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Amplificação do DNA

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Amplificação do DNA


Olá pessoal, este é o Dr. Vishal Trivedi do departamento de biociência e bioengenharia IIT Guwahati e hoje vamos começar um novo módulo e o nosso novo módulo vai lidar com as ferramentas de biologia molecular. Por isso, as ferramentas de biologia molecular normalmente lidam com as moléculas que são importantes para o sustento ou para a manutenção da vida. Então, existem 4 moléculas principais que são importantes para manter a vida um seu DNA, o segundo é o RNA, o terceiro é proteína e o quarto são os lipídios.
Por isso, a biologia molecular normalmente lida com toda a macromolécula especialmente o DNA, RNA e proteínas. Por isso, quando falamos de um DNA é que o DNA é amplificado com uma técnica conhecida como reações em cadeia de polimerase.
(Consulte O Tempo De Deslizamento: 01:56) Então, o, como o nome sugere, a reação da cadeia de polimerase é uma técnica que é usada para amplificar muitas moléculas de DNA duplo-estranguladas com o mesmo tamanho idêntico e a sequência pelo método enzimático e pelas condições cíclicas. O que significa é que você tem DNA original, que é o DNA original e este DNA original está sendo amplificado para múltiplos ciclos.
E é assim que você realmente vai ter as cópias múltiplas como você tem as 4 cópias múltiplas que na verdade vão ser idênticas.
O que significa que a sequência dos todos esses fragmentos vão ser idênticos à sequência original e também eles vão ser amplificados com a ajuda das enzimas. Então, se você quer entender o processo de reações da cadeia de polimerase, você tem que entender os 2 componentes básicos. Um, você tem que entender sobre o DNA. O segundo que você tem que entender sobre a maquinaria enzimática, o que é importante para amplificar o DNA?
Então, vamos começar com a compreensão do DNA primeiro e depois vamos entender sobre o maquinário e depois posteriormente vamos entender como as pessoas também desenvolveram a técnica e então também vamos entender todos os aspectos técnicos relacionados às reações de mudança de polimerase.
(Consulte O Tempo De Deslizamento: 03:27) Então, o DNA é um ácido nucléico e que é composto pelos 2 núcleos de ligação de nucleotídeos compatíveis com as cadeias que significa em um DNA típico, você tem o 2chains, um é o 5 prime a 3 prime e o 3 prime a 5 prime. Ambas são essas vertentes estão conectadas pelos nucleotídeos que estão presentes no interior e os nucleotídeos são compostos por um grupo de fosfato, 5 de açúcar de carbono e uma base de nitrogênio.
Então, como você sabe que quando a base está somando com o açúcar, ela está realmente formando o nucleosídeo. E quando o nucleosídeo está sendo preso com o fosfato, ele é chamado como nucleotídeo. Por isso, o DNA é feito de fora dos nucleotídeos. Então, é na verdade uma molécula macro onde você tem a cadeia de 1 dos nucleotídeos conectados a outra cadeia de nucleotídeos e essas 2 novas cadeias dos nucleotídeos são elogiadas umas às outras.
(Consulte O Slide Time: 04:47) Então, o DNA tem as 4 bases de nitrogênio, você tem as 2 purinas como as 2 bases ringadas como adenina e guanina. E aí você tem as 2 pirimidinas como citosina e timina. Estas 2, 4 bases estão ligadas em um padrão repetido por ligação de hidrogênio entre as bases de nitrogênio. A vinculação das 2 vertentes de cortesia é chamada de hibridização. Então, A está fazendo um par com T e G está sempre fazendo par com C.
Então, o que se vê é que o A está fazendo par com T com a ajuda da ligação de hidrogênio 2 enquanto que o G está fazendo a nossa ligação de hidrogênio com C com a ajuda da ligação de hidrogênio 3 que significa, a força da interação A a T é mais fraca em comparação com a interação de G a C.
(Consulte O Tempo De Deslizamento: 05:46)
E porque o A está fazendo par com T e G está fazendo par com C, o DNA é elogioso na natureza. O que se quer dizer com cortesia na natureza é que se você tem uma primeira sequência que é chamada como a vertente primária então você pode ser capaz de deduzir a sequência de cortesia. Por exemplo, neste caso, temos uma sequência primária que é o GGC TAT GTG e o que se vê é que onde quer que você tenha o G está realmente tendo um C em um encalhamentos de cortesia.
