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Aplicação do PCR

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Aplicação de PCR
Olá todo mundo, este é o Dr. Vishal Trivedi do, Departamento de Biociências e Bioengenharia, IIT Guwahati e hoje vamos discutir sobre a aplicação do PCR. Por isso, longe o que discutimos discutimos sobre os diferentes aspectos relacionados ao PCR como como configurar o PCR, qual é o princípio básico do PCR e depois, na palestra anterior.Também discutimos sobre como projetar os primers e como você pode tomar as precauções e consideração antes de conseguir finalizar uma sequência de primer, que você pode usar para amplificações. Assim, com esse background técnico, agora, gostaríamos de ir em frente e gostaríamos de discutir sobre como você pode ser explorado o PCR como técnica para responder algumas das perguntas e assim como como você pode ser capaz de utilizar o PCR para a compreensão de muitos aspectos relacionados à ciência.(Consulte o Slide Time: 02:01)Então, principalmente o PCR, a aplicação do PCR encontra-se nas 3 categorias diferentes ou poderia ser relacionada a identificações moleculares, ou poderia ser usada para as reações de sequenciamento, ou elapoderia ser usada no caso da engenharia genética o que significa, ele engenheiro genético significa que pode ser usado até mesmo para o propósito de pesquisa. Então, a respeito das identificações moleculares significa; que você está tentando identificar um determinado organismo ou se você está tentando identificar e classificar.Suponha, você isolou um novo organismo então você como você pode ser capaz de categorizar aquele organismo em particular. Então, veja em um mundo tradicional, o que as pessoas estão fazendo é supor que eles identificaram uma nova planta, vão levar essa planta a um taxonomista experiente, e que taxonomista realmente vai se basear na experiência, e com base na similaridade de algumas características taxonômicas, ela realmente vai ser capaz de classificar aquela determinada planta como x e y.Mas na palavra recente, o que as pessoas estão mais tentando entender é que qual é o padrão do presente DNA e se pode ser podemos ser capazes de classificar as plantas e categorizá-las com base no DNA, assim como os produtos de amplificação. Por isso, dessa forma, a identificação molecular está tocando é o lugar onde o PCR está realmente desempenando um papel crucial. Então identificação molecular desempenhá um papel na oncologia molecular, epidemiologia molecular, ecologia, impressão digital de DNA.E ele está sendo usado para a classificação de organismo porque o up você pode ser capaz de amplificar o DNA e então você pode ser capaz de combinar que o DNA com o DNA o que está disponível no banco de dados, e que realmente vai te ajudar a categorizar muito precisamente uma determinada planta ou animal ou até mesmo outras criaturas, então você pode usar o PCR para o genotipagem, diagnóstico pré-natal, roteiros de mutação. Por isso, a triagem de mutação também é um lugar onde você pode ser capaz de fazer um PCR.E ele realmente vai dizer se o tipo particular de mutação tem persistido nesse gene específico ou não. E isso tem uma aplicação muito ampla em termos de diagnósticos porque algumas mutações como por exemplo, se houver uma mutação, e que a mutação está ligada a um determinado tipo de fenótipo da doença, então você pode ser capaz de projetar um PCR e você pode ser capaz de projetar os primers de tal forma que ele realmente vai detectar ou ele só vai te dar o produto Amplificado quando haverá uma mutação.Além disso, se não haverá mutação então não vai dar os produtos amplificados. Então é assim que você pode ser capaz de identificar as mutações em um determinado conjunto de genes e é assim que você pode ser capaz de identificar se uma determinada célula particular está tendo a versão mutatada desse gene específico ou não. Então você também pode usar o, o PCR para descoberta de drogas assim como a correspondência genética e detecção do patógeno.Então, a detecção de patógeno também é área muito importante onde você pode ser capaz de usar o PCR porque uma das