Loading
Nota de Estudos
Study Reminders
Support
Text Version

Set your study reminders

We will email you at these times to remind you to study.
  • Monday

    -

    7am

    +

    Tuesday

    -

    7am

    +

    Wednesday

    -

    7am

    +

    Thursday

    -

    7am

    +

    Friday

    -

    7am

    +

    Saturday

    -

    7am

    +

    Sunday

    -

    7am

    +

Primer Design Hello todo mundo este é o Dr. Vishal Trivedi do departamento de biociência e bioengenharia IIT Guwahati. E na palestra anterior temos discutido sobre PCR. Então, para o que discutimos? Discutimos sobre diferentes aspectos relacionados a PCR como o PCR está sendo desenvolvido e como você pode ser capaz de realizar as reações da cadeia de polimerase e na palestra anterior. Discutimos também sobre alguns aspectos práticos em que mostramos como configurar as reações, como você sabe fazer as misturas de reação.E como realizar o PCR? Como você pode analisar o PCR na eletroforese de gel agro. Então agora em hoje é palestra vamos continuar com a nossa discussão sobre o PCR. Por isso, vamos discutir sobre o PCR.(Consulte o Tempo do slide: 01:50)Assim como você lembra que em nossa palestra anterior vamos discutir sobre a configuração das reações do PCR e em uma reações de PCR você tem os poucos desses componentes como tem o DNA do template então você tem os primers você tem as dNTPs e então você tem a polimerase de DNA taq. Então fora desses componentes os primers que são o componente muito, muito importante e para cada gene alvo você tem que sintetizar um conjunto de primers.(Consulte o Tempo do slide: 02:25)Então o primer é um curto trecho de DNA que serve como ponto de partida para a síntese de DNA em PCR você exige que os dois primers unem-se no cada único DNA encalhado a sequencia de alvo estes são chamados como o atacante, assim como primers reversos. Portanto, se você tem um gene e sabe que o gene é sempre notificado como 5 prime a 3 prime e 3 prime a 5 prime, portanto, o primer que realmente vai se ligar a este lado porque se você se lembra da síntese de DNA está sempre ocorrendo na direção de 5 prime a 3 prime.Então o que vai acontecer é o 5 auge do primer vai se ligar na verdade ao final de 3 do gene de destino. E é assim que isso vai continuar neste sentido. Assim, este primer é chamado como o primer adiante enquanto que o primer que se ligará à vertente inversa é chamado como primer reverso. Assim, isso é chamado como primer reverso, este é chamado como os primers de frente. Então agora a questão vem como você pode ser capaz de projetar o atacante assim como os primers reversos.(Consulte o Tempo do slide: 03:37)Então antes de projetar os primers você tem que considerar muitos parâmetros. E considerando esses parâmetros apenas você pode ser capaz de projetar os primers porque quando você projeta o primer o propósito é que ele realmente deve se ligar ao DNA alvo. E aquele complexo vai ser reconhecido pela polimerase de DNA taq e então ele vai realmente iniciar as etapas de alongamento e é por isso que na verdade ele vai te dar as amplificações completas.Então, quando você sintetiza os primers ou quando você começa a projetar os primers primeira coisa o que você tem que lembrar é sobre um comprimento primer PCR. Por isso, os oligonucleotídeos entre 18 24 bases é o comprimento ideal que é longo o suficiente para a especificidade adequada. E o curta o suficiente para que primer se ligue facilmente ao gabarito na temperatura annealing ao comprimento primer de primers muito curtos como se você tiver um par de 12 16 primers de base.Na verdade vai faltar a especificidade porque existe uma probabilidade de que se você tiver um trecho muito pequeno de DNA ele realmente pode encontrar múltiplas regiões dentro do DNA alvo ou se você for supor usando o DNA genômico adequadamente pode haver uma possibilidade de que o este primer específico possa se ligar a múltiplas localidades e é assim que ele realmente vai dar a você o não um produto desejável mas na verdade vai lhe dê os produtos não específicos ou pode não lhe dar a amplificação de jeito nenhum.Considerando que se você der muito longo trecho de DNA para um trecho de primers como se você pegar um primer de 40 45 nucleotídeos de comprimento que terá um problema de estruturas secundárias