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Instrumentação Assim, trata-se de um ciclismo térmico típico assim em um ciclista térmico é o instrumento que realiza as amplificações via reações da cadeia de polimerase o dispositivo possui um bloco térmico. Então você o que você vê é que você tem um bloco térmico e esses blocos térmicos estão realmente tendo os furos em que você pode conseguir manter o seu eppendorf ou os tubos PCR e esta é a unidade de controle onde você pode ser capaz de configurar essas reações de PCR e você pode ser capaz de configurar a desnaturação inicial.Então desnaturação, alongamentos, annealing e tudo mais e você pode alterar todos esses parâmetros, este é o bloco de aquecimento que na verdade foi usado uma vez que você vai colocar a amostra aqui então você pode fechar este led e seu bloco de aquecimento superior vai realmente chegar a 100 graus celsius. Para que, na verdade, vá parar a evaporação da amostra porque o que vai acontecer é que uma vez que os tubos vão ser inseridos no bloco de amostra, ele vai realmente ser aquecer.Porque 76 graus celsius ou 94 graus celsius ou 95 graus celsius so durante esse período, o líquido o que está presente no eppendorf vai evaporar e se esse líquido evaporar vai chegar ao cap daquela eppendorf em particular. Portanto, se você não tiver nenhum mecanismo, então, que não deve fazer que toda a sua mistura de reação não vai estar presente neste bloco específico ele realmente estará presente no topo do cap.Porque se você ver eppendorf você tem o eppendorf e este é o boné realmente assim, se você manter a mistura de reação aqui o que vai acontecer é, vai evaporar e eventualmente toda a mistura de reação vai mesmo se acumular aqui em vez de aqui porque este é o lugar o que você está mantendo dentro do bloco. Então, se isso acontecer então o seu eppendorf vai ficar vazio no que diz respeito ao bloco de construção.Então qualquer que seja a temperatura que você mantém não importa e é por isso que as pessoas são na verdade as máquinas estão tendo um bloco de aquecimento para que ele mantenha uma temperatura de 100 graus mas qualquer chance a água não vai chegar no topo do tubo e ela vai se condensar porque isso vai parar de fato as ações. Então, este dispositivo possui um bloco térmico que, realmente se mantém onde tubo segurando a mistura de reação pode ser inserido.O ciclista então levanta e baixe a temperatura do bloco em uma discreta etapas pré-programadas. Então, uma vez que você configurar as coisas ele realmente vai aumentar a temperatura assim como baixar a temperatura.(Consulte o Tempo do slide: 03:56)Então, quais são as coisas que você exige para reações em cadeia de polimerase você requer o DNA do template para que você tenha que ter um DNA de template de 1 picogram para 1 nanogramas, se for um DNA viral ou curto. Se for um 1 nanograma a 1 de micrograma, se for um DNA genômico então você exigia os primers que você exige dos 2 primers one é forward primer e o primer reverso porque como você viu que você tem um fio então vai ser 5 prime a 3 prime e 3 prime para 5 prime so você requer os 2 primers.Então, este é o fio que na verdade vai se ligar ao prime de 3 do seu DNA alvo vai ser chamado como o primer de frente e o estrado o que vai ser ligado à sua outra vertente é chamado de strand reversa. Então você requer o cloreto de magnésio, então o cloreto de magnésio vai fazer um complexo com o ATP e que será no 1,5 2 millimolar para polimerase de DNA Taq.Então você requer os dNTPs ou nucleotídeos de deoxy que na verdade está na faixa de 200 micromoles e então você requer a polimerase de DNA Taq que está nas 0,5 2 unidades por 50 microlitros.