principais vantagens do PCR é que ela é muito sensível. Então, mesmo que você tenha um número muito pequeno de cópias disponíveis dentro dos organismos particulares ou dentro do sangue, você pode ser capaz de até mesmo fazer amplificação, você pode aumentar esse número e pode ser capaz de fazer finalidades de identificação.Agora, o segundo é o sequenciamento. Assim, nas reações de sequenciamento, você pode ser capaz de usar o PCR. Por isso, em uma típica reações de sequenciamento, o que você está fazendo é simplesmente pegar nosso DNA o que você está interessado em sequenciar e então você está fazendo um PCR com a ajuda dos primers e que de fato vai dar DNA amplificado e que o DNA amplificado está sendo amplificado de tal forma que ele realmente vai lhe dar os fragmentos de DNA.Por exemplo, se falarmos sobre o método Sanger, o DNA é amplificado com a ajuda dos primers assim como os nucleotídeos modificados, e estes nucleotídeos modificados na verdade vão dar-lhe os pequenos fragmentos e que pequenos fragmentos podem ser usados para identificar a sequência e é assim que você pode ser capaz de obter redução da sequência. Uma vez que você tem a sequência, você pode ser capaz de usar essa sequência e correspondências com o banco de dados.E que para você pode ser capaz de fazer isso na bioinformática similarmente o PCR está sendo usado para clonagem genômica, assim como nos projetos genomas humanos para sequenciamento das múltiplas transcrições ou múltiplos fragmentos de DNA, o que foi produzido a partir das bibliotecas de DNA. Fora isso, na engenharia genética ou nos propósitos de pesquisa, o PCR é amplamente utilizado para 2 finalidades.Um é que eles estão sendo usados para gerar o site direcionado mutagênese, o que significa que você pode ser capaz de gerar muito precisamente a mutação de ponto em um determinado gene. E é assim que você pode ser capaz de responder às perguntas como por exemplo, se existe uma enzima que está realmente tendo um aspartato e que aspartato é muito crucial. Então então você o que você pode fazer é com a ajuda do PCR, você pode ser capaz de fazer é introduzir uma mutação e isso será uma mutação de ponto.E essa mutação de ponto irá substituir o aspartato para alanina ou glicina ou conforme a sua hipótese e conforme a interação desse aspartato com os resíduos vizinhos. E é assim que se pode responder às perguntas que se aquele aspartato particular é crucial para uma determinada atividade ou não, a outra é que o estudo de expressão gênica, assim, com a ajuda do PCR, você pode ser capaz de até mesmo estudar a expressão de seu gene particular.Então, considerando todos esses 3 aspectos diferentes, nós tiramos, agora vamos entrar na parte de aplicação e vamos ocupar a aplicação conforme os diferentes fluxos da ciência por exemplo, a ciência vegetal, a ciência animal e também por isso vamos começar com isso.(Consulte o Tempo do Slide: 08:43)Então, o primeiro o que fizemos foi tomarmos o exemplo do PCR como você pode ser capaz de usar o PCR na ciência alimentar. Por isso, quando você fala sobre a ciência dos alimentos, a ciência alimentar é tudo sobre isso você está falando sobre os vegetais assim como os frutos. Então você como você pode ver nesta foto, nós temos os diferentes tipos de frutas e vegetais. O grande problema comessas frutas e vegetais, o que você pode comprar no mercado ou o que foi produzido na fazenda é que eles estão infectados com os diferentes tipos de organismos patogênicos.E se você consumir que esses vegetais patogênicos ou as frutas, as bactérias ou vírus específicos vão realmente entrar no corpo humano e que como essas frutas e vegetais não são bons para as consumações. Por isso, como você vai saber que o lote particular de frutas ou o vegetal é bom para as consumações humanas. Então, nesse caso, o que você vai fazer é ir fazer o PCR e, por isso, suponhamos que eu esteja interessado em identificar a salmonela é uma bactéria muito perigosa nele realmente causa muita doença em humanos.Então, se você consumir um vegetal que está infectado com salmonela então ela vai realmente causar a toxicidade. Então, o que você vai