Então, essa é que é a forma como ela realmente vai manter a complementaridade. Como a complementaridade vai te ajudar em termos do que você sabe vem conservando as moléculas porque, se você tem o fio 1, pode ser capaz de gerar o fio 2, pois o fio 1 é elogiável um ao outro ou se você tem o fio 2, pode ser capaz de gerar um fio 1 e esse é o princípio básico ao qual o mecanismo PCR está funcionando.
Por exemplo, se eu tiver essa sequência particular e se eu quiser sintetizar a vertente 2 o que eu posso fazer é simplesmente anexar uma curta bases de nucleotídeo e então eu posso simplesmente colocar maquininha T e que maquinário vai realmente sintetizar as sequências de cortesia que significa, eu estou procurando um maquinário que realmente possa reconhecer essa sequência de DNA e então que maquinaria poderia ser capaz de entender que o DNA é elogiável na natureza.
Então, o que vai acontecer é que, se eu tiver essa sequência, o maquinário vai se sentar nessa sequência e aí vai realmente aceitar o nucleotídeo a partir do que você vai abastece e aí vai, na verdade, sintetizar a vertente de cortesia. E uma vez que chega até o final da sequência, saberá que agora, a síntese acabou. Então, ele realmente vai se rescindir. Por isso, agora, até agora o que discutimos discutimos sobre a molécula que realmente vai ser amplificada durante as reações da cadeia de polimerase.
E agora, o que vamos entender que vamos entender sobre o maquinário para o maquinário de síntese de DNA é a base da vida na terra ou o maquinário de síntese de DNA é muito crucial para duplicar o DNA.
(Consulte O Tempo De Deslizamento: 08:23)
E a síntese de DNA está ligada à divisão celular assim como ao crescimento. Portanto, este é um exemplo da bactéria. Então, o que se vê é que temos a bactéria que na verdade está tendo uma única cópia genoma do gene. E o que vai acontecer é que o primeiro evento em si é que o genoma de fato vai duplicar em 2 exemplares. Então, em última análise vai ter 2 exemplares do genoma e então ele realmente vai ser dividido por longitudinalmente e é assim que você realmente vai ter as 2 colônias bacterianas.
Da mesma forma, para no procariote, ele tem os múltiplos eventos através dos quais ele realmente passa e então ele realmente vai ser dividido em 2 e que todos os eventos estão realmente sendo chamados como o ciclo celular. O que são esses eventos? Você tem um G1. Então, no G1, você realmente vai aumentar a quantidade de citosol e você realmente vai preparar a célula para a fase de síntese e então você está realmente entrando em uma fase de síntese.
Assim, na fase de síntese ou na fase S, você realmente vai fazer uma síntese de DNA o que significa que você vai fazer uma primeira cópia do DNA e vai sintetizar a segunda cópia do DNA que significa agora o DNA vai ser duplicado o que significa agora você vai ter os 2 genomas. Assim como nesta etapa e agora vai entrar na fase G2. O G2 também é estágio preparativo.
Então, aqui também haverá alguns estágios preparativos adicionais. E então a célula entrará na fase mitótica. E nesta fase, a célula vai se dividir em 2. Assim, a célula original volta a passar com o ciclo celular enquanto que, na verdade, vai dar mais 1 cópia da célula. Para isso se você realmente bloquear a síntese do DNA, se você bloquear esta etapa, você realmente vai interromper o ciclo celular. E é assim que se vai, na verdade, parar a multiplicação assim como o crescimento de célula particular.
(Consulte O Tempo De Deslizamento: 10:37) Então, processo de duplicação de todo o genoma anterior à divisão celular. Assim, a replicação do DNA é um processo que ocorre na célula anterior à duplicação das células. E isso ocorre dentro da S-fase. Por isso, tem um significado biológico de que a replicação do DNA é um processo muito preciso. E requer, a fim de preservar a integridade do genoma em uma geração sucessiva que significa se você realmente vai gerar as mutações.
Ou se você está começar a gerar as modulações dentro da sequência do genoma, o que obteve da célula original, acaba por continuar alterando as sequências de DNA e que na verdade não vai ficar sabendo, carregar as mesmas informações porque a grande função do ADN é carregar as informações genéticas. De modo que ela realmente vai permitir que as células da filha continuem executando o tipo similar de metabolismo.
