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Eletron Microscópios Hello todo mundo, este é o Dr. Vishal Trivedi do departamento de biociências e bioengenharia IIT, Guwahati. E o que estávamos discutindo? Estávamos discutindo sobre os microscópios e nessa discussão começamos com os microscópios de luz e depois, posteriormente, discutimos sobre os microscópios de fluorescência. E, na palestra anterior, também discutimos como você pode ser capaz de utilizar o microscópio de fluorescência para estudar a fase de Phagocitose.Então, agora na palestra de hoje ’ s vamos realmente discutir sobre alguns aspectos mais relacionados à microscopia. Então, um dos fenômenos básicos para os quais o povo está usando o microscópio é que ele está realmente ampliando os objetos e é assim que você pode ser capaz de ver o objeto 2 distintamente usando os microscópios. Então, a capacidade de um microscópio para ver distintamente os 2 objetos diferentes está sendo medida por uma propriedade conhecida como resolução.Se você se lembra, quando estávamos discutindo sobre a cromatografia, também discutimos sobre resoluções e onde estávamos falando sobre a separação dos 2 picos diferentes enquanto que no caso da microscopia, a resolução é mais sobre a capacidade de um microscópio para resolver os 2 objetos diferentes e a distância entre esses 2 objetos. Por isso, vejamos como a resolução está sendo definida.(Consulte o Slide Time: 02:24)Então, o termo resolução é a distância mínima em que o ponto 2 distinto de um espécime ainda pode ser visto pelo microscópio. E, pela definição, a resolução de um microscópio está ligada à abertura numérica assim como o comprimento de onda da luz utilizada para examinar o espécime que significa a distância d é diretamente proporcional à lambda e inversamente proporcional às aberturas numéricas.Mesmo se você utilizar o microscópio de fluorescência ou os microscópios de luz, vai-se utilizar a faixa visível do espectro. Então, se você imaginar que eu estou usando a luz de cor verde e se eu usar uma luz de cor verde que na verdade vai ter um comprimento de onda de 514 nanômetro e com um microscópio de luz onde você está usando o objetivo de imersões de óleo, a abertura numérica vai ser 1,45.Então, se você colocar todos esses valores nessa fórmula, o que você vai obter é, você vai obter o d é 177 nanômetro que significa com a ajuda do microscópio de luz, você pode ser capaz de ver os objetos que são os próximos ao nanômetro de 177 se você estiver usando a luz verde como fonte de luz. Portanto, há 2 opções pelas quais você pode conseguir aumentar ou pode ser capaz de diminuir esse número e como você pode ver que d é diretamente proporcional a lambda o que significa se você diminuir a lambda você pode ser capaz de diminuir as distâncias.E lembre-se que diminuição na distância significa o aumento da resolução o que significa se eu estou olhando para os 2 objetos, que estão muito longe do nanômetro de 1, portanto, se os 2 objetos são 1 nanômetro esta diferença e eu poderia ser capaz de vê-los nitidamente então a resolução deaquele microscópio específico vai ser melhor do que este microscópio que na verdade é indo dar uma distância de 177 nanômetro.Então, diminuição em d não deve ser interpretada como d diminuição na resolução. Por isso, diminuir em d significa que há um aumento nas resoluções, o que significa que há 2 maneiras pelas quais você pode ser capaz de fazer o d é diretamente proporcional a lambda. Então, se você diminuir a lambda, o d também vai ser diminuído e é assim que você pode ser capaz de aumentar as resoluções. d é inversamente proporcional a 1 / NA.O que significa, se eu tiver que diminuir o d eu tenho que aumentar a NA. Mas há uma limitação até que você possa ser capaz de aumentar a abertura numérica nuclear de um microscópio. É por isso que vocês não estão modificando a abertura numérica em vez disso o que eles estão fazendo é que estão brincando com o comprimento de onda diferente da luz. E é assim que você pode ser capaz de obter as melhores resoluções.Então, se você vir o espectro eletromagnético do espectro eletromagnético, o que você verá é que para a luz visível, você está usando isso no microscópio de luz. E se você for da luz visível em direção ao ultravioleta assim como raios x e raios gama o que significa se você for em direção a este lado, você realmente vai diminuir a lambda. E à medida que você diminui a lambda, você acaba indo aumentar resoluções.O único problema é que quando você diminui a lambda, na verdade você vai chegar a uma região que na verdade não vai ser visivelmente ativa o que significa que não vai ser percebida diretamente por um olho humano. E é por isso que você requer uma intervenção para que você possa ser capaz de perceber os sinais. Assim, uma das formas como você pode ser capaz de perceber o sinal que está vindo tanto pelos raios x ou raios gama é que você pode realmente adicionar algum raio x ativo ou as moléculas ativas de raios gama no sistema.Então, se você quiser aumentar a resolução, o que você pode fazer é realmente você pode estamular as células com moléculas que realmente vão te dar o sinal ou que na verdade vão responder