fazer é se você estiver suspeitando de uma infecção de salmonela, o que você pode fazer é pegar os vegetais e então o que você pode fazer é você pode simplesmente isolar as células. Então, você pode simplesmente esmagar esses vegetais você pode simplesmente fazer um homogeneato e então a partir deste homogenado você pode ser capaz de apenas fazer um PCR com a ajuda dos primers.Esses primers não são nada mais que esses primers na verdade vão ser para salmonela. Então, nesse caso o que vai acontecer é se haverá até mesmo uma minúscula contaminações de salmonela, mesmo que haverá algumas bactérias de salmonela o que está presente nesta determinada planta ou neste particular de vegetais, ele vai realmente dar um DNA amplificado.(Consulte o Tempo do slide: 10:55)Então, vejamos além da salmonela, quais são as outras coisas que você pode ser capaz de detectar em que relacionado à microbiologia alimentar. Por isso, um primeiro é a salmonela está sendo detectada com a ajuda de um gene alvo que é chamado como inVA, e o que você pode fazer é que você pode fazer um qPCR assim como o TaqMan, então você tem várias espécies de salmonela. Assim, a vantagem do PCR é que permite não apenas detectar o tipo particular de bactérias, mas também permite a você uma espécie particular de bactérias.Então, existem para que você realmente consiga identificar primeiramente a salmonela e então você pode ser capaz de usar outro conjunto de primers e que realmente permitirá detectar quais espécies das espécies de salmonela apresentam com o vegetal ou os materiais alimentares. Fora isso, você também vai permitir detectar esta Listeria ou Staphylococcus aureus, Enterobacteriaceae, e coli, bacillus e que total bactérias viáveis. De modo que; também é possível fazer que você realmente pode simplesmente ir se haverá uma infecção bacteriana no vegetal ou na comida ou não. E então há outras opções também.(Consulte o Slide Time: 12:09)Então você está falando sobre o PCR na ciência médica. Por isso, o uso de PCR no caso da ciência médica é muito extenso. E, de fato, quando as pessoas projetaram a tecnologia PCR, projetaram a tecnologia PCR por causa apenas da ciência médica. Assim, no início dos anos 80s quando o povo tentava amplificar os alguns dos genes cruciais, o que é responsável pela anemia celular única e outros tipos de doenças, eles estavam tendo uma tarefa muito difícil.Então foi por isso que eles decidiram que, vamos ter uma técnica para que ela realmente nos permita ampliações e é assim que o PCR está sendo usado. Então, o uso de PCR em ciência médica já começou no ano de 1985. E um teste viável para medir a quantidade de HIV no sangue e que foi publicado em maio de 1987. Assim, na década de 1989, Norm Arnheim e a equipe desenvolveram um PCR multiplex.E amplificação de célula única foi realizada pela primeira vez na célula única espermática para analisar diretamente o produto da recombinação meiótica e também foi aplicada no outro alvo como o antígeno leucócito humano na DQalpha. Assim, a tecnologia PCR tornou-se uma pesquisa essencial e as ferramentas de diagnóstico para melhorar a saúde humana e a qualidade de vida, permite a detecção do organismo infeccioso apenas a partir de 1 célula pela amplificação da região específica do material genético.Então, uma das principais vantagens como eu disse antes, também que a sensibilidade deste método, portanto, porque a sensibilidade é muito alta, pode-se realmente ser capaz de detectar o organismo infeccioso ou a alteração dentro do próprio gene hospedeiro a partir de uma única célula. Por isso a quantidade de DNA o que você vai receber até mesmo da célula única ou quantidade de genoma o que você vai receber até mesmo da célula única que é boa o suficiente para lhe dar os produtos suficientes.O que pode ser analisado tanto para fins de sequenciamento, como se você quiser clonar que você pode ser capaz de cloná-lo em nosso vetor de expressão, você pode estudar muitas coisas. Por isso, é por isso que o PCR é amplamente utilizado no caso da ciência médica também.