primeiro de tudo porque ele é um muito, muito longo para que ele realmente vá formar as estruturas secundárias e é assim que ele na verdade não vai se ligar ao DNA alvo. Segundo que também tem um problema que realmente pode porque uma pequena parte desse primer pode ligar-se aos múltiplos lugares e ela realmente vai dar-lhe a não amplificação ou as aplicações indesejáveis.E é por isso que 18 24 par de base é um comprimento ideal onde você pode ter o comprimento primer. O terceiro ponto é se você estiver usando um primers muito longo ele acaba sendo muito custoso porque a síntese do primer é sempre feita pelas empresas e é assim que realmente pode acabar em você sabe que você pode estar acabando gastando muito dinheiro mas no final não vai servir o objetivo.Porque o que você pode obter de 18 24 exatamente o mesmo ou até pior provavelmente seria possível se você estiver usando os primers nucleotídeos de 40 ou 45 de base par nucleotídeos. Então você tem que considerar também o T m do primer. Portanto, temperaturas de fusão de primer para primers com a temperatura de fusão na faixa de 52-58 graus Celsius geralmente dá os melhores resultados o teor de GC da sequência dá uma indicação justa do primer T m.Os dois primers devem ser emparelados de tal forma que sua diferença de T m não deve ser superior a 2 graus. Caso contrário, resultará na má eficiência annealing como você pode ser capaz de calcular o T m de um primer. Por isso, se você tem um primer que é de menos de 14 nucleotídeos então o que você pode fazer é calcular o T m simplesmente calculando o número de G e C e o número de A e T.Assim T m é equivalente a 4 grau multiplicado por número de G e C no primer mais 2 graus multiplicado pelo número de A e T nos primers. Agora primer a temperatura de fusão é um critério muito importante porque a temperatura de fusão do primer só vai decidir a que temperatura você realmente vai permitir a annealing dessas temperaturas e é assim que o 52-58 graus Celsius é considerado ideal.Se você pegar temperatura muito alta então ele realmente vai ter um problema em termos de annealing. E se você pegar número muito baixo então ele realmente vai annear em vários lugares em sites não específicos. De modo que, assim, vai realmente dar-lhe as multiplicações não específicas. O segundo ponto é que a temperatura de fusão do primer ou o T m de um primer entre os dois primer como o primer avante e primers de ré.Não deve ter uma diferença de mais de 2 grau porque o que vai acontecer é se eu o tiver configurado na temperatura do primer anneal de 54 grau Celsius e um dos primer tem uma temperatura de fusão de 48, o outro está a ter um 56. Então o que vai acontecer é que um 56 vai para a anneal ou porque estamos montando a 54 graus Celsius. Assim, a parede de 56 uma vez vai e se unirá ao ADN alvo ele vai anneal mas 48 graus Celsius annealing T m é porque esta temperatura ainda é maior do que a esta temperatura.Então por causa disso ela não vai annear assim por causa disso não haverá amplificação do seu DNA alvo. Por isso, se você tem um primer inferior a 14 par de base você pode usar esta sequência ou esta fórmula em particular. Mas se você tem um comprimento primer que é mais de 13 nucleotídeo então o que você pode fazer é você pode usar calcular o T m por 64,9 + 41 grau Celsius número de GCs no primer-16,4 / N em que N é o número de nucleotídeos nos primers,Além disso você também tem que considerar que qualquer uma dessas fórmulas você pode usar dependendo do comprimento dos primers para calcular o T m do seu primer e esse valor realmente vai ser próximo entre o atacante assim como o primer inverso. Por isso, é por isso que você tem que projetar o primer de tal forma que ele deve ter um valor de T m muito próximo para que você possa ser capaz de usar muito confortavelmente a temperatura annealing.Para que ambos os primers entrarão de fato e no DNA alvo. Fora que você também exige as temperaturas de annealing primer tão primer temperaturas annealing altas demais temperaturas primer annealing proporcionam hibridização de primer insuficiente resultando em um baixo rendimento de PCR enquanto que o tempo de menor tempo primer de baixa temperatura irá dar a você produtos não específicos causados por um alto número de temperaturas de par de base.E o T m é indiretamente