Então, por isso é importante que a replicação do DNA seja precisa. De modo que deve produzir a cópia idêntica a fim de preservar a sequência do DNA assim como deve preservar a integridade do genoma. E isso deve continuar por várias gerações. Nos eucariontes, a replicação só ocorreu durante a fase S do ciclo celular. A taxa de replicação em um eucariote é mais lenta resultando em uma maior precisão de fidelidade de replicação em eucariontes.
(Consulte O Slide Time: 12:15) Agora, a replicação do DNA está tendo as várias características. Por exemplo, a replicação do DNA é semi conservadora o que significa que a replicação do DNA vai ser semi conservadora significa quando você realmente vai sintetizar por exemplo, se este for o fio 2 e 2, ele na verdade vai te dar os 4 exemplares de 4 fios. Mas neste estrado de 4, os 1 e 2 vão ser separados e os 3 e 4 vão mesmo ser sintetizados.
Então, a nova vertente, o que é sintetizado vai realmente fazer par com as vertentes originais e esse processo é chamado como os modos semi-conservadores. Então, este são os anos 1 e 2 estão realmente vindo dos pais enquanto que os anos 3 e 4 são, na verdade, as estirpes recém-sintetizadas. Isso significa que a informação o que você tem no DNA original vai ser dividida em 2.
E é por isso que não vai ser conservador o que significa que não vai fazer a dupla como 1, 2 e 3, 4. Na verdade vai fazer um par como 1 e 3 e 2 e 4.
Esse é, na verdade, um modo semi-conservador de replicações. Se você quer estudar mais sobre ou se está interessado em estudar mais sobre como as pessoas descobriram o modo semi-conservador, você pode facilmente passar por algum livro de biologia molecular e pode ler sobre os alguns do experimento clássico o que foi projetado e como as pessoas descobriram que a replicação do DNA é semi conservadora na natureza. Ele começa na origem da replicação.
Para a síntese do DNA não se inicia em locais aleatórios, ele requer um lugar onde realmente pode começar de modo que o lugar seja chamado como a origem das replicações. Na célula bacteriana, você tem a origem única da replicação enquanto que na célula eucariótica, você tem os múltiplos lugares da origem das replicações porque o genoma bacteriano é menor na natureza. Então, ele na verdade não requer a origem múltipla de replicações em comparação com a de que os genomas eucarióticos são maiores em tamanho.
Assim, eles exigem a origem múltipla da replicação. Para que o; aplicativo possa começar em vários lugares. E é assim que na verdade pode ser capaz de completar as replicações em um determinado cronograma. Porque você sabe que a replicação é importante para fazer uma segunda cópia do genoma. Para que a célula entre na fase G2 e M e é assim que ela realmente vai se dividir e dar-lhe mais o número de células.
Então, é por isso que a e como fase é realmente o gargalo de todo o processo e que por isso a replicação do DNA tem que estar em síncrona com o mitótico assim como a fase G2. A síntese de DNA pela polimerase de DNA sempre ocorre na direção que é chamada como a 5 prime para 3 direções principais. Então, você sabe que aquele DNA é na verdade um polímero dos nucleotídeos e nucleotídeos tem 2 vertentes como 5 prime e 3 prime.
Então, se eu desenhar uma estrutura típica de nucleotídeos, o que você vai ver é que isso é na verdade um açúcar então esta é a base. Então, por exemplo, eu coloquei A e aqui você tem o açúcar e neste quarto carbono, você tem o quinto carbono e então você tem o CH2 e então você tem o grupo fosfato. Então, este é na verdade o final de 5 e este é o final de 3 porque aqui você tem o OH. Não, este é o final prime de 3 e este é o 2 prime end. Então, este é na verdade você vai ter OH e isso é OH, o que você pode realmente ser capaz de usar.
Então, se a síntese de DNA está ocorrendo, na verdade é utilizando-se este 5 prime OH ou o 3 prime OH o que significa que é por isso que, o DNA tem uma direcionalidade que realmente vai de 5 prime a 3 prime e 3 prime a 5 prime porque esta é a vertente de cortesia. Então, a síntese de DNA sempre ocorre em uma direção que é chamada como a 5 prime a 3 prime o que significa que realmente vai começar a síntese na vertente, a vertente que está tendo as 3 pontas prime.