(Consulte o Tempo de Deslizamento: 14:30)Então o PCR está sendo usado muito extensivamente para detectar a doença infecciosa. Assim, a tecnologia PCR se tornou a base para um amplo espectro de testes de diagnósticos clínicos para várias doenças infecciosas, incluindo vírus e bactérias. Ao contrário da tradicional ferramenta de diagnóstico baseada em anticorpos que depende do paciente para desenvolver o anticorpo ao longo do tempo. O PCR permite o diagnóstico mais rápido que faz o tratamento e a recuperação além de detectar a presença de patógenos.Então, o PCR permite; quantificar a quantidade de patógenos presentes no sangue do paciente e precisar de ajuda para monitorar a progressão de infecção ou resposta ao tratamento, portanto, qual outra doença você pode detectar. Então, esta só não é a extensa lista que esta é apenas uma lista representativa, o que você pode detectar você pode detectar o HIV que causa a AIDS, então você pode detectar o vírus da hepatite B e C que causa a doença hepática e o câncer.Então você pode detectar o vírus do papiloma humano, que pode levar ao câncer de colo do útero, você pode detectar a Chlamydia trachomatis, que causa infertilidade em womens, você pode detectar Neisseria que causa os ambientes da doença inflamatória pélvica e então você pode detectar o citopegalovírus que realmente detecta os pacientes de transplante e o imunocomprometido pessoas como pacientes de Aids. E, então, por último, você também pode detectar a micobacterium tuberculosis que causa a tuberculose nos pacientes.Em geral agora, quando você está procurando a detecção desses organismos patogênicos, tradicionalmente o que as pessoas estavam fazendo, eles simplesmente usam o anticorpo. Então, o que aconteceu é que, quando esses organismos infecciosos estão entrando no corpo, eles estão realmente sendo atuantes como antígenos. Assim, quando o antígeno está entrando no corpo, ele está realmente causando o desenvolvimento do anticorpo, mas neste período, quando o antígeno está entrando no corpo humano e ele está desenvolvendo os anticorpos, é um período muito longo.O que significa, ele levará pelo menos 14 21 dias antes que você possa ser capaz de detectar alguma quantidade de anticorpo e então você pode ser capaz de dizer que este organismo infeccioso específico está presente, mas isso realmente requer uma amplificação muito grande ou a grande multiplicação dos primeiros organismos infecciosos do DNA, então somente o sistema imunológico do corpo ’ passa a reconhecer que e então vai realmente processar aquele antígeno e vai realmente dar-lhe os anticorpos.Então, esta é uma resposta muito atrasada e o que acontece é, nós até que o PCR não foi desenvolvido, o pessoal estava usando esta técnica específica, mas uma grande desvantagem do teste baseado em anticorpos é que ele realmente vai permitir que a doença chegue a um estágio muito sério, o que significa que ele vai ser na verdade até o momento em que você vai detectar a doença no determinado ser humano ou paciente particular.A doença vai ser alcanada a tal nível que ela na verdade é não tratável ou é difícil de tratar. Então, é por isso que as pessoas se deslocaram para o método baseado em PCR porque no método PCR, o que você tem que fazer é, dependendo do local da infecção, por exemplo, se for um fígadoou, sputum ou sangue, você tem que desenhar aquele tipo específico de tecido humano. E aí você tem que simplesmente simplesmente, fazer um homogeneizante.E então você tem que pegar um pequeno, poucos microlitros dessa amostra específica. E isso na verdade é bom o suficiente com a ajuda do PCR, que vai ser específico para esses organismos infecciosos, o que significa como você vai ter um conjunto de primers, que na verdade vai detectar o HIV ou o você vai ter um conjunto de primer que vai ser direcionado de fato a algumas das proteínas clássicas, o que está apresentando a mycobacterium tuberculosis.E isso é bom o suficiente para detectar a micobacterium tuberculosis porque ela está no final você vai ver uma banda, que vai ser específica para a micobacterium tuberculosis. E é assim que com a ajuda das pessoas do PCR cortaram o processo de detecção. Então, é assim que a detecção vai ser muito mais rápida em comparação com o método baseado em anticorpos.