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Experimentos De Microscopia
  Olá todo mundo, este é o Dr. Vishal Trivedi do departamento de biociências e bioengenharia IIT Guwahati. E neste módulo estávamos discutindo sobre a biologia celular, assim como estamos discutindo sobre as ferramentas microscópicas que estão disponíveis para executar os diferentes tipos de experimentos. Por isso, agora, na palestra de hoje, vamos discutir sobre os diferentes experimentos o que você pode executar com a ajuda da microscopia. E eu tentei fazer um problema como situações assim, que você vai ser entendida sob qual tal problema você pode ser capaz de utilizar a microscopia. Por isso, comecemos a discussão sobre o experimento diferente o que você pode executar com a ajuda das diferentes técnicas de microscopia. (Consulte O Slide Time: 01:48)Então, nosso problema de pesquisa 1 é muito simples que os cientistas descobriram uma nova fitoquímica bioativa da árvore neem. Então, você conhece a árvore neem e agora, ele quer testar o seu efeito sobre a propagação do parasita da malária. Então, o que ele quer perguntar é que ele realmente isolou um novo fitoquímico bioativo e agora, ele quer testar se está inibindo a propagação do parasita da malária ou não?Então, você sabe que o parasita da malária causou uma doença chamada malária. E se você for com o pouco de fundo, você sabe que o parasita da malária requer os 2 hospedeiros, um é hospedeiro invertebrado e o outro é hospedeiro vertebrado. Assim, em hospedeiro invertebrado, você tem o mosquito que realmente se liga ao outro hospedeiro vertebrado, por exemplo, os humanos, e é assim que ele realmente vai de um corpo a outro corpo. E dentro do hospedeiro invertebrado, eles têm um ciclo de vida completo através do qual os gametas se fundem uns com os outros para produzir o óvulo. E isso é tudo o que eles estão realmente produzindo os merozoítas e depois os merozoítos estão sendo assim, é assim que eles estão produzindo os esporozoítos e esses esporozoítos são realmente injetados pelo mosquito ao ser humano, e esses esporozoítos realmente vão para o fígado. E então ela completa seu ciclo de vida dentro do fígado para gerar os merozoítos e esses merozoítos então infecta o RBC ’ s para formar os diferentes estágios e todos os estágios o que está presente no RBC ’ s são chamados como ciclos de vida dos anopheles. (Consulte O Tempo De Deslizamento: 03:33)Então, dentro do ciclo de vida dos anopheles, você tem os diferentes estágios como eu disse, você sabe, quando os merozoítos estão saindo do fígado, você está recebendo os merozoítos e esses merozoítos estão realmente infectando o RBC ’ s e então está causando está formando a primeira etapa que é chamada como palco do anel. Então, esse é o estágio típico do anel o que você vê depois que logo os mirozoítos entram no RBC ’ s.Então, por que ele é chamado como estágio de anel porque ele está tendo um anel como aparências onde o núcleo está em um canto e então o citosol é distribuído. E então o estágio de anel está se convertendo em estágio trofozoite e então trofozoite está realmente se convertendo nos esquizofricos e os schizonts estão realmente liberando os novos merozoítos e estes novos merozoítos estão novamente infectando o novo RBC ’ s. Assim, se você ver o ciclo de vida, o que se verá é que os merozoítos estão infectando o RBC ’ s e estes RBC ’ s estão então formando o estágio do anel e após as 10 horas o estágio do anel está sendo convertido em estágio trofozoite e então a partir do trofozoite ele está realmente causando a produção dos schizonts. E então a partir dos schizonts ele está realmente novamente liberando o assim, uma vez que o RBC ’ s contendo os schizonts vai buscará-lo na verdade vai liberar esses merozoítos. E então esses merozoítos na verdade vão infectar a nova série de RBC ’ s. Então, o que nós realmente queremos saber é que se nós realmente tratamos o parasita ou se tratamos essa cultura particular com os fitoquímicos, então, se ela realmente vai completar o seu ciclo de vida ou não. (Consulte Slide Time: 05:19)Então, o design experimental é muito simples o design experimental é que você pode realmente levar os parasitas do estágio do anel, e então você incuba isso com os fitoquímicos e você pergunta