(Consulte o Tempo do slide: 05:09)Então, no que diz respeito ao DNA de template, você tem as múltiplas fontes de DNA de template por exemplo, você tem o DNA genômico. Você tem os fragmentos de DNA que você exige que você tenha os plasmídeos, você tem o DNA viral e então você também tem a amostra de tecido viral porque o objetivo final do PCR é amplificar um determinado DNA e é assim que você pode ter as múltiplas reações.Se você se lembra de quando estávamos discutindo sobre a eletroforese em um dos problemas, o que dissemos é que as pessoas descobriram a velha amostra de rocha e eles na verdade estavam com quantidade muito pequena de DNA de um dinossauro e eles estavam realmente interessados em deduzir todos os outros tipos de informação mas isso não foi possível a partir de um pequeno trecho de DNA e é assim que eles ter feito o PCR para amplificar. Então, é por isso que ele realmente usa as múltiplas fontes ou você pode usar o DNA genômico.Você pode usar os fragmentos de DNA como por exemplo esses fragmentos de DNA poderiam estar presentes nos ensanguentos como por exemplo, se você se pessoas descobriram ou você sabe isolou um sangue de um local do crime e eles querem identificar o sangue a pessoa a quem o sangue está sendo contaminado ou a pessoa a quem o sangue é pertencimento. Aí eles podem o que podem fazer é só podem isolar o DNA desse sangue em particular.E eles podem fazer o PCR para identificar se esse DNA em particular é pertencente a essa pessoa em particular ou não mesmo é verdade para os plasmídeos. Por exemplo, em alguns casos se você tiver gerado plasmídeos recombinantes você pode ser capaz de verificar com a ajuda dos primers PCR. Então você pode usar uma amostra de tecido por exemplo, se uma pessoa tiver o por exemplo se você descobriu uma amostra de tecido de um paciente com câncer ou suponha que alguma amostra de tecido esteja presente a partir da hepatite.E você quer saber se o vírus da hepatite está presente ou não então nesses casos o que você pode fazer é simplesmente simplesmente isolar o DNA daquelas amostras de hepatite e então você pode fazer o PCR para o vírus específico. Da mesma forma você pode fazer uma amostra viral em si por exemplo se você tiver uma amostra viral e quiser identificar o vírus. Então você pode fazer o PCR e assim dependendo do gabarito você tem que pegar a quantidade por exemplo se for um viral ou o pequeno DNA você pode levar o up to the nanogram level mas se for um DNA maior então você tem que levá-lo em um nível de micrograma(Consulte o Tempo do slide: 07:40)Então você exige que os primers so primer seja um DNA curto, estrado que servem como ponto de partida para a síntese de DNA em PCR. Você exigia os 2 primers que realmente vão se ligar ao único DNA encalhado para exigido um primer de frente, assim como um primor reverso. Por isso, eles primer têm uma sequência que é complementar à sequência no DNA de template onde eles devem iniciar a síntese. Por isso, os primers projetando assim como análises primer de como projetar os bons primers de qualquer maneira vamos discutir mais adiante.Então os primers são como as vertentes complementares e o que se pode ver é que um prime de 5 a 3 prime se este é o template DNA. Então o que você pode fazer é simplesmente pegar o pequeno trecho deste DNA e que na verdade vai servir como primer para a frente e se você pegar esse alongamento, ele realmente vai te dar os primers reversos. Então, primers reversos realmente vão para as direções inverídica da cadeia de síntese, enquanto que um, primer adiante vai para as mesmas direções.(Consulte o Tempo do slide: 08:52)Então você requer as enzimas assim, você pode ter os diferentes tipos de enzimas que normalmente começaram com a polimerase de DNA Taq. Por isso, a polimerase de DNA Taq é isolada do Thermus aquaticus, que é microbe encontrada nos 170 graus celsius Fahrenheit hot springs in the Yellow Stone National Forest. Por isso, a polimerase de DNA Taq ou o DNA Taq é uma polimerase de DNA estável em uma temperatura elevada e ela atua na presença de magnésio. A temperatura ideal para a polimerase de DNA Taq é de 72 graus celsius.