E é assim que vai, na verdade, sintetizar nesse sentido porque as sentenças vão estar na direção. Pode ser unidirecional ou bi direcional o que significa que pode ser nesse sentido ou pode ser em ambas as direções simultaneamente. É um semi descontínuo. Por exemplo, portanto, semi-descontínuo significa que vai mesmo continuar por algum tempo e depois vai mesmo parar e depois vai voltar a continuar por isso e é por isso que vai realmente criar os 2 tipos diferentes de vertentes.
1 é chamado como a vertente principal, o outro 1 é chamado como o fio de atraso. Então, este é o fio que é chamado que está realmente sintetizando o DNA nas etapas múltiplas é chamado como o strand retardado enquanto que a vertente que se inicia a partir de uma extremidade e vai continua assim é chamada como a vertente de ponta. E para qualquer processo de replicação do DNA, você requer um primer e esse primer é sintetizado por uma enzima que é chamada como primer de RNA. Os primers de RNA e os primers que são usados na replicação do DNA são feitos em off do RNA e este foi sintetizado pela polimerase de RNA.
(Consulte O Tempo De Deslizamento: 18:01) A replicação do DNA tem 3 etapas. Tem como iniciação. Por isso, na iniciação o DNA vai ser preparado para a síntese. O que se quer dizer com a iniciação é que na etapa de iniciação a proteína se ligará ao DNA. Então, você sabe, o DNA é uma estrutura helicoômica dupla. Então, essa estrutura helicoidal dupla primeiro tem que ser hétero, então, que você primeiro você tem que remover a helicidade desse DNA em particular. Então, você vai primeiro gerar o DNA como o DNA duplo encalhado e então você tem que quebrar de fato as 2 vertentes separadamente.
Então, que na verdade vai estar pronto para aceitar essas coisas é maquinário e é isso que os eventos estão acontecendo quando de fato estão indo para os estados de iniciação. Nos estados de iniciação, a proteína se ligará ao DNA e, em seguida, haverá uma abertura de DNA de dupla hélice. Então, que na verdade vai ser um único DNA encalhado. Então, o DNA encalhado único vai ser gerado no estágio de iniciação então você tem os passos de alongamento.
Assim, nas etapas de alongamento, o maquinário de DNA vai ser definido para isso e assim como sobre este e depois vai-se começar a adicionar os nucleotídeos e é assim que vai começar a síntese das segundas vertentes. Assim, nos passos de alongamento a proteína conectará a sequência correta do nucleotídeo em novas vertentes contínuas de DNA. E uma vez que o maquinário de DNA vai ser alcançado para os cantos como o fim da sequência, ele vai mesmo parar a síntese.
E é isso que o terceiro passo que é o terceiro passo é a rescisão que na verdade vai parar a síntese do DNA. E uma vez que a síntese do DNA acaba, o DNA tem que voltar a recuperar a sua forma original e é esse o passo que é necessário se você uma vez você antes de fazer a finalização o que significa uma vez que a síntese acabou, o DNA primeiro vai ser convertido em uma estrutura helicodica dupla e depois a partir da estrutura de padrão duplo, é preciso gerar uma estrutura helicoodupla de helicotipação.
Então, é por isso que a síntese de DNA é um processo muito, bem controlado onde você primeiro tem que fazer a iniciação, onde você o DNA tem que ser invadindo as 2 vertentes diferentes e então as 2 vertentes diferentes vão ser você sabe ocupado pelo maquinário de síntese de DNA e o que o maquinário de síntese de DNA vai fazer? Por isso, o maquinário de síntese de DNA envolve as polimerases de DNA que realmente vão se sentar sobre a enzima.
E então eles vão realmente ler a sequência original e com base na sequência original, eles na verdade vão adicionar os nucleotídeos na segunda vertente e é assim que ele vai mesmo começar a síntese da segunda vertente e uma vez que eles chegam até o final, é isso que a fase de alongamento e uma vez que eles chegam até o final da sequência, eles na verdade vão começar as etapas de finalização. Então, uma vez que a síntese acabar, ela realmente vai gerar o DNA duplo padrão e então o DNA duplo padrão vai realmente ser cojado e então vai gerar as estruturas helicoíticas.
