária, então esses primers PCR amplificam a região de flanqueamento e finalmente você sequência, e você saberá onde ele está. Então é assim que você se identifica, mas o objetivo principal aqui é encontrar, eu vou obter uma ativação específica de tecido? Então isso significa que estou na vizinhança de um potenciador em potencial, então esse é o objetivo disso. Então, estes foram feitos em meados dos anos 80s até o final de 80s. (Consulte O Slide Time: 26:25) Então o próximo é a mesma coisa mas ajuda você a determinar, como por exemplo se você conhece um enhancer, e então você quer descobrir o que são todos os diferentes lugares, onde aquele enhador funciona, Então você pode fazer repórteres sob o controle de enhancer e olhar para ele. Então, este é um método de assay mais antigo onde é o LacZ, e então você vê sua expressão para principalmente em você conhece o sistema nervoso central aqui e expressão muscular específica. E aqui, o que você está vendo é lente cristalina ’ s enhancer, e você vê onde ela está expressa, então esta é imagem eu particularmente gosto porque ela mostra o controle específico de tecido tão claramente. Por isso, há muitas coisas dessas ontem no laboratório tivemos algumas imagens em que o gene ’ s GFP é expresso apenas nos núcleos de um determinado conjunto de células ao longo do comprimento do verme. Então, o verme tem algo chamado de seam, uma estrutura horizontal proporcionando reforço estrutural para o corpo. E isso é composto de 16 pares de células, e este gene em particular é expresso apenas naquelas 16 células; o resto das 959 células são todas escuras, e só estas são verdes brilhantes. Então, já era tarde demais, então eu não fiz uma foto que pudesse ser mostrada aqui hoje. Então, mas isso está fazendo o mesmo trabalho para você vê-lo apenas na lente não mesmo no resto do olho. Porque você não quer cristalão expresso em outro lugar, você quer apenas na lente. Por isso, agora, você está recebendo uma ideia do que é expressão gênica diferenciada. (Consulte O Tempo De Deslizamento: 28:09) Então agora, deixe o ’ ver as aplicações do enhancer. Então, eles são benéos em dois contextos diferentes. Vamos ver dois vários exemplos. Um deles é, ele é frequentemente usado no mouse onde você deseja ter um nocaute condicional. Digamos que um gene tem um papel crucial na fase de clivagem do embrião, e se você simplesmente bater nele e criar um alelo nulo, então ele vai ser letal embrionário. Imagine que o gene tinha uma função no fígado, e você quer saber especificamente o que ele faz no fígado; você nunca vai saber disso. Por isso, portanto, quando as pessoas querem encontrar a função de tecido específico ou orgão específico de um gene, eles querem ter nocautes condicionais, significando exclusão condicional. Nocaute é um nome novo, basicamente, o que se diz é a exclusão de um gene, é o que os não geneticistas inicialmente chamaram de nocaute. Agora os geneticistas também o usam, então algumas pessoas chamam de nocaute, e então as pessoas dizem knockdown, um esgotamento parcial que chamam de knockdown. Eu só não gosto dessa palavra porque isso não transmite o significado; não diz o que o esgotamento conta. E, similarmente, bater-em significado de inserção de transgene. Então agora estamos olhando para nocaute condicional, significando que não estamos excluindo isso no núcleo zigótico, nós vamos nocautear em um determinado tecido somático. Então, como você faz isso? Como os aprimorancers ajudam? Então agora você tem uma estirpe de rato, onde você tem uma recombinase bacteriófago. Então, eu vou falar um pouco sobre o bacteriófago. Não tenho certeza de quantos de vocês aprenderam o ciclo de vida bacteriófago. Alguém aprendeu lambda phage lysogeny e ciclos líticos? O que o bacteriófago faz para a sua vivência? Como eles sobrevivem? Assim, eles se integram à célula hospedeira e, em seguida, quando as condições favoráveis vêm, eles podem fazer várias cópias e sair da célula hospedeira. Eles fazem isso usando a recombinação de site-specific, e isso é explorado aqui porque se eu digo recombinase e se você não sabia o que é recombinase então não adianta ir em frente. Portanto, o Cre é uma tal recombinase, então você expressa essa proteína neste exemplo particular sob o controle de um realçador para albumina. Então, você tem uma estirpe de rato que tem Cre recombinase sob a albumina enhancer como um transgene. Assim, ele será expresso apenas no fígado onde a albumina será produzida; só que lá será produzido Cre recombinase. Agora você tem outra cepa do mouse onde o seu gene de interesse, por exemplo, neste caso, o fator de transcrição HNF4 alfa, seu exon 2 é flanqueado pela sequência reconhecida pela Cre recombinase. Então é assim que funciona a recombinação de site-specific. Por isso, o site para o Cre é chamado de bacteriófago p1, e que se chama sites de loxp. Então, o site de loxp flancos exon 2, normalmente as pessoas chamam de floxed, flanqueadas por lox so floxed. Então, você flutuar o gene de interesse este exon 2 não vai ser removido nessa estirpe em qualquer lugar porque não há recombinase geralmente no mouse que reconhecerá o loxp. Então, isso vai ser saudável, e simplesmente expressar a Cre recombinase no fígado não vai causar nenhum problema para essa estirpe porque ele vai funcionar apenas se houver um loxp; caso contrário, você está produzindo uma proteína que não é tóxica nem ter qualquer interferência funcional. Mas se você cruzar esses dois camundongo e gerar um mutante