se ele está inibindo a propagação de ou a transformação do parasita do estágio do anel para atingir os parasitas do estágio de schizonts. Por isso, tipicamente, o que você tem que fazer é ter que apenas primeiro produzir o anel infectado RBC ’ s com a ajuda das sincronizações.E então você incuba isso com a ajuda da concentração crescente das moléculas de fitoquímica ou de teste. E então você incuba isso por algum tempo e depois depois disso você realmente vai fazer uma esmalte depois de 34 horas para ver se o anel está amadurecido para dar-lhe o estágio de schizont, pois sob as circunstâncias normais, ele realmente vai completar o seu ciclo de vida e é assim que, na verdade vai dar-lhe os schizonts dentro das 35 horas. Se você quer estudar as reinvasões, então você volta a fazer uma esmalte depois das 72 horas e isso realmente vai dizer se o seu composto também está tendo um efeito sobre as reinvasões; reinvasão significa, os schizonts vão liberar os merozoites e esses merozoítos estão se infectando o novo RBC ’ s ou não porque é assim que ele realmente vai dar a nova etapa de anel. Você também pode perguntar se o composto é o parasitotático ou o parasicida que significa se o composto está matando o parasita ou se ele está simplesmente parando o crescimento dos parasitas que você pode fazer simplesmente por remoção de drogas. Então, o que você pode fazer é você pode tratar o parasita para as moléculas de drogas ou a molécula de teste por algum tempo, e então depois disso, você realmente pode remover o parasita e mantê-lo na mídia fresca e deixá-los se propagando. Então, se o parasita está morto, não vai se propagando para a mídia fresca, mas se for só, você sabe, parando o seu crescimento, o que significa que ainda está em vida então começará a fazer o crescimento. Então, é isso que você tem que fazer quando você simplesmente remove a droga, você lava a cultura do parasita, e aí você a coloca em uma nova mídia e depois você se prepara a esmiuçar depois das 72 horas. Se você vê os parasitas viáveis, então na verdade vai dizer que composto o que você está testando é o parasitotatico na natureza significa que ele está realmente parando o crescimento do parasita, mas não está matando o parasita. Então, essas são as 3 perguntas que se pode fazer com a ajuda dessa microscopia baseada em ensaios em que quando se pode dizer se o composto está matando o parasita ou não, se o composto está inibindo o evento de reinvasão ou não e se o composto é parasitotatico ou parasicida. (Consulte O Tempo De Deslizamento: 08:13)Então, para realizar esses experimentos, você exige que a mídia como a mídia de cultura de células RPMI 1640, que exigimos para cultura o parasita da malária então você requer o albumax 2 que é realmente um pó que realmente adquire para propagação do parasita da malária, você requer os 0,22 filtros de micron, você requer que as unidades de filtração preparem a mídia que você exige a autoclave, você adquire as bombas de vácuo. E então você exigia microscópio vertical assim, que você pode ser capaz de visualizar os parasitas após os diferentes estágios como se você puder visualizar após 34, 35 horas ou 72 horas ou após a remoção da droga, você pode ser capaz de visualizar o microscópio visualize o parasita com a ajuda dos microscópios upright.  Então, na etapa 5, usando-se que você pode ser capaz de calcular o IC50 que significa a concentração inibitória 50 desse composto. Assim, o número de schizont contendo RBC ’ s foramcontados contra cada concentração os dados de inibição de schizont a partir dos ensaios de inibição de invitro schizont dos compostos acima foram alimentados em uma planilha de excel pré-programada especialmente pré-programada. Então, você pode realmente ser capaz de calcular usando esta folha de excel que esteve disponível a partir deste site em particular. Então, se você colocar todo aquele schizont contendo células e colocá-lo nessa folha de excel particular, você sabe, automaticamente ele vai traçar a curva e ele vai dizer o IC50 assim como o IC90, e todos os outros tipos de parâmetros. Você pode adicionar a cloroquinina como um controle positivo e que de fato vai dar a confiança de que o assay estava funcionando. E não há quem saiba, as falhas ou não há nenhuma questão