(Consulte O Tempo De Deslizamento: 21:20) Existem diferentes enzimas o que está envolvido neste processo de replicação do DNA. Então, você exige os helicases que realmente vão separar as 2 vertentes diferentes. Então você exige a primazia que na verdade é nossa polimerase de RNA. Então, na verdade ele vai ser exigido para fazer uma síntese dos primers do RNA. Em seguida, você exige que as proteínas de DNA isoladas únicas. Por isso, proteínas de DNA encalhado simples vão, na verdade, se unir às 2 vertentes como esta, para que elas não venham juntas e novamente as reannetas.
E é assim que vai, na verdade, manter o DNA padrão único. Depois você exige a polimerase de DNA que na verdade vai fazer uma síntese de nova vertente e então você exigia a proteína de tethering que realmente vai estabilizar as polimerases sobre as vertentes.
(Consulte O Tempo De Deslizamento: 22:10) Então, a síntese de DNA tem os 3 passos. 1 é chamada como a iniciação que na verdade vai preparar o DNA para a síntese. Então, o que você está fazendo, você está realmente pegando um DNA e então você está realmente gerando as 2 vertentes então nas etapas de alongamento, estamos fazendo a síntese de DNA. Por isso, uma vez que suas 2 vertentes estão prontas, então o que você pode fazer é realmente você vai levar e adicionar os primers. Por isso, neste caso os primers de RNA e assim, os dois primers vão ficar sentados e aí você vai adicionar as enzimas.
Por isso, a enzima vai ser sentar-se a essas vertentes. E é assim que na verdade vai começar a síntese e uma vez a finalização, para que você possa parar a síntese do DNA. Então, o que vai acontecer ele vai, uma vez que chegará a esse ponto, que a enzima vai mesmo cair das vertentes e que na verdade vai completar a síntese do DNA e vai entrar nas terminações. Então agora o que se vê é que esses são os processos o que fazemos sob a síntese do DNA.
E o que acontece dentro da célula pode ser imita mesmo fora da cela porque todos esses eventos podem ser controlados mesmo por sem passar por você conhece algumas das enzimas o que você exige. Por exemplo, você requer as helicases, de modo que ela realmente vai gerar o DNA único encalhado e é assim que ele realmente vai fazer o suficiente e então você requer a única proteína de ligação de DNA padrão único.
De modo que o DNA estranhará o que foi gerado pelas helicases permanecerá como o único encalhado. Para esses 2 processos podem ser simplesmente feitos por se você aquecer essas vertentes particulares. Por isso, se você aquecer esta vertente em particular, o que vai acontecer é que o DNA duplo padrão vai ser aberto nos modelos de single encalhados. E é assim que você pode ser capaz de utilizá-los. Agora na fase de alongamentos, o que você pode fazer é simplesmente adicionar os pequenos alongamentos de sequências de DNA, que na verdade vai ser chamado como primer.
E é assim que é e então você pode adicionar a enzima. Então, é assim que você realmente vai iniciar o processo de síntese. E uma vez que chega até o final, na verdade vai ser uma queda do gabarito e, portanto, ele vai mesmo acabar nas terminações. Por isso, manter esses eventos e perceber que esses eventos podem ser feitos sob as condições do invitro. As pessoas conceituaram o processo de reação da cadeia de polimerase e foi assim que eles realmente começaram a desenvolver a técnica. Mas há múltiplas etapas e múltiplas fases em que as reações da cadeia de polimerase são desenvolvidas.
(Consulte O Tempo De Deslizamento: 25:08) Então, há vários eventos o que as pessoas fizeram até mesmo para desenvolver o PCR para o. Por isso, em 1950s pessoas descobriram como a replicação do DNA está acontecendo e isso está sendo feito pelo Arthur Kornberg e ele descobriu a primeira polimerase de DNA e outros fatores como helicase in e Primers. Por isso, em 1950s quando o Arthur Kornberg realmente descobriu as polimerases de DNA assim como o mecanismo de replicações de DNA e de helicases e primasas, é assim que as pessoas sabem que o DNA é realmente replicado.
E requer uma enzima e há uma enzima. Mas qual é o problema? O problema é a polimerase de DNA o que foi descoberto por Arthur Kornberg é na verdade a temperatura sensível o que significa que não é possível suportar uma temperatura muito alta. E você sabe, que, como eu disse no no último slide em si, que quando você quer imitar essas condições sob as condições do invitro, a única maneira que você pode conseguir escapar dos helicases e de todas as outras proteínas é que você pode realmente esquentar o DNA.