ou diretamente ligado ao T m t a valores ou a temperatura de annealing primer por exemplo como você pode ser capaz de calcular uma temperatura de primer annealing temperatura 0,3 em T m o primer + 0,7 T m do produto -14,9 onde o T m primer é a temperatura de fusão dos primers que são os dois primers. E o produto T m é a temperatura de fusão do produto.Então essa temperatura de annealing primer vai ser deduzida uma vez que você calcule a temperatura de fusão do primer e você pode ser capaz de calcular a temperatura de fusão do template também porque se você der a sequência de template no software ele vai realmente calcular o template derretendo as temperaturas e a temperatura de fusão do primer também. E essa fórmula você pode usar colocá-la nisso a temperatura do primer annealing e é assim que ele realmente vai dar a temperatura annealing. E essa é a temperatura annealing você pode colocá-lo no software para dentro da máquina PCR quando estiver configurando as reações do PCR.(Consulte o Tempo do slide: 11:19)Além disso você também tem que considerar o conteúdo do GC porque a temperatura de fusão de primer bem como a temperatura annealing está dependendo do número de G e C presentes nos primers. E é por isso que o conteúdo da pessoa GC também é muito importante. O número de G e C no primer como porcentagem da base total deve ser entre o 40 60-par de base 60% o que significa que você deve ter uma quantidade muito alta de conteúdo G e C porque se isso realmente fornece a ligação do primer ao template.Porque isso realmente está alinhando a ligação muito forte do primer ao template e que como ele realmente fornece o tempo suficiente para a polimerase de DNA taq se sente nesse complexo de template de primer e é assim que ele realmente suave pode iniciar a síntese enquanto que você o conteúdo do GC é muito baixo o template primer annealing vai ser muito muito fraco porque se você lembra que o G está sempre fazendo 3 par de base com C enquanto que o A está sempre fazendo 2 par de base com T.Então se você tem mais de A e mais do que você sabe AT resequência como por exemplo o que vai acontecer em algum organismo patogênico como a malária você é na verdade o através da hibridização do primer template vai ser muito fraco. Assim, quando a enzima se sentar e tentar você saber sintetizar o DNA pode ser possível que durante esse processo o primer possa realmente desalojar ou o primer esteja ligando para o gabarito mas o interagir a hibridização é muito fraco.Ou daquela coisa ele na verdade acaba por reduzir a eficiência das polimerizações mediadas por enzimas e, finalmente, pode acabar em dar-lhe o produto não específico ou a menor eficiência da enzima. Então você também requer os grampos GC assim como o GC forma um vínculo mais forte do que o AT o número de teores de GC acrescenta que 3 prime do primer não deve ser superior a 3 caso contrário ele resultará em uma ligação apertada não específica em região em que G e C são abundantes.Além disso quando você está projetando um primer você também tem que considerar a formação das estruturas secundárias primárias. Por isso, as estruturas secundárias primárias surgem como resultado de atração intra ou intermolecular entre o primer ou com o primer com o eventualmente reduzir o rendimento de amplificação, uma vez que a disponibilidade de primer único encalhado será limitada para PCR. Os vários tipos das estruturas secundárias primer são as seguintes.Os penteados so penteados são a estrutura de loop formada pela interação intermolecular dentro do primer otimalmente um hairpin de 3 prime extremidade com um delta G de 0,2 kilo calórico por toupeira e um penteado interno com uma energia livre de -3 kilo calórico por toupeira é tolerado geralmente. Por isso, os penteados são como um DNA de dupla encalhada. Por isso, o quando os primers têm a simetria interna ou quando eles estão realmente tendo a simetria eles virão e fecharão juntos.E que como ele realmente vai dar a você o penteado como estruturas como uma parte do DNA realmente vai dobrar. Então este é um único primer encalhado mas ele realmente vai dobrar e ele vai dar um penteado como estrutura. Então, se isso acontecer antes de tudo é realmente vai reduzir o comprimento único encalhado do primer e para que ele seja capaz de ter a interação com