(Consulte o Tempo de deslizamento: 09:28)A polimerase de DNA Taq carece da atividade de proofleitura de 3 prime a 5 prime exonuclease proofreading e por isso é realmente comumente encontrada em outras polimerases. Então o que aconteceu é que quando você tem a atividade de 3 a 5 prime exonuclease, ela realmente é uma atividade de proofleitura. Por exemplo quando você está lendo uma frase você pode realmente fazer uma proofleitura você pode realmente pedir a outra pessoa para fazer uma proofleitura por exemplo se você está escrevendo um manuscrito e você pode pedir a alguém para fazer uma proofleitura.Então, o que o outro cara vai fazer é realmente vai ler seus artigos de forma semelhante as muitas enzimas têm as atividades de proofleitura. Portanto, neste caso é uma atividade de 3 prime a 5 prime proofreading o que significa que a enzima realmente volta e confira se adicionei os nucleotídeos corretos ou não por exemplo, se você tem um fio se tem um A no template e então a enzima vai mesmo adicionar o T porque são os nucleotídeos complementares.Mas o que vai acontecer é supor que você tem o C mas antes de ir para o G irá de fato voltar 1 nucleotídeos de volta e então verificará novamente se o T está sendo apegado a A A ou não e é isso que ele realmente continua fazendo e que é o que é chamada como atividade de proofleitura. Por exemplo por acaso se adicionou o C por exemplo em vez de T ele adicionou o C.Então o que é a enzima vai fazer é se ele voltar e verificar que não é T é C na verdade então a enzima vai primeiro corrigir o erro e então só ele vai continuar. Por isso, é por isso que a atividade de proofleitura é muito importante se você deseja sintetizar um DNA sem erros nisso por causa disso a base da Taq mis-incorporar 1 está em cada 10 para ligar a 4 bases que significa se você tem um de base par destino.Ele realmente vai ter um erro 33% da molécula após o ciclo 20 o que significa se você tiver um par de 400 de base o DNA alvo 33% das moléculas o que se vai sintetizar depois de 20 ciclos vai realmente ter algum erro se você estiver usando a polimerase de DNA Taq o que significa a esse erro vai ser distribuído ao longo da sequência porque vai ser random.Então em alguma sequência o erro está sendo incorporado a um nucleotídeo de 10 as décimas posições em alguns lugares são as 100 posições em alguns. Então o que quer dizer é que se você tem um fio como este e você está realmente começou a gerar o você sabe as mutações porque onde quer que você tenha o A e se colocar o C na verdade vai estar mudando a sequência porque a sequência da sua filha agora está sendo alterada.Então, uma vez que a nova sequência vai ser gerada, o DNA vai adicionar o G em vez de C na verdade porque este vai ser um template mais adiante. Então isso vai realmente geraro DNA errôneo que de fato vai não ser a cópia idêntica porque o objetivo final do PCR é fornecer a você a cópia idêntica mas ela vai te dar o DNA com mutações que na verdade vai ser alteração das bases.(Consulte o Tempo do slide: 13:02)Então qual é o remédio para isso? O remédio é que você pode usar as algumas enzimas novas e uma das novas enzimas o que você pode usar é uma polimerase de DNA Pfu, que é do Pyrococcus furiosus e que realmente possui a atividade de proofleitura de 3 prime a 5 prime exonuclease proofreading que significa esta enzima se você usar ele realmente vai voltar e verificar se ele adicionou o nucleotídeo direito ou não.A taxa de erro é de apenas 3,5% se você lembrar da taxa de erro foi 33% no caso da polimerase de DNA Taq mas aqui a taxa de erro é de apenas 3,5% após os 20 ciclos. O único problema é que ele requer mais quantidades de primers porque e se você fizer isso realmente vai começar a produzir os dimers primer so para genes inexplorados, o primer usado em espécies estreitamente relacionadas são usados.