com a configuração do próprio assay para determinar a natureza da ação, por exemplo, o parasitotático ou parasicida, operação parasitotatica parasicida significa que você tem conhecimento, nosso anel contendo parasita. Então, o que você vai fazer é você adicionar o composto. Então, se você adicionar o composto o que vai acontecer é que ele realmente vai apreender o você sabe o crescimento disso, parasitas particulares. Por isso, se está sedimentando porque o parasita é você sabe não ter nutrição suficiente e no seu saber o composto está um tanto interferindo com os percursos bioquímicos e, portanto, é decidido que nos deixe saber reduzir as atividades metabólicas e permaneça como se conhece o estágio dormente. Então, nesse caso o parasita vai ser permanecido a vida, mas não vai crescer de fato, porque para o crescimento requer todas essas vias metabólicas para estar em um estado ativado. A outra condição é que ele esteja realmente contendo você sabe, convertendo o parasita em um anel contendo parasita, mas esses anéis são na verdade os mortos. Então, se eles estão mortos, então eles não vão te dar o schizont o que você fizer de fato, mas eles estão ao vivo e se você remover o composto, que é então eles vão realmente dar-lhe o schizont, o que significa que eles podem ser capazes de completar o seu ciclo de vida. Portanto, se eles estão sendo capazes de você conhecer a vida e poderão completar então o composto vai ser chamado como parasitotatico o que significa que na verdade ele está apenas inibindo o crescimento do parasita, mas se ele está convertendo o parasita a um parasita morto, então o parasita mortonão vai completar o ciclo de vida e é assim que ele vai ser chamado como parasicida o que significa que vai matar o parasita. Então, para determinar que o que você tem que fazer é em 100 microlitros volume 3% hematócrito com 1% parasitemia foram expostos ao composto trial durante 48 horas após 48 horas o parasita foi lavado duas vezes com a mídia completa para que você possa ser capaz de remover os compostos e então você incubar por outras 48 horas em uma mídia livre de drogas. Então, uma vez que você a mantenha em uma mídia livre de drogas, eles realmente vão ficar livres para você saber crescer se forem ao vivo, eles vão crescer se estiverem mortos, eles não vão crescer. Então, então você vai preparar uma esmalte e a parasitemia pode ser determinada com o microscopicamente mesmo enquanto discutimos como você prepara uma esmalte, então você conta que sabe as 1000 células, o que significa os 10 campos na verdade e se você contar as 1000 células, ele vai realmente te dar o estatisticamente significante quantos número de RBC ’ s estão presentes e dessa forma você realmente vai determinar a parasitemia. Então, isso tudo é sobre um problema em que utilizamos a microscopia de luz e na verdade determinamos a atividade anti-malarial de um composto de teste você pode ser capaz de modular as espinhas de ensaios e você pode ser capaz até mesmo de utilizá-la para alguma outra aplicação. Por exemplo, mesmo que a gente veja o que discutimos, nós discutimos sobre o parasita da malária, mas se você quiser mudar as condições. E você quer utilizar os microscópios, você pode ser capaz de alterá-lo em conformidade. E é assim que você pode ser capaz de utilizá-lo até mesmo para a triagem do composto para outros ensaios também. Por exemplo, você pode usar a versão até mesmo um pouco derivada e você pode ser usado para microscopia para medir se, você sabe para até mesmo para células cancerosas e todos os outros tipos de células, se as células estão crescendo ou não. (Consulte O Slide Time: 23:29)Agora, discutiremos sobre o problema da pesquisa 2 portanto, no problema da pesquisa 2, os cientistas estão rotineiramente propagando células de mamíferos e agora, o que o cientista fez, desenvolveu um novo meio, o que significa que ele desenvolveu uma nova mídia para proliferações de células. Agora, o que ele quer, ele quer projetar um experimento para contar o número de células viáveis e número de células mortas o que significa, ele desenvolveu uma nova mídia. E agora, o que ele quer é ele já que ele quer testar se essa mídia é boa o suficiente, já que já foi estabelecida mídia em comparação com a mídia apurada e se o