o DNA alvo ou o DNA do template.A segunda é porque ela tem um grampo como estrutura. Portanto, se a enzima está sentada aqui e tentando fazer as amplificações ela na verdade não vai passar este penteado em particular e como um resultadoo hairpin vai realmente desalojar o DNA que a polimerase de DNA ou ele não vai permitir que a polimerase de DNA vá para a fase de alongamento, como uma regra do polegar se você tiver um laço de cabelo que tem um delta G de -2 ou -3.Isso é bem tolerado porque você vai ter o hairpin que vai ser formado quando você está colocando os sites de restrição enzimática de restrição no primer e que o site de restrição é sempre palíndromo. De modo que, na verdade, isso vai lhe dar o penteado mas aquele penteado é bom o suficiente para ir ser rompido por um quando você está colocando em uma temperatura onde eles estão indo para anneal mas essa temperatura é boa o suficiente para quebrar esse tipo de interações.Então você vai ter os dimers um dimer primer é uma estrutura formada por uma dupla estrutura encalhada que é formada pela interação intermolecular entre os dois primers se a interação é formada entre o 2 homólogo ou mesmo primer de sentido ela é chamada de auto dimer enquanto que se a interação é formada entre os 2 primers diferentes é chamado como o dimer cruzado otimalmente um 3 prime com um delta G de 5 kilo calórico por toupeira ou um autodimer interno 6 kilo caloria é tolerado geralmente.Então o que é médio por dimer é que você tem isso é o primer número um e este é o seu primer número um. Portanto, se for tanto a sequência é realmente ter o algum tipo de homologia ou simetria então eles vão realmente formar um DNA duplo encalhado o que significa que eles não estão mais disponíveis como um único primor encalhado. E é assim que o propósito de dirigir os primers para a reação vai acabar certo.Então, isso pode ser por causa disso ou poderia ser como um está fazendo um DNA duplo encalhado com o segundo fio que significa um ou fazer par com um ou outro fazendo par com 2 qualquer uma dessas coisas ou pode ser um homodimer ou pode ser um heterodimer ou pode ser um heterodimer qualquer que seja o caso está realmente indo para sub sequestre o single stranded primers mas você não tem que se preocupar com os dimers.Se o Delta G que é a energia livre deste dimer de primer está na faixa de -5 -6 porque isso é bom o suficiente que a energia é ir ser quebrado uma vez que você mantém esse primers em uma temperatura annealingporque isso é bom o suficiente porque quando você calcula a temperatura annealing você vai considerar todos esses parâmetros. E é assim que você manterá a temperatura annealing de tal forma que o primer irá realmente ainda ser capaz de anneal com o gabarito mas não vai ser anneal com a próxima molécula do primer para formar os dimmers.Então você vai ter as repetições e as corridas para repetições são ocorrência constitutiva do di-nucleotídeo enquanto corre são o trecho contínuo um único nucleotídeo estrangulado um número máximo de repetições e run aceito é um 4 di-nucleotídeos ou o par 4 base respectivamente então você tem a homologia do template primer para que o primer deve ser projetado em tal forma que não deve haver homologia dentro do template diferente do site alvo isto resultará em uma ligação e amplificações não específicas.(Consulte o Tempo do slide: 19:18)Então estas são as algumas das estruturas secundárias do primer o que você pode ver estas são as so se você tem esse tipo particular de sequência como esta é um primor de 2 e você pode ter o hairpin loops. Assim você pode ter o like hairpin é formado e este mas você pode ver que este hairpin tem um delta G de 0,16 e que é bom o suficiente quando você realmente vai bater em cima e quando você está trazendo esse parâmetro para temperaturas annealing.Então este é um exemplo do primer dimer onde uma sequência do primer está fazendo uma interação com a segunda seqüência enquanto o que você vê é isso é na verdade um dimers primer não aceitável como neste caso o que você vê é que somente esta região onde apenas os 3 nucleotídeos estão fazendo uma interação com os nucleotídeos presentes na outra sequência e depois descansar todos essas sequências são interação muito fraca.Então, isso de fato vai ser quebrado porque você tem um delta G que é -2,9 enquanto que o que você vê aqui é na verdade uma ligação muito forte de envolver quase 6 7 nucleotídeos e o que se vê é o delta G é muito alto que é como -9,74. Então, é por isso que esse primer quando você está sintetizando esse primer não vai ser útil porque vai ser acabada em te dar os dimmers primer.E é assim que na verdade vai você sabe disso e essa energia livre particular é muito alta. Por isso, na verdade vai dar-lhe as interações não específicas ou este primer não lhe dará a amplificação em nada. Portanto, esta é apenas uma breve visão geral sobre como projetar os primers let so te explicar como utilizar o software ’ s porque quando você quer projetar os primers você pode ser capaz de usar o software ’ s para análise dos múltiplos aspectos como se está formando um penteado se está formando um dimer o que será uma energia livre e tudo isso.Então vocês estão usando tipos diferentes de software's para todos tanto para projetar os primers como para analisar os primers. Então deixe-me levá-lo ao meu laboratório e onde os alunos vão te explicar os diferentes aspectos do primer projetando e como você pode ser capaz de analisar essas sequências para decidir se o seu primer é ruim versus escola primária pura porque isso é muito importante porque o primário é o você sabe a crosta de toda a história se você está projetando um primer ruim você não vai obter a amplificação.Porque isso realmente vai ser você sabe dar o ponto de partida para a sua enzima ir e sentar e iniciar a síntese. Por isso, é por isso que o primer projetando é um aspecto muito, muito crucial e muito, muito importante de entender. Olá a todos, neste vídeo eu mostrarei como projetar os primers e analisá-los.(Consulte o Tempo do slide: 22:19)Então, para projetar primers primeiro você tem que identificar a região de interesse sua região de interesse que você deseja amplificar a partir de qualquer vetor ou qualquer sequência. Então na segunda etapa você ajuda a identificar non cutters há vários softwares disponíveis mas podemos usar New England Biolabs NEB cutter versão 2.O. Após identificar não cortadores você tem que selecionar um vetor adequado no qual deseja integrar esta região amplificada e sites de restrição adequados você obterá locais de restrição adequados de não cortadores após isso você pode ir para projetar primer.(Consulte o tempo de deslizamento: 23:14)Então, para fins de entendimento eu dei esta sequência então eu estou usando esta sequência vou usar esta sequência para projetar os primers e analisar os primers. Portanto, esta é toda a sequência mas eu não quero amplificar a região de espera quero amplificar as letras a sequência que se destaca emverde. Então eu quero amplificar a partir daqui para cá. Por isso, agora a questão surge o que são os não cortadores. Então você quer amplificar essa região e se integrar em outro vetor para isso você tem que identificar quais são as enzimas de restrição não cortante. Então o que eu vou fazer? Vou copiar esta sequência em cortador NEB e identificar o que são os não cortadores.(Video Starts: 24:20)Então eu apenas copie a sequência de sequência aqui e vou me submeter. Assim, analisará a sequência e a fila non cutter estas são as enzimas cortando dentro da sequência. Mas estamos interessados em quais são non cutter então isso significa que você pode ver aqui non cutters. Então, basta clicar aqui. Ele dará número de enzimas que não cortarão dentro da sequência. Então, uma vez conseguindo esta lista temos que identificar em qual vetor você quer integrar sua região amplificada.Então, para esse propósito eu selecionei para fácil compreensão eu selecionei o vetor pET 23a. Então você pode ver isso é aquele mapa vetorial. Portanto, este é o 5 lado prio, este é o terminal 3 prime side N e este é o lado C terminal. N terminal significa primer avançado, C terminal significa primer reverso para que eu possa usar BamH1 em diante primer e Xho1 em primer reverso este são os detalhes. Por isso, identifiquei 2 enzimas de restrição que são BamH1 e Xho1.Então eu posso usar essas enzimas em diante primer e primer reverso. Por isso, depois de identificar enzimas de restrição e o vetor irá para projetar o primer adiante. Então eu vou pegar essa sequência eu quero amplificar daqui para cá. Então eu vou copiar a sequência aqui