(Consulte o Tempo do slide: 13:59)Agora como configurar as reações do PCR, então o que você exige é necessário o DNA do template conforme o requisito se for um DNA genômico ele deve estar na faixa de micrograma. Se for um DNA curto como plasmídeos ou vírus então você tem que levar os primers como primers de frente assim como o primer inverso então você requer o cloreto de magnésio. Você requer que os dNTPs você exibem os buffers de polimerase de DNA Taq e água, a sequência em que você vai adicionar todos estes é muito simples.Você tem que primeiro pegar a água então você tem que adicionar o buffer e então você vai adicionar o template então você vai adicionar o cloreto de magnésio então você vai adicionar os dNTPs. Aí você vai realmente adicionar os primers e então por último você vai realmente adicionar as enzimas em alguns casos o que as pessoas também fazem é realmente fazer um mestrado mix utilizando todos esses e depois eles adicionam os diferentes modelos.Então, se suponha que você tenha modelos diferentes e queira usar então o que você pode fazer é apenas excluir os primers assim como o template faça a aliquota do mestrado e depois você adicionar o template assim como os primers e então é só colocá-lo nas máquinas PCR e é assim que ele realmente vai fazer o PCR.(Video Starts: 15:28)Neste vídeo vamos estar demonstrando como configurar uma reação de PCR e analisar os resultados utilizando eletroforese de gel de agarose. A reação em cadeia de PCR ou polimerase é uma amplamente utilizada em técnicas de biologia molecular para amplificar um determinado segmento de DNA. Ela também está implícita na pesquisa biomédica e na medicina forense. A principal aplicação desta cadeia de polimerasereação é clonagem para configurar uma reação de PCR precisamos de template DNA, primers específicos do site, dNTPs mix, água livre de núcleos.E polimerase de Taq para uma reação de 50 microlitros em uma concentração típica de 10 100 nanogramas de uso de DNA de template e 5 picomoles de cada primer serão usados. Trata-se de uma versão anterior do ciclista térmico que contém unidade de exibição onde podemos observar os parâmetros e alterar os parâmetros. Este é o escudo quente este é detentor de amostra e por dentro há um sistema peltier.O qual pode manter as flutuações de temperatura para configuração de uma reação de PCR em desnaturação inicial em 95 graus, celsius 3 minutes e esta etapa, usaremos 30 repetições onde a desnaturação inicial será 30 seconds e annealing it. O tempo de extensões deve ser dado 1 minute por kb e aqui a extensão final deve ser dada 10 minutes e prendê-lo 4 graus Celsius 10 minutes.(Vídeo Termina: 19:23)(Consulte O Tempo Do Slide: 19:24)E então você tem que fazer a configuração das reações otimização também você tem que fazer para que haja diversos lugares onde você pode fazer a otimização por exemplo no interior dos ciclos de reação. No estágio 2 você pode ser capaz de otimizar simplesmente olhando para a temperatura annealing assim como a temperatura de extensão porque a temperatura annealing vai realmente permitir a annealing do primer para os templates.Então, essa etapa é muito crucial se você pegar se manter a temperatura annealing muito baixa ela realmente vai gerar um DNAs não específico se você manter a temperatura annealing tambémalta. Na verdade não vai se ligar ao gabarito e por isso mesmo vai dar sem produtos além disso, em alguns casos as pessoas também fazem hot start como por exemplo se você se lembra do que estávamos discutindo que na verdade você sabe que vai fazer tudo isso e então você vai mantê-lo em reações.Mas o que aconteceu é mesmo durante a qual você conhece a temperatura ambiente quando estamos fazendo todas essas reações e mesmo se você está fazendo isso no grau de 4. Alguns produtos iniciais estão sendo formados e uma vez que os produtos iniciais estão sendo formados ele realmente vai interferir em suas amplificações. Assim, se, haverá quaisquer produtos não específicos, que estão sendo produzidos e então ela vai realmente afetar a sua produtividade geral.Porque, em última análise, é uma reação em cadeia de PCR ou polimerase; onde, a quantidade de seu produto final bem como a precisão dessa sequência é muito importante. Então, se você realmente vai adicionar as reações e vai mantê-lo no bloco se o bloco normalmente leva algum tempo para ele se aquecer mas durante