número de células vivas ou mortas são mais ou menos no caso de quando nós estamos usando essa nova mídia nova para propagações. (Consulte O Slide Time: 24:21)Então, o design experimental é muito simples você vai usar um corante que é chamado como o azul trypan so, o azul trypan é um corante carregado. E as células viáveis excluem esse corante à presençado potencial de membrana enquanto que a célula morta vai, na verdade, acumular o corante no citosol. Então, o que acontece é você pegar as células ou você tomar a cultura na verdade, e então se você adicionar o azul trypan o que vai acontecer é que o azul trypan vai realmente ser excluído pela célula porque o azul trypan é um corante carregado. Por isso, requer algum receptor ou alguns outros processos ativos através dos quais o azul trypan pode ser tomado pela célula, mas se a célula está morta, porque a célula está mantendo uma, você sabe, um potencial através da membrana e a tintura tem que neutralizar esse potencial, então somente a tintura pode ser capaz de entrar, mas se a célula estiver morta, esse azul trypan vai realmente ser inserido na célula e ele vai realmente fazer a célula como a cor azul. Então, é isso que você tem que fazer, se você leva as populações de células inteianas, e se você mancha com o azul trypan o que você verá é que as algumas células que não tomaram o corante, e as algumas células, que na verdade são aparentadas de azul, então, estas são na verdade as células vivas, porque na verdade estão se opondo à entrada do corante na célula, porque eles têm potencial de membrana ativa. E esse potencial de membrana se opõe à entrada do composto em comparação com isso, trata-se de uma célula morta e que a célula morta não tem o eletrodo necessário, o potencial de membrana e é assim que, ele realmente vai permitir a entrada do corante e o corante vai realmente se acumular nas células, este é o hemocitômetro que na verdade você pode usar para contar essas células com a ajuda da microscopia. (Consulte O Tempo De Deslizamento: 26:19)Então, o material o que você requer do material o que você requer é um deslizamento de vidro, você requer um coverslip, você requer um microscópio invertido com disposição de contraste de fase, como você requer uma placa de fase e então você requer um hemocitômetro. (Consulte O Tempo De Deslizamento: 26:36)Esses são os múltiplos passos de modo que, na etapa 1, o que você tem que fazer é ter que remover a célula da placa de cultura celular seja pela trypsinização ou pelo EDTA 0,5%. Então, este é o passo 1, e então você placa a pequena quantidade de células em um deslizamento de vidro e as cobria com um coverslip então o que você faz é levar a mistura 50 microlitros de suspensão celular com os 50 microlitros de soluções de azul trypan. Então, 0,5, 0,4% solução azul trypan já está disponível dos diferentes fornecedores que você pode comprar, e então você preenche as câmaras de hemocitômetro, observe a célula sob o objetivo 20x usando o microscópio invertido com a placa de fase. Assim, células viáveis aparecem coloridas, enquanto que a célula morta aparece azul ou o colorido escuro, o hemocitômetro é colocado no estágio do microscópio e a suspensão celular é contada, há um notch de cor V. Por isso, no hemocitômetro, o que se tem é no centro você tem um notch de cor V. Por isso, neste V color notch você pode realmente saber, através de que você V cor notch, você pode ser capaz de saber, você pode ser capaz de carregar o hemocitômetro com as células, e as células são contadas na câmara e que dá o número de células além disso, a célula colorida azul pode ser contada para saber que o número de células mortas.Então neste procedimento específico, o que você tem que fazer é o primeiro que você tem para trypsinizar as células. Por isso, quando você adicionar a enzima trypsin, ou você pode usar o EDTA, na verdade ou vai mastigar todos os receptores, o que as células estão usando para grudar nos pratos, ou ela realmente vai destruir o cálcio. Por isso, qualquer que seja o mecanismo, as células vão sair do prato. E aí o que você pode fazer é só misturar os 50 microlitros da cela com os 50 microlitros de azul trypan. E então você carrega isso no hemocitômetro e depois coloca-o sob o microscópio invertido e então você pode