(Consulte o Tempo do slide: 19:02)Então, em um método típico de doença infecciosa PCR, por exemplo, este é um exemplo clássico de HIV. Então, o que nós estamos mostrando é que o que você tem que fazer é ter que apenas desenhar de 5 10 ml de sangue. E então a partir do sangue o que você vai obter é o que você tem que fazer é ter que primeiro você tem que isolar os leucócitos, e a partir dos leucócitos, você pode ser capaz de ver diretamente as reações do PCR com a ajuda dos primers o que está sendo direcionado contra o HIV.Então, você pode usar algumas das vias metabólicas do Bessel em enzimas o que está apresentando o HIV como a polimerase de RNA ou algumas das proteínas do código e que na verdade vai permitir ampliações para que você a execute na máquina PCR e então se você analisar esse resultado no gel PCR, o que você vai ver é que somos executar 2 amostras de amostra 1 amostra 2, e a amostra 1 vai dar-lhe um ADN amplificado que é correspondente ao tamanho do ADN.O que foi relatado para aquele determinado gene no dos vírus HIV, ao passo que, a amostra 2 não lhe dá aquele produto amplificado particular, o que significa, a amostra 2 é negativa para o HIV enquanto que, a amostra 1 é positiva para o HIV que significa, que esta amostra para o paciente de amostra 2 é positiva para aquela doença em particular. Então, esse é apenas um exemplo e o diagrama esquemático para mostrar que o que é o protocolo que você tem que seguir por exemplo, no caso da mycobacterium tuberculosis, vai até ser muito simples.Porque então você o que você tem que fazer é ter que simplesmente coletar a sputum desse paciente específico e a partir do sputum você pode ser capaz de simplesmente recuperar a bactéria ou simplesmente você pode simplesmente usar o sputum como tal, e então você pode simplesmente realizar o PCR com a ajuda dos primers e isso é bom o suficiente para lhe dar o produto amplificado se a alguma quantidade de bactérias estiver presente. Por isso, até mesmo visualizar poucas células da bactéria é realmente boa o suficiente para lhe dar um produto amplificado.(Consulte o Tempo do slide: 21:17)Então, o PCR também é usado no exame de sangue. Por isso, a tecnologia PCR ajuda na detecção da presença de doença infecciosa nas amostras de sangue doado. Benefício de uso da tecnologia PCR é monitorar incluir uma diminuição no período de espera durante o qual o agente infeccioso é indetectável pela tecnologia de triagem sorológica que conta com a formação dos anticorpos. A capacidade de realizar triagem de sangue combinada para paciente de vida comum ameaçando paciente e diferentemente da hepatite C e do HIVCombinação do teste baseado em PCR incorpora no sangue durante a importação de tela, aumenta a conscientização e reduz a contaminação das transmissões do vírus. Então, o que acontece é quando na verdade você vai dar o sangue por doações, que o sangue poderia ter potencialmente poderia ter o organismo infeccioso. Por exemplo, você poderia, assim o doador poderia ser infectado com o HIV ou doador poderia ser infectado com a hepatite.Então, há conjunto de organismos infecciosos, que já foram listados que antes de você, coletar o sangue de um doador e antes de dar esse sangue para o aceitador, é preciso realizar a detecção do organismo infeccioso. Assim, na medida em que você tem que realizar o teste para o HIV você tem que realizar o teste para a hepatite e tudo mais, pois estes são o organismo que realmente pode transmitir de uma pessoa para outra pessoa, se você não detectar isso.Então, o PCR é muito vantagens porque você pode simplesmente simplesmente levar um pequeno, poucos microlitros do sangue, e então você pode ser capaz de fazer um PCR e ele realmente vai permitir detectar o HIV assim como a hepatite e todos os outros tipos de organismo infeccioso. A outra vantagem é que em comparação com a outra técnica, como técnicas sorológicas, você pode ter que realizar as reações sorológicas de diferença como reações diferentes para detectar o HIV.Diferentes reações para detecção da hepatite e reação diferente para detecção