para projetar para frente primer é muito fácil você tem que tirar a sequência o que quer que você esteja recebendo até 15 20 base você pode tomar como esta.Então, se você quiser inserir uma enzima de restrição suponha que eu queira inserir uma enzima de restrição esta é a sequência como é dada a partir de toda essa sequência então eu quero inserir enzima de restrição que é BamH1. Então esta é a sequência para BamH1 aqui ela corta, então eu posso usar essa sequência aqui. Então esta é a nossa enzima de restrição aqui ela vai cortar. Por isso, não podemos simplesmente fazer fila assim para que haja mais alguma base de base extra temos que adicionar no lado 5.Então eu vou usar então essa sequência eu usarei. Então agora isso é 5 prime para 3 lados prios. Então este é o nosso primer avante está pronto. Por isso, depois de projetar esse primer adiante temos que analisar essa sequência. Então este primer então o que eu farei é apenas copiar esta sequência e usarei o software OligoAnalyzer que é especialmente desenvolvido para este propósito só eu vou colar a sequência só peço analise.Então aqui também você pode ver que há tantas opções estão lá como você pode analisar loops de cabelo, self dimer, hetero dimer. Sendo assim, estes são os detalhes gerais qual é o comprimento e o teor de GC derretendo temperatura, peso molecular. Então estes são detalhes normais eu vou para hairpin loop é lá qualquer loops de hairpin. Por isso, podemos ver que há vários loops de hairpin podemos ver diferentes estruturas diferentes previstas pelo software.Então, se você quiser explorar essa coisa você pode explorar apenas 2 bases, 2 bases que ele está realizando e o valor delta G é -0,43 kilo caloria per mole. Portanto, esta multa até -10 kilo calorias por toupeira é multa. Aqueles loops de cabelo quebrados durante o processo de amplificação mas acima de -10 kilo calórico por mole não podem ser quebrados. Por isso, nesse caso o que faremos ou redesenhamos os primers somos nós vamos adicionar 5% 1% B10 ou 5% é DMS forma estes são esses produtos químicos interrompem esses loops para que a amplificação fique bem.Então, a seguir analisarei para o auto-dimer Existe algum auto dimers e qual é o delta máximo G. Então isto está formando continuamente 5 bases É por causa dos sites de restrição. Portanto, aqueles são site de restrição sobre aqueles homodimers que se formam devido ao site de restrição podem ser quebrados não há questão mas além de que isso também é por causa do site de restrição mas a não ser que temos que olhar com cuidado. Portanto, há alguma vez continuamente 4 ou 5 bases agropecuaristas este homodimer então é muito difícil essas interações podem ser quebradas facilmente.Então aqui estão alguns dos pares de base consecutivos estes são de interação muito fraca para que possam ser quebrados. Por isso, além disso não há um self dimmer significativo. Assim, essa sequência pode ser usada e para heterodimer predicativo heterodimer você precisa de uma sequência complementar com primer reverso reverso que você precisa. Para que discutamos mais tarde então conseguimos o nosso primer avante aqui. Por isso, é muito fácil gerar primer adiante.Mas em caso de primer reverso é um tanto difícil porque não em termos de prever as coisas é um tanto complicado. Então o que eu estou dizendo é aqui nós temos sequência. Então em caso de antecedente primer apenas pegamos um como é sequência 15 20 base como estes de sequências mas aqui temos que tirar sequência de elogios não 3 prime a 5 prime ou 5 prime para 3 prime sequência temos que tirar elogios a esta.Diga que esta é a sequência que conseguimos a partir daqui. Então qual é o elogio a este? Então só eu vou adicionar aqui. Portanto, este é o elogio a esta sequência específica. Por isso, como você pode ver isso é temos que manter dessa direção 5 prime a 3 prime. Então eu vou levar assim para que o que nós temos que fazer é querer inserir um site de restrição aqui. Assim, podemos inserir um site de restrição aqui diretamente. Então em primer reverso quisemos inserir o site Xho1.Então este é o site de restrição como de costume podemos usar o como inserir TAA aqui. Portanto, este é o site de restrição que adicionamos podemos adicionar regiões de flanqueamento em entre uma base de flanagem antes deste site de restrição. Então