realmente visualizar as células dentro da câmara. E você pode ser capaz de, você sabe, contar o número de células azuis e o número de células coloridas e é assim que você pode ser capaz de contar o número de células mortas e número de células viáveis. Então, isso tudo é sobre uma compreensão teórica desse processo. Deixe-me levá-lo ao meu laboratório e vamos mostrar todos esses procedimentos e porque o hemocitômetro é um muito, muito, você sabe, se você muito claramente ver o interior da estrutura, ele realmente tem uma câmaras diferentes, e então você tem que fazer uma contagem nessas diferentes câmaras. Assim, que você será capaz de contar o número de células e número de células e então você finalmente pode ser capaz de calcular até mesmo a concentração da célula em por microlitro ou número de células por ml também. Porque essa informação é necessária se você deseja chapar um número específico de células para um experimento. Por exemplo, se você se lembra de quando estávamos fazendo o, você sabe o quando estávamos discutindo sobre os experimentos de fagocitose, a última vez que dissemos que você tem que chapar as 10.000 células. Por isso, se você vai querer chapar as 10.000 células a primeira coisa que você tem que fazer é ter que colocar as células no hemocitômetro que você tem que contar. E então você tem que converter esse valor na concentração como 10 para a energia 6 por ml ou 10 para a energia 8 por ml ou assim por diante. E então, assim, você tem que diluir e calcular que quantos microlitros da suspensão celular eu deveria tomar para que ele me dê as 10.000 células por poço. Então, isso também é verdade para e todos os outros assédios como o MDT assay e você sabe, todo outro tipo de ensaio o que você faz em seu laboratório em que você tem que fazer uma contagem. Por isso, vamos entender como você pode fazer a contagem de células e como você pode ser capaz de determinar quais são os números de células viáveis que você tem e quais são as células mortas que você tem. (Início Vídeo: 30:43)Agora, vamos seguir para os próximos problemas. Por isso, o próximo problema de pesquisa é que o mycobacterium tuberculosis H37Rv está inibindo a interação entre a maturação do phagosome e agora é preciso projetar um experimento adequado para estudar a interação dos fagosomas com os lisossomos. Se você se lembra, quando estávamos discutindo sobre a fagocitose em nossa palestra anterior, dissemos que o phagosome é formado quando uma partícula está sendo acometida pela célula através da fagocitose. Assim, uma vez que uma célula está sendo levada para cima de uma partícula, como por exemplo, uma bactéria, neste caso, a micosbacterium tuberculosis, esta partícula em particular vai ser fagocitose com a ajuda da pseudopédia. E depois, finalmente, vai ser internalizado. Por isso, na coisa de internalizar, o que você tem é você esta é uma bactéria o que você tem, e ela é internalizada por uma estrutura membranosa. E essa estrutura é, na verdade, chamada como o phagosome. E aí, eventualmente, o que aconteceu é que você tem os lisossomos na cela, então todas as células imunes têm os lisossomos. Então, então esses lisossomos de fato se fusionam com esses phagosome. E este é um processo muito, muito complicado e complexo através do qual o phagosome realmente interage com os lisossomos e acabou por se desenvolver e você sabe, os lisossomos fundidos, e então quando o lisossomo é fundado, ele realmente causa o  Então, o material o que você exige? Você requer o metanol e acetona que é necessário para fixação, você exige que o PBS que é apenas para lavagem de propósito então você requer o triton X 100 que é para permutações você requer o BSA, você requer que os microscópios de epi-fluorescência sejam necessários, você requer que o 1 micron látex esmiúça os necessários os filipins e então você requer o dextran rhodamine so, rhodamine dextran é uma corante fluorescente, que realmente vai permitir que você forme os lisossomos. (Consulte O Tempo De Deslizamento: 47:47)Então, o procedimento o que nós exigimos o procedimento é que na etapa 1 você vai fazer a identificação do phagosome ou o você vai preparar os fagosomas que você pode como por você saber fornecido pelo seu próprio material. Então, o que você pode fazer é pegar