Para que o DNA entre nas 2 vertentes e essas 2 vertentes permaneça como um único padrão só se estranhará se você manter a temperatura altíssima. Mas uma vez que você traz a temperatura alta, a enzima, o que foi relatado pelo Dr. Kornberg realmente vai ser inativado. E é por isso que nada aconteceu até que em 1976 as pessoas descobriram a primeira polimerase de DNA termosível do thermo aquaticus e que a polimerase de ADN do thermo é chamada de polimerase de DNA taq e que a polimerase de DNA taq é muito, estável.
Pode ser resistir à temperatura de 95 graus Celsius o que significa que você pode ser capaz de usar essa enzima em várias rodadas. E você não precisa, você sabe, você não precisa adicionar a enzima em, você sabe, para cada ciclo você tem que continuar. Em seguida, em 1983, Kary mullis sintetiza que o DNA oligo sonha para anemia de células de foice. E então com 1983 anos, ele só fez o ciclismo térmico repetido foi usado pela primeira vez para clonar um pequeno segmento de DNA genoma.
E então em 1984, os Kary mullis e Tom white tentaram o experimento de design para testar PCR sobre o DNA genômico mas o produto amplificado não era visível no agarose. Em seguida, em 1985, foi depositada a primeira patente para a sua aplicação em relação à detecção das mutações da anemia de células de foice. E a década de 1985, o primeiro uso de polimerase de DNA termosível em PCR foi iniciado de apenas 2 enzimas, a polimerase de DNA taq, conhecida na época em que o taq foi encontrado mais adequado para o PCR.
E 1985 1987 pessoas descobriram muito sobre os diferentes tipos de instrumentos e por isso há muitas descobertas e desenvolvimento mais tarde com a ajuda das instrumentações.
(Consulte O Tempo De Deslizamento: 28:29) Então o que basicamente as pessoas estão fazendo em uma reação em cadeia de polimerase. Assim, PCR é uma reação de ciclismo repetida que envolve o mecanismo de replicações de DNA. Ele resulta na produção de múltiplas cópias de DNA de um único 1, todo o processo envolve 3 eventos, um é chamado de desnaturação, annealing e os alongamentos. Então o que acontece assim como você pode imaginar que começou com cópia original do DNA de dupla encalhada.
Então, sob a desnaturação, quando você aqueceu a amostra a 95 grau Celsius, o que vai acontecer é que as 2 vertentes da cópia original vão ser separadas e ela vai dar-lhe as 2 vertentes. Agora o que você vai fazer é você vai entrar na fase annealing onde você realmente vai diminuir a temperatura. Então, que os primers vão comprar e aí você realmente vai ter os primers.
Por isso, na verdade ele vai adicionar os primers e é assim que ele realmente vai anexar o primer em 1 final deste DNA assim como o final de 1 deste DNA. E então a enzima entrará na fase de alongamento. E a enzima vai realmente utilizar esse pequeno DNA primer e é assim que ele realmente vai sintetizar toda a vertente e é assim que você vai realmente obter o DNA duplo encalhado no final.
Então, isso na verdade é que vai constituir o primeiro ciclo ou o primeiro ciclo. Depois do primeiro ciclo, desde que você começou com o DNA de 1, na verdade você vai conseguir 2 DNA. Mas como você pode ver, na verdade é um semiconservador, o que significa que a vertente de 1 é do DNA original. E a segunda vertente é a vertente de DNA recém sintetizada. Agora, você pode imaginar que a mesma coisa aconteceu no segundo ciclo.
Mas agora, este também é que estas 2 vertentes também vão servir como gabarito. E é assim que você vai realmente obter os 4 exemplares e no terceiro ciclo, você vai obter as 8 cópias o que significa um fragmento de DNA de interesse é usado como um modelo a partir do qual um par de primer ou short oligonucleotídeo compatível com ambos a vertente dupla do DNA são feitos para prime a síntese de DNA onde a direção de síntese ou a extensão é 5 prime a 3 prime como foi no caso de replicações de DNA o número de DNA amplificado.