a esses comprimentos de onda. E é assim que você pode ser capaz de visualizá-los, não a olho nu, mas com a ajuda dos diferentes tipos das telas sensíveis. Por isso, quando você diminui a lambda, neste caso, o que as pessoas estão fazendo é que estão usando o elétron como fonte das iluminações.E a microscopia o que eles estão usando é chamada como microscopia eletrônica. E como eu disse, se você ver o comprimento de onda do elétron da web e se você for colocar esse valor nessa fórmula, você pode ser capaz de calcular a resolução teórica possível de uma microscopia eletrônica. Então o que eu sugeriria é que você deve fazer esse exercício e ver o quão grande é a ampliação que você vai obter quando usar os microscópios eletrônicos.Assim, microscópios eletrônicos estão usando o elétron como fonte para iluminar os objetos e então esses elétrons irão interagir com a matéria que está presente dentro da célula. E é assim que eles vão realmente dar-lhe a imagem daquela amostra particular. Existem 2 maneiras pelas quais você pode ser capaz de processar a amostra e é assim que você pode ser capaz de ter os 2 tipos diferentes de microscopia eletrônica.(Consulte o tempo de deslizamento: 07:52)Então, existem 2 modos básicos dos microscópios eletrônicos, um é chamado como microscópio eletrônico de varredura ou o SEM e outros chamados como aquele microscópio eletrônico de transmissão ou o TEM. Então, se você tem uma amostra, na verdade você pode ter as 2 coisas para observar, uma como a superfície desse objeto em particular e que realmente você pode fazer simplesmente por olhar para fazer com o SEM que é chamado como microscópio eletrônico de varredura.Então um microscópio eletrônico de varredura, como o nome sugira é realmente ir escanear a superfície desse objeto em particular. E é assim que na verdade vai dar-lhe a, como é a aparência da superfície. Então, na verdade vai te dar a topologia, enquanto que se eu estiver interessado em saber o que é o material é e como as estruturas estão dentro, então o que eu posso fazer é eu possorealmente cortar essa amostra nas múltiplas seções e então eu posso ser capaz de ver todas as coisas o que está presente dentro e que é o que é chamado como microscópio eletrônico de transmissão.O que significa, eu posso realmente iluminar os objetos de 2 maneiras, em que de uma maneira que eu possa simplesmente iluminar a superfície superior e é assim que posso ser capaz de monitorar a química de superfície ou a topologia de superfície. A outra maneira é que eu só vou iluminar o objeto passar e dessa forma o elétron passará com a amostra e é assim que ele realmente vai me dar detalhes o que está presente dentro do mater, amostra e que está sendo feito pelos microscópios eletrônicos de transmissão.Então em um SEM, os elétrons secundários produzidos pelo espécime são detectados para gerar uma imagem que contém a característica topológica do espécime, o que significa como a superfície é, na verdade, chamada como a topologia. Então, esse é o detalhe o que você recebe quando vai processar uma amostra para o microscópio eletrônico de varredura. A imagem em um TEM por outro lado, é gerada pelo elétron que se transmitia através de um espécime fino. E é assim que na verdade vai dar-lhe os detalhes daquela amostra específica como a amostra é de dentro.(Consulte o Tempo do slide: 10:08)Então, em um microscópio eletrônico de varredura e se você tem a arma de elétrons, então você tem a arma de elétrons que na verdade vai gerar os elétrons e então ele vai realmente ter as bobinas magnéticas, o trabalho dessas bobinas magnéticas é apenas focar os elétrons o que está vindo da arma de elétrons e então você tem uma lente condensadora. Então, a lente condensadora é na verdadeindo focalizar isso e então ela realmente vai permitir que você bombardee a amostra que vai ser colocada em um porta-amostras.Então a água o que está presente dentro de uma amostra biológica vai realmente fazer a amostra se difrar ou espalhar os feixes de elétrons e é assim que ele vai realmente deixar o fundo mais e mais pronunciado. Então, para evitar que você tenha que realmente remover a água. Por isso, as amostras biológicas são frágeis e contém uma grande quantidade de água, a água presente na amostra biológica realmente difrata os raios de elétrons e pode aumentar o sinal de fundo.Como eles vão aumentar o sinal de fundo é que se você tiver uma molécula de água, as moléculas de água vão realmente aumentar os elétrons de volta, quando ver que você tem os elétrons de trás e um fundo de elétrons de costas, ele realmente vai deixar as coisas mais nebulosas. E é assim que na verdade vai mascarar o sinal dos seus elétrons dispersos. E é assim que na verdade tem que ser retirado da amostra para obter um contraste muito claro.Então, seguindo fixações de óxido de osmium, a água é extraída quimicamente da amostra usando uma série ponderada de etanol. Assim, ele está executando as seguintes etapas. Por isso, o que você faz é simplesmente encharcada a amostra em uma concentração diferente de álcool. De modo que e o álcool é higroscópico na natureza, então ele vai mesmo começar a sugar a água, mas você não pode fazer a desidratação