o J774 estas são as células de macrófagos, então, estas são as células imunes, que você pode usar para fagocitose. Sendo assim, estas são as células de macrófagos são cultuadas na DMEM Media contendo 10% coquetéis FBS e 1%. Em seguida, você remove as células da placa da célula por trpsinização ou EDTA. Você placa as 10.000 células em taças de cobertura e incuba em um poço de 24 você então você incuba as células durante a madrugada, e permite que as células se fixem nos óculos de capa. Em seguida, você lava as células com DMEM então você prepara uma suspensão das esferas de látex como 10 para ligar 6 esferas de látex por ml em uma mídia DMEM. Então, o que você tem que fazer é ter que manter uma proporção de 1 é para 10 em termos do número de células o que você tomou e o número de esferas o que você tomou. Assim você vai fornecer as 10 esferas para cada células para se alimentar e depois você remove a mídia e adicio a suspensão à centrífuga. E assim basicamente o que você está fazendo é na etapa 1, você está basicamente fazendo phagocytosis e é assim que ele realmente vai eventualmente formar os fagossomos. (Consulte O Tempo De Deslizamento: 49:15)Então, estes são os, você sabe, o laço as células com isso e que e então você fixa a amostra com o acetona e então você mancha com os filipines. Então, isso de fato vai permitir que você identifique o phagosome porque onde quer que você vá ver o objeto sendo cerceado por uma fluorescência de cor azul que na verdade são os fagossomos e então você monta as células em você sabe, e você pode ser capaz de identificar os fagossomos. (Consulte O Tempo De Deslizamento: 49:50)Em seguida, na etapa 2, você vai fazer um labeling dos lisossomos. Então, o que você faz é você chapa as células em um óculos de capa em 24 bem placa as cultivam com 100 micrograma rhodamine dextran durante a madrugada em DMEM mais 10% FBS mais coquetel antibiótico. Então, o que vai acontecer é quando você vai cultivar as células em uma mídia que contém o dextran de rhodamina então, rhodamina é uma tinta fluorescente e ela é acoplada a um dextran. Então, o dextran não passa de um polissacarídeo.Então, o que aconteceu é que a cela vai começar a ir comer esses dextran de rhodium. Por isso, quando vai comer o eventualmente todos os materiais acabam entrando no lisossomo porque você sabe que a função primária do lisossomo é digerir o material o que você ingeriu ou o que quer que seja o que você sabe, o material está sendo ingerido pelas células, porque ultimamente, você tem que saber, você tem que digerir todo aquele material, gerar os constituintes materiais como supor que você digerir a proteína, então ela vai gerar o aminoácido. E então esses aminoácidos vão ser fornecidos, para a célula para suas propagações ou para nutrição. Então, seja qual for a mídia que você está usando, você usa a mesma mídia adicionou o dextran de rhodamina e que você deixou que eles cressem durante a madrugada. E é assim que a rhodamina vai ser acabar nos lisossomos você lava as células com a PBS, e aí você vai perseguir a amostra por 1 hora. Então, o que significa correr atrás é que você remove o dextrão de rhodamina e então você deixa isso para crescer sem que você saiba sem o dextran de rhodamina. Então, o que aconteceu é se você o fizer, a última gota do dextrão de rhodamina também vai ser acabar nos lisossomos porque eventualmente tudo acaba entrando no lisossomo porque é assim que a célula idealizou um mecanismo para que o que quer que ele beba ou o que quer que ele coma, ele acaba entrando no lisossomo para que ele fique digerido. E você pode ser capaz de usar o nutriente saindo dessas digestões. Em seguida, na etapa 3, você vai montar os assédios de fusão. Assim você adiciula o 10 ml de micrograma 1 ml em media de 0,5 ml e gira a 1000 g por 2 minutes minutos, depois você incuba por mais 5 minutes minutos em banho-maria. Então, quando você faz aquela incubação em 5 minutes minutos para banho de água, na verdade vai induzir a fagocitose dessas esferas. E aí você remove as esferas e lavá-las duas vezes com o PBS contendo 37 grau celsius, a mídia é removida e fixa com o paraformaldeído então os slides são visualizados nos microscópios. Por isso, nos assédios de incubação, o que você vai fazer é já ter preparado