Ou as amplicons aumentam exponencialmente por ciclo por exemplo, se você começar com a molécula de DNA de 1, após o primeiro ciclo, ele vai ser para o DNA, após o segundo ciclo vai ser de 4, após o terceiro ciclo vai ser 8. Então, se você continuar que ela está realmente continuando como este ciclo como assim. Então, na verdade é dobrar depois de cada ciclo e é assim que na verdade vai dar uma amplificação muito alta até mesmo da molécula de 1.
Então, se você imaginar que se eu começava com 1 micrograma de DNA, na verdade vai ser vários microgramas de DNA e até mesmo dentro desse 20, 25 ciclos. Assim, a quantidade de DNA amplificada você pode ser capaz de calcular simplesmente colocando esta fórmula que é a C é igual a C0 1 mais E para a potência n onde o C é a quantidade final de DNA, C0 é a quantidade inicial de DNA, E é a eficiência e n é o número de ciclos e S é a inclinação da fase exponencial e que você pode ser capaz de calcular a partir dessas equações em particular.
Então, você pode ver que a reação da cadeia de polimerase realmente utiliza o conceito similar o que está acontecendo no decorrer das replicações do DNA mas em vez de utilizar os múltiplos fatores e tais mecanismos complicados, o que você está fazendo é simplesmente aquecer as reações, você está fazendo as 2 vertentes, então você está adicionando os primers, o que significa que o pequeno DNA se estende e então você está pedindo para enzima utilizar esses primers para sintetizar e então uma vez que a síntese está acabou, então novamente você está trazendo a temperatura de volta e continuando o mesmo ciclo e é assim que você está realmente fazendo a várias reações.
(Consulte O Tempo De Deslizamento: 32:58) Assim, a reação em cadeia de polimerase requer os eventos de 4. Portanto, se você configurar as reações da cadeia de polimerase, você requer a desnaturação inicial o que significa que você tem que aquecer a mistura PCR em 94 até 10 minutes grau para 10 minutes para denir completamente o DNA do template. Então, quando você vai começar as reações do PCR, você tem que primeiro trazer as reações e então você vai primeiro fazer a desnaturação inicial em que você realmente vai esquentar a mistura em 95 grau Celsius por 5 10 minutes.
E aí você realmente vai entrar no estágio 2 onde vai esquentar novamente o gabarito por 30 seconds 45 seconds. E isso na verdade vai ser nossos passos de desnaturação. Assim, nas etapas de desnaturação, este é o primeiro passo em que o DNA duplo encalhado vai ser de denatura para formar o DNA padrão único de 2, aquecendo o DNA em 95 graus Celsius por 15 30 seconds. Agora, você vai diminuir a temperatura.
Então, isso vai ser passos annealing. Assim na etapa de annealing, esta é a etapa annealing onde a temperatura mais baixa como 50 65 grau Celsius, os primers são permitidos ligar para o template DNA e o tempo de link é de 15 30 seconds e ele depende do comprimento e das bases dos primers. Então o que você vai fazer é você é você tem abaixado a temperatura para que os primers que realmente estão flutuando e que são pequenos trechos de DNA agora vão e se unam ao seu DNA elogioso presente no gabarito.
E agora, a enzima reconhecerá este complexo D em particular e é assim que a enzima iniciará a síntese. Assim, após a annealing ela entrará na fase de alongamento. Portanto, esta é a etapa de síntese onde a cadeia de polimerase realizou a síntese da nova vertente nas direções de 5 prime para 3 prime utilizando os primers os dNTPs ou os trifosfatos de nucleotídeos desoxíribo.
E a polimerase média de DNA adiciona cerca de 1000 par de base por minuto o que significa, depois que a annealing acabou e os dimers primer formaram o complexo, você volta a aumentar a temperatura. Para que você garanta que o DNA do template não deve ligar um ao outro e então a enzima virá sentar-se sobre esses complexos e ela realmente vai fazer uma síntese de DNA.
E como um par de base médio de 1000 vai ser sintetizado dentro do minuto em que se você fornecer a quantidade adequada dos nucleotídeos desoxíribo na mistura. Então, etapa 1 e 2, 3 fará 1 ciclo. Portanto, esta etapa através de meios como o passo 1, 2 e 3 está, na verdade, constituindo o primeiro ciclo de 1. E você pode pedir à máquina para continuar o ciclo para outro