esse processo, alguns dos não específicos que você conhece produto vai ser formado.E isso vai começar a comer as suas enzimas primers e toda aquela maquinaria e por causa disso a produção geral vai ser cada vez menor e por outro lado vai de fato dar-lhe o produto não específico. Então, o que as pessoas fazem em hot start é que mantenham o ciclo funcionando e depois deixam a máquina chegar a uma temperatura de 100 graus celsius ou 95 graus celsius uma vez que a máquina alcance essa temperatura particular.Então eles mantêm as reações na máquina então eles realmente colocam a reação que é o que realmente chamou de hot start porque você está começando a reação ou você está incubando as reações apenas quando está nas condições quentes. Fora que você também pode jogar muito com os primers porque primers são a crosta ou você sabe o grande gargalo se você não está conseguindo o produto amplificado ele poderia ser por causa do você conhece primers.Porque o primer o que você está sintetizando pode ter vários problemas. Então, tudo isso de qualquer maneira nós vamos discutir então enzimas de qualquer maneira nós já discutimos que se você está recebendo as mutações, então você pode usar polimerase de DNA de Pfu em vez da polimerase de DNA Taq. E então você também tem os alguns aditivos como você pode usar o DMSOvocê pode usar o betaine e todo esse tipo de aditivos para que ele possa de fato quebrar as estruturas secundárias.(Consulte o Tempo do slide: 22:43)Agora você pode fazer otimizações para que você o que é a otimização se você supor não ver nenhum produto ou se você não ver um produto do seu tamanho correto. Por isso, quando você inicia um PCR você normalmente sabe que qual produto eu deveria esperar por exemplo, se eu estou esperando um produto de 1,3 kB se estou obtendo 0,6 kb amplificação que significa que eu não estou conseguindo o produto certo. Então, o que você tem que fazer é nesse caso, primeiro você tem que fazer é você deve verificar a qualidade do DNA do template o que significa seu DNA de template você reduz a temperatura annealing.Porque essa pode ser a razão de que o primer não é ligação para a temperatura annealing o primer não é ligação para o DNA alvo, você aumenta o cloreto de magnésio assim, que ele vai realmente fornecer a energia para o sistema e, portanto, ele está realmente pedindo a polimerase de DNA Taq para trabalhar de forma mais eficiente você pode adicionar o DMSO assim como o betaine que na verdade vai afetar a estrutura secundária do primers e que realmente também ir a você sabe ajudar em termos de obter a síntese.Você pode usá-los outros em enzimas termosíveis ou afinal se nada funcionar então você pode realmente lançar seus primers existentes e você pode realmente síntese o novo primer porque o que acontece é algum tempo em que os primers estão sendo fornecidos e você está montando as reações primers são o DNA único encalhado. Por isso, esses únicos DNA encalhados são muito suscetíveis para DNases.Então, se você tiver algum tipo de degradação desses DNA, ele na verdade vai afetar as amplificações gerais. Em segunda condição é que se você tem os produtos extras como se você está esperando 1,3 kb mas em vez disso você também está recebendo mais poucos produtos nesse caso. Você aumenta as temperaturas annealing você reduz o cloreto de magnésio e você reduz o número de ciclos.E você tenta outra enzima você experimenta a enzima que na verdade está tendo a alta fidelidade que significa a enzima que está tendo que vai proporcionar mais especificidade. Assim, nesse caso a enzima vai ser específica para sua sequência de destino específica em comparação com a sequência de destino não específica e ou seja, como você pode ser capaz de eliminar essas bandas não específicas.