o lisossomo na célula, então o que você faz é adicionar as esferas de látex a essas células e permitir a elas a fagocitose. E uma vez que eles são fagocitose os fagossomos já estão sendo formados lisossomos já estão lá porque eles já estão sendo fluorescentemente rotulados. E agora o que vocêpode fazer é só fazer essas incubações para você saber os múltiplos pontos de tempo como você pode fazer 5 minutes, 10 minutes e até 1 hora. Neste processo, o phagosome vai ao encontro de todos os lisossomos e os lisossomos vão ser fundidos com fagossomos. (Consulte O Tempo De Deslizamento: 53:18)Então, o que vai acontecer o quando você visualizar essas células sob o microscópio o que vai acontecer é que se você observar as células em um campo brilhante e procurar as esferas sobre a célula, então o que você vai ver é apenas visualizar as células sob o microscópio, aí você procura as esferas sob os campos brilhantes para observar as células em um microscópio fluorescente com um filtro UV. Se a bead tem uma fluorescência azul, como neste caso, esta é a bead e tem uma fluorescência azul em torno dela o que significa que este é realmente um phagosome que já foi formado. Agora, uma vez que você viu os phagossomos então o que você pode fazer é então as células podem ser visualizadas através de um canal vermelho. Então o que você vai fazer é primeiro você selecionar o bead o que você quer visualizar sob os campos brilhantes, aí você vai com o canal azul. Por isso, no canal azul, na verdade vai dar uma fluorescência azul em volta e aí você vai para o canal vermelho. Então, uma vez que você vai para o canal vermelho, o que você vai ver é que esse sinal colorido azul também está tendo um sinal de cor vermelha, o que significa, se você tem o sinal duplo como se você tem o anel de cor azul, e então se você tem um anel de cor azul ao redor, o que significa que estes são os fagossomos, que na verdade estão tendo os lisossomos também, o que significa aqui os fagosomas estão interagindo com os lisossomos.E é assim que os fagossomos receberam o conteúdo dos lisossomos. Assim, é assim que se pode concluir que o phagosome está agora amadurecido, e se formou os fagolysossomos como se vai analisar esta uma fagocitose típica de bead representará pelo aparecimento da bead nos dados de fase que significa esta e a mesma bead será circundada por uma fluorescência azul a partir dos filipins. Se o bead tem também anel de fluorescência azul e ele cerceado ainda mais por um anel de cor vermelha indica que a interação lisossomos e phagosome está acontecendo você pode ver que algumas das esferas como por exemplo, esta bead também está formada. E esta bead é não tem nenhum fagossomos. Por exemplo, neste caso, você vê que este é o bead, que na verdade é internalizado. E você tem uma florescência de cor azul mas para esta bead em particular, você não tem nenhum sinal na fluorescência vermelha o que significa que esta bead está apenas formando os fagossomos. Mas esses fagossomos não estão interagindo com os lisossomos. Então é assim que você pode ser capaz de estudar a interação do phagosome com os lisossomos. E você o que fez foi simplesmente ter permitido as células carregadas com os marcadores lisossomais ou os marcadores fluidos. Então, que os lisossomos estejam sendo rotulados com uma cor vermelha fluorescente e então você permite que a célula fagocitose algum material e uma vez que ele vai fagocitose ele vai formar os fagossomos e então ele vai realmente interagir com os lisossomos e onde quer que o phagosome vá interagir com os lisossomos você vai ver um bead que é circundado por um anel de cor azul e anel de cor azul é mais cerceado pela coloração vermelha. Por isso, se você tem 2 anéis, vermelho e azul, então esse é um lugar onde o phagosome está sendo interagido com os lisossomos. Por isso, com isso, gostaríamos de concluir nossa palestra aqui e nesta palestra, discutimos os diferentes experimentos o que você pode ser capaz de realizar com a ajuda da microscopia e espero que você possa projetar poucos mais experimentos depois de olhar para o potencial dessas técnicas em particular e ela pode te ajudar na concepção do novo experimento para o seu próprio trabalho. Então com isso, eu gostaria de concluir minha palestra aqui. Obrigado.