de maneira abrupta.Então você tem que fazer a desidratação em um incremento muito lento. Por exemplo, primeiro você vai pegar a amostra e incubar com o etanol de 50% para 30 minutes. Então, isso é tão 50% etanol significa que na verdade vai ocupar a água muito lentamente. E é assim que na verdade vai começar a retirar a água uma vez que na verdade foi atingido o equilíbrio,então você vai incubar a amostra com 70% de álcool, então você aumentou mais o álcool.Então, que na verdade vai retirar algum líquido mais líquido, então você vai incubar a amostra com 80% e depois vai incubar a amostra com 90% e depois vai-se incubar a amostra com 95%. Por isso, nessa fase, a amostra é quase que não há água presente, mas então o que você vai fazer é que vai incubar a amostra com 100% de etanol por 30 minutes.Então, isso realmente vai remover mesmo se houver uma quantidade menor de água presente dentro da amostra. E é assim que a nossa amostra está agora livre de água. Por isso, a amostra é incubada com álcool anidro, de modo que é o 100% ou o álcool absoluto. Então você vai ter o álcool anidro e isso vai realmente remover a última gota de água. Então, por que estamos fazendo a desidratação de classificação é porque se você fizer desidratação abrupta.O que significa se eu apenas pegar a amostra e colocá-la no álcool 100% em primeiro lugar de toda remoção de água não vai ser suave. Na verdade vai ser mais de alguns fins e os menos dos outros fins. Então, isso de fato vai mudar a química de superfície e isso tudo realmente é que vai mudar a estrutura ou a morfologia dessa amostra específica. E, além disso, o álcool também pode danificar a amostra.Então, quando você faz uma desidratação gradativa, o que significa que você começa a partir da década de 50% e então você vai lentamente em múltiplos passos para 100% e depois para o álcool absoluto anidro. Você realmente permite que a amostra aclimatize a esse ambiente específico. Isso significa que você realmente permite que a amostra permaneça morfologicamente intacta.(Consulte o Tempo do slide: 19:36)Então, depois disso você tem que fazer uma etapa de secagem. Por isso, na Etapa 5, é preciso fazer uma secagem assim durante a amostra de desidratação precisa evitar a secagem do ar. Uma vez que a amostra seca é removida, ela precisa ser armazenada em um ambiente dessecado, até a visualização. Portanto, isso significa uma vez que sua amostra está desidratada você tem que fazer uma secagem sob o vácuo e então você tem que manter a amostra sob o vácuo para que ela não capture a umidade da atmosfera.O que significa, pois sua amostra agora está desidratada ela está realmente tendo uma tendência para capturar a umidade da atmosfera. E é por isso que você tem que fazer uma etapa de secagem e então depois que a secagem acabar, então você tem que manter esta amostra em dessecradores. E o desiccador se você não sabe sobre o desiccador, desiccador é uma caixa tipo de coisa em que você realmente pode gerar um vácuo muito alto como 10 para ligar -5 ou 10 para o poder -7 vácuo.E então esse vácuo realmente vai fazer o sistema inerte. Assim, vai remover todo o ar. Sendo assim, é assim que não haverá umidade presente naquela câmara em particular e é por isso que a sua amostra vai ser preservada. Agora é preciso manter essa amostra sob as condições dessecadas até que você não esteja pronto para analisar as amostras. Por isso, pouco antes da análise você tem que fazer a etapa 5.Então o passo 5 é o espécime revestimento. O espécime precisa ser coado com o material condutor para visualizar com o microscópio eletrônico de varredura. Então, como eu disse você tem que adicionar algo para que ou você tenha que estadar a amostra de tal forma para que ele seja respondo aos feixes de elétrons. Então, neste caso, você realmente vai casaco a amostra porque vocêestá apenas simplesmente interessado em ver como a morfologia da superfície é parecida. Então e que é o que o propósito está escancarando microscopia eletrônica.Então, que você faça com a ajuda de um sputter. Por isso, em um sputter uma descarga é formada entre um ânodo e um cátodo usando um gás adequado. Então, esse é um sputter de ouro, o que você tem é ter um alvo, o que significa que isso está realmente tendo o ouro e que está realmente estando presente em um negativo e então você está, isso está sob o vácuo. Assim, sob o vácuo você está realmente mantendo sua amostra em relação a este bloco e então você está perguntando e então você está realmente fazendo um bombardeio dos íons de gás.Então, quando você está fazendo o bombardeio de íons de gás, o que vai acontecer é realmente está tomando o ouro, e ele está realmente mostrando o ouro em cima dessa amostra e é assim que ele realmente vai fazer uma camada lisa do revestimento de ouro sobre a amostra. Assim, o bombardeamento dos íons de gás em relação ao material catódico, geralmente o ouro, erode o material alvo e o depositam sobre o espécime.Então, quando você faz um bombardeio de sua substância alvo como o ouro neste caso, com os íons, o material vai sair o que significa que o ouro vai sair e então ele realmente vai depositar na amostra e ele realmente vai depositar conforme a