da micobacterium tuberculosis enquanto que no caso do PCR, você pode ser capaz de misturar todos os primers e pode ser capaz de detectar todo esse organismo infeccioso em um único objetivo considerando que o tamanho do DNA assim como a similaridade das seqüências podem não existir. Assim você pode ser capaz de fazer uma única etapa e detecção de todo o organismo infectocontagiante o que está presente no sangue de um doador.E é assim que você pode ser capaz de muito em segurança, obter o sangue da pessoa doadora e você pode ser capaz de usar aquele sangue com muita garantia de que não vai transmitir qualquer tipo de doença para os aceitadores.(Consulte o Tempo do slide: 24:14)Então o PCR pode ser usado na ciência da planta para que haja diversos campos ou aspectos em que você pode usar a tecnologia PCR para PCR, uma das principais é que você pode ser capaz de usar o PCR para a espécie vegetal identificações por isso a técnica do PCR também foi empregada na identificação das espécies vegetais utilizando a espécie e os primers específicos do grupo visando o membro do DNA do cloroplasto.Que estamos falando do DNA do cloroplasto não o DNA genômico porque o DNA do cloroplasto é algo que continuou da família para a família porque no que diz respeito à planta. por isso o DNA genômico é manter alterando-se com cada recombinação porque se a planta está tendo um macho e fêmea, o macho tem seu próprio genoma a fêmea tem seu próprio genoma e durante a recombinação quando na verdade vão formar o grão de pólen assim como os ovários.O genoma realmente vai passar com o processo de meiose e é assim que vai ser dividido. Então, por exemplo, se você tem que dizer 2 pares de elisa, então por exemplo, A A eB B, ela realmente vai se dividir. Então, vai se dividir em A e A assim. Então, se você for com as coisas genômicas do DNA, você vai realmente ver que haverá uma contaminação onde como se você for com o DNA dos cloroplastos, ele vai ser permanecido constante, pois o cloroplasto no sistema vegetal também o cloroplasto vem do lado feminino.Então, isso de fato continuou sobre as múltiplas gerações e ele não se afete se as coisas estão vindo do lado masculino ou as coisas estão vindo do lado feminino. Esses ensaios permitem a identificação de plantas com base no tamanho os amplicons específicos por exemplo, as plantas pertencentes à mesma família possuem um site de ligação de primer próximo e, portanto, vão dar-lhe o mesmo tamanho de amplicons.Nos testes parentais, o tandem curto repete ou os STRs são usados como marcador onde cada uma das pessoas cópias de DNA contêm 2 cópias desses marcadores, e uma cada uma do pai assim como a mãe. Esses marcadores diferem de comprimento e em algum momento na sequência também. Então, o que se pode ver é que você tem os diferentes tipos de marcadores de DNA como A, B, C, D e E, e todos esses marcadores estão presentes na mãe assim como no pai,Mas uma combinação vai estar presente na criança por exemplo; neste caso, o que se vê é para o marcador de DNA A década de 26 está presente da mãe e 30 está presente do pai, o que significa que a criança vai ser um híbrido do pai e da mãe. Então, é por isso que, embora a mãe esteja tendo 26 e 31 anos, o pai está tendo 29 e 30, as crianças vão ter os 26 e 30 anos. Então, o mesmo é esse tipo de análise que vai permitir identificar o pai.Então, imagine que você tem os múltiplos candidatos que estão alegando que poderiam ser um pai dessa criança em particular. Então então o que você pode fazer é simplesmente fazer a análise dos múltiplos candidatos com a ajuda dos diferentes tipos de marcadores de DNA, e então você pode verificar se isso está combinando ou com a criança ou não. Por isso, outra técnica sensível que pode ser usada para estabelecer a relação materna entre as pessoas é chamada como análise de DNA mitocondrial.O que conta com o PCR esta análise é melhor do que a impressão digital para amostra que se torna muito antiga, que o núcleo das células fica degradado. Por isso, além dessas pessoas também estão usando o DNA mitocondrial porque como eu disse no passado, também o DNA mitocondrial é algo que