(Consulte o Tempo do slide: 25:01)Então você tem que analisar a reação do PCR então uma vez que um ciclo de PCR é completo, o produto amplificado é carregado em gel de agarose e observado após o brometo de eidium com a fonte de luz UV uma reação em branco de água também é adicionada. Então, que você pode ser capaz de monitorar se haverá uma questão não específica. Então, em vez de adicionar um template você também pode adicionar a água.Então, que você vai saber que tipo de amplificação você vai obter se haverá apenas água presente e idealmente o que você faz é correr com o marcador de 1 kb. Então, este é o marcador de DNA é uma amplificação negativa, onde você adicionou a água e esta são as aplicações positivas em que você realmente vai receber a banda única. Então, este é o DNA amplificadodo seu interesse e então você pode ser capaz de calcular se estou obtendo o tamanho desejado ou não.Então por exemplo neste caso eu estou recebendo uma banda de 1,3 kb para que seja uma banda desejável e o que você vai ver é que está recebendo um dimmer de primers porque os primers não estão sendo usados na reação negativa, então é por isso que estão sendo apresentados nas reações. Portanto, trata-se de tudo sobre o PCR e como configurar o PCR e preparamos uma demo muito pequena para mostrar como configurar as reações do PCR como fazer a análise das misturas e como fazer a análise dos produtos e nesta demo em particular os alunos discutiram diferentes etapas relacionadas ao PCR.(Consulte o Tempo do slide: 26:28)Agora quais são as vantagens do PCR so que é um processo rápido é fácil de executar o que significa que é realmente muito fácil você pode simplesmente pegar os modelos e você mistura todas essas receitas em um tipo de ordem particular e depois é só colocar na máquina e que na verdade vai te dar o produto desejado é muito sensível o que significa se você pode modular você realmente vai obter os resultados desejáveis.E ele é muito robusto o que significa que realmente vai te dar os resultados reproduzíveis então se você tiver a mesma sequência de primers, você tem o mesmo gabarito e tem a mesma enzima. Na verdade é muito, muito robusto será continuar dando os resultados e é por isso que você pode ser capaz de usar o primer para muitas aplicações como você pode usá-lo para diagnósticos e tudo isso porque ele é muito robusto para que realmente vá dar os resultados desejáveis.(Consulte o Tempo do slide: 27:22)Quais são as limitações do PCR? A limitação do PCR é que ele exige do alvo a necessidade de uma sequência das informações de destino como você tem que projetar um primer. Por isso, até que você não tenha a sequência de destino, é muito difícil para o primer projetar. Então você exige a fidelidade da replicação do DNA so que a polimerase de DNA Taq é um DNA de baixa fidelidade. Por isso, na verdade não vai dar-lhe uma amplificação suficiente e o erro vai ser em torno de 40%.Então, vai-se realmente a ele ser bom para os pequenos trechos de ADN mas não é bom para os longos períodos de ADN e depois o PCR ter uma limitação em termos do you know amplificação dos diferentes tamanhos de ADN até 5 kb DNA pode ser facilmente amplificado com a ajuda do PCR. Mas se você for além dos 5 kb como até 40 kb ainda o DNA pode ser amplificado com algumas modificações.Mas se você for além disso não pode ser capaz de amplificar o gene que é de 100 kb o que significa que ele está realmente tendo as limitações e essa limitação está realmente causando muito problema porque você não pode usar o PCR para sequenciar os genomas e não é possível utilizar esse PCR para aquele aplicativo específico. Por isso, é por isso que o PCR tem sido sempre limitado a esses aplicativos onde você tem um trecho muito pequeno de DNA e como por exemplo 1 kb, 2kb para que ele realmente vá te dar os produtos amplificados.Então, isso tudo é sobre as reações da cadeia de polimerase e discutimos sobre os diferentes tipos de aspectos técnicos, como configurar as reações e quais são os diferentes parâmetrosvocê deve considerar enquanto está montando o PCR e no final nós também vamos mostrar a você uma demo que realmente vamos mostrar a você todos os passos que você vai fazer e com isso eu gostaria de concluir meu palestra aqui. Obrigado.