agora conseguimos nosso primer reverso para que tenhamos que passar por um mesmo procedimento como o que mostrei no caso de encaminhação de 5 primers. Então só eu vou copiar colar aqui e analisar o primer reverso.Então, existe algum grampo de cabelo loops apenas um laço de cabelo que esteja dentro do intervalo da delta G. Então não há problema e autodimer. Por isso, podemos ver aqui continuamente 4 bases estão se formando nesse caso temos que mudar a sequência ou remover as algumas das bases podemos ignorar aquelas restrições aqueles dimers agropecuaristas através de site de restrição. Então próximo heterodimer temos que analisar para heterodimer precisamos de antecedentíssimo primer apenas copiar colar aqui.E calcule que dará Is lá algum heterodimers isso é por causa do site de restrição, isto também é por causa do site de restrição este pode ser quebrado aqueles que estão no final da sequência eles podem ser quebrados mas que é se essas bases são do meio É muito difícil interromper essas interações e a nossa amplificação não será boa. Portanto, não há amplificação literalmente outros tipos de interações serão quebradas facilmente essas são interações rápidas. Assim, é assim que podemos preparar o design os primers e analisar os primers. Fizemos todos esses processos para projetar e inverter primers.(Vídeo Termina: 38:55)(Consulte O Slide Time: 38:56)Mas em vez de fazer manualmente quem pode fazê-lo online basta apresentar a sequência e ela retornará a premissa e a premissa inversa. Estas são algumas das ferramentas disponíveis online para livremente. Mas há ferramentas comerciais também disponíveis como o Olio 7, Vector NTI, premier primer. Portanto, se você está interessado neste software ’ s ou você pode simplesmente passar por esses sites e enviar sua sequência você vai receber seus primers.Então nesta demo em particular os alunos discutiram diferentes aspectos relacionados ao primer projetando e espero que você tenha entendido muitos aspectos em que as precauções o que você tem que tomar e quais são as coisas que você deve evitar enquanto estiver projetando os primers.(Consulte o Tempo do slide: 39:54)Então, é assim que você sabe o exemplo clássico em que eu tenho sintetizado 2 primers no primer inverso assim como os primers de frente. Por isso, quando você quer sintetizar o processo primer adiante o que você tem que fazer é e este é este é um primer o que nós sintetizamos para a clonagem do gene particular. Por isso, os primers de clonagem são diferentes dos primers de sequenciamento. Então no primer de clonagem o que você tem que fazer é a composição é muito importante que você tome poucos nucleotídeos que na verdade vão ser apenas para um site para a enzima sentar.E aí você vai colocar o site de restrição e aí você vai colocar a sequência complementar como a sequência o que foi idêntico ao site inicial como este um direito. Assim, a síntese de primer do nosso primer é muito simples porque você pode simplesmente pegar a sequência de ponta prime você adiciona o lado de restrição deste lado e aí você adiciona mais algumas sequências e isso está pronto para os primers de frente.Considerando que nas primers reversa o que você tem que fazer é ter que apenas pegar essa sequência você faz ele reverter e então você adiciona o inverso os sites de restrição e então você pode ser capaz de adicionar mais algumas sequências. De modo que o vai fornecer o site de acoplamento para a enzima sentar para que porque finalmente o você vai usar esses primers para fazer um gene e então você vai digerir isso com as linhas de restrição.Então essas são essas sequências adicionais o que você está colocando para que os sites de restrição vão se sentar nessa enzima sobre esse determinado alvo como DNA amplificado e poderiam ser capazes de mastigar há várias coisas o que o aluno poderia ter discutido como analisar e como verificar e tudo mais. Então, isso tudo é sobre o primer projetando e como você pode ser capaz de sintetizar ou projetar os primers utilizando os diferentes softwares.E espero que você tenha entendido todo o processo e ele realmente irá ajudá-lo a projetar os primers em seu laboratório. E com isso eu gostaria de concluir minha palestra aqui na segunda palestra subsequente que vamos discutir mais algumas aplicações do PCR. Obrigado.