duplo, o mouse que carrega os dois em seu fígado, você terá ambos os elementos funcionais reunidos. Você terá Cre recombinase produzida porque todo o realçador de albumina faz com que ele se expresse apenas no fígado e em nenhum outro lugar e também você precisa lembrar que este é o floxing germline. Por isso, nesta cepa do rato, o genoma de todas as células terá essa sequência. Já conhecemos equivalência genoma e isso não importa. Somente no fígado onde você tem o Cre recombinase o site da loxp será reconhecido e ele irá tratá-lo como genoma bacteriófago e ele irá consumir o consumo. E então você não terá exon 2, então isso é um nocaute condicional. Então, é assim que as pessoas usam aprimorancers. Então agora em um clube de jornal ou um seminário, se alguém diz nocaute condicional e eu flutuei esse gene, você imediatamente entende o que é, por isso é essencial saber disso. (Consulte O Tempo De Deslizamento: 34:04) E o segundo é usado principalmente em Drosophila. Ainda assim, é convincente e eles vieram com isso por muito tempo atrás. Somente recentemente, as pessoas têm feito com sucesso em C. elegans, provavelmente quando as pessoas não encontraram um contexto crítico onde precisavam ou preguiçosas para desenvolver uma ferramenta ou o que fosse. Mas recentemente eles mostraram que funciona, mas em Drosophila isso tem sido muito bem explorado, e você sabe que este um exemplo é bom o suficiente para entender o quão poderoso isso é. Então, este é o sistema GAL4-UAS muito semelhante em princípio ao anterior. Você terá duas cepas diferentes; aqui uma estirpe está sob o realçador de um disco imaginal particular. Não sei quantos de vocês sabem o que é disco imaginal, portanto, disc imaginal volta para a metamorfose. Já que a Drosophila é um inseto, tem uma fase de lagarta-parecida com isso; a mosca sai, por isso há metamorfose. Por isso, naquele estágio de minhocão, ele tem o primórdio para todos os estágios adultos, e estes primordiais são chamados de discos imaginais. Por isso, asa primordiais significam disco imaginal de asa, significando as células primordiais que estão presentes na lagarta que acabará sendo expandida para asa no adulto e assim estes são os discos imaginais. Você usa esse aprimorador para controlar a expressão de um fator de transcrição de levedura GAL4. Por isso, o GAL4 novamente tem uma sequência curta particular que é usada para reconhecer e ativar a transcrição. Então, você tem aquele fator de transcrição produzido em uma estirpe de Drosophila sob esse realçador específico de discologia imaginal. Agora você tem outra estirpe onde você tem o upstream do seu gene de interesse, ou o gene em si é um transgene, por exemplo, Pax6. Você está tirando do sistema de mamíferos e colocando-o aqui, então você tenta expressar isso sob o controle do promotor onde GAL4 se liga. Então, isso é chamado de sequência ativadora de upstream, portanto, UAS. Por isso, o UAS aqui é GAL4-UAS, e isso é para Pax6, e no outro, vamos dizer disc imaginal específico do olho. Então agora, quando você cruza os dois e faça um mutante duplo, você vai produzir proteína pax6, onde geralmente, isso irá conduzir a expressão GAL4. Por isso, neste caso específico, não é o olho; é outra estrutura no tórax ou na região da cabeça onde ao conduzir pax-6, eles foram capazes de induzir a formação do olho no lugar da antena. Por isso, o que ele te diz aqui é pax-6 age como um mestre regulador do desenvolvimento dos olhos. Então uma vez que você fornece pax-6, então parece que todo o resto já está lá naquele tecido específico para conduzir a formação do olho. Assim, veremos similar uma formação de órgão tão completa no lugar errado em mais exemplos mais adiante conforme a gente passa. Um bom grupo de genes chamados genes HOX ou as mutações homeóticas onde você tem um órgão substituído por outro órgão simplesmente porque você mudou o regulador master lá. Então, ele te dá versatilidade como, por exemplo, eu posso ter essa linha, e cruzá-la com outra linha onde o UAS para outro gene está presente. Dá essa flexibilidade, então eu posso ter uma biblioteca como um conjunto de gene do driver, e conjunto de UAS, então assim, eu posso ter, e então reuni-los juntos, eu posso ativar, então essa é a razão principal. No anterior também é o mesmo, então isso é porque você quer saber em qual disco imaginal; se eu ativar pax-6, eu vou ver esse fenótipo ou em vez disso se eu expressar pax-6 em diferentes discos imagéticos o que acontece? Então, você quer saber duas coisas aqui; uma é o que essa proteína faz se ela é colocada em um contexto biológico particular? Outra é a qual o disco imaginal pode desenvolver que tipo de estruturas. Digamos, por exemplo, ele geralmente forma antena, mas pode fazer olho também se você fornecer um fator de transcrição específico para os olhos. Então, isso tem sido extensivamente explorado pelos biólogos desenvolvimentistas Drosophila você vai encontrar muitos papéis, dificilmente encontrará um papel onde eles não usem este método. (Consulte O Tempo De Deslizamento: 40:15) Certo, para que acabe com isso, mas nós não terminamos. Temos outra palestra que podemos começar, que é uma continuação do mesmo, estamos voltando para a mesma região promotora do pax-6. Então, ajudaria se você se lembrasse disso, estou falando do promoter pax-6. Então, onde a expressão pax-6 e como ela é regulada é o foco. Então, estamos olhando para o seu enhador, e por sua vez, o Pax-6 é um fator de transcrição também, de modo que nós