permaneceu conservado em toda a família. Então, por porque o DNA mitocondrial é o que as pessoas estão tendo, seja ele um macho ou a fêmea está sempre vindo do lado das mães em vez de um lado pai.Então se você analisar o DNA mitocondrial, que não vai ser diluído porque todo o DNA genômico vai ser diluído, em cada mola de fora, como depois de cada geração, você vai ter a metade do seu pai e metade da sua mãe. E mas que o DNA mitocondrial vai ficar intacto. Por isso, se você seguir o DNA mitocondrial muito precisamente, você pode ser capaz de coletar o pedigree daquela família em particular e você pode ser capaz de até identificar o pai assim como as mães.(Consulte o Tempo do slide: 43:14)Então o PCR também é usado com muito sucesso no caso dos aplicativos de pesquisa. Assim, o PCR está sendo usado no caso da clonagem de DNA. Então, o PCR está sendo usado no sequenciamento de DNA, e então você também está sendo usado nos sites baseados em sequência. Ele também está sendo usado na análise filogenética, e também é usado nos estudos de expressão gênica. Assim, no caso da clonagem de DNA, o PCR ajuda a amplificar o DNA específico de um genoma.E o DNA amplificado pode ser inserido em um vetor para transformação e a expressão esta inserção pode ser confirmada ainda mais pelos métodos PCR e, em seguida, o sequenciamento de DNA do PCR avaliam a tarefa para sequenciamento de DNA do paciente com as mutações da doença genética, em seguida, os sites de impostos de sequência. Este é um processo onde o PCR é usado e um indicador se um determinado segmento de um gene ou genoma está presente em um clone em particular.Este aplicativo é vital no mapeamento dos clones cósmicos a serem sequenciados pelos projetos do genoma humano. Em seguida, também foi usado na análise de filogenia. Por isso, a filogenia de organismos como a planta, animais e outros organismos inferiores pode ser rastreada pela análise do DNA. A origem de amostra desconhecida como o osso recuperado de homem precoce também pode ser descartada. O DNA de diferentes organismo também pode ser distinguido.Por exemplo, no caso dos mamíferos, a região conservada como a 3 prime UTR do gene Son pode ser usada para identificar a origem mamífera de uma amostra usando este teste o DNA do humano, gato de macaco, rato de cabra e o DNA hamster foi distinguido. Nos estudos de Expressão de Gene também o PCR pode ser usado para monitorar a expressão desse gene em particular.(Consulte o Tempo do slide: 45:08)Então, em um processo simples, o PCR pode ser usado para reações de clonagem. Então, o que você vai fazer é apenas ir tirar a sequência do genoma com base na sequência do genoma, suponhamos que você esteja interessado em isolar o gene x, o que você vai usar é você vai gerar um primer depara frente, que é para o gene x, e então você vai realmente ter o primer inverso que é para o gene x.E então você vai isolar o genoma e do genoma você vai montar um PCR com a ajuda do primer tão bem quanto o primer reverso e finalmente o que você vai obter, você vai obter o gene x fragmento e este fragmento de gene x vai ter estes os sites de restrição nos dois lados o que significa, esse fragmento de genes do gene x vai ter os sites de restrição em ambas as extremadas e esses sites de restrição podem ser usados para integrar esses genes x em um vetor de sua escolha.Então, você pode digerir o vetor com a ajuda desses armações que são enzimas como por exemplo, R 1 e R 2, e você pode ser capaz de usar esse plasmídeos e então você pode usar este plasmídeo para aplicações downstream como você pode usá-lo para análises de expressão ou você pode usá-lo para as algumas outras questões como se você está interessado em monitorar o replicações e transcripções e traduções.E assim, você pode fazer alguma pesquisa básica também e também pode fazer algum trabalho orientado a aplicativos. Então, trata-se de tudo sobre a aplicação do PCR em diferentes campos da ciência. Então, nós começamos com a ciência da planta e então acabamos com uma ciência forense assim como as aplicações de pesquisa. Então com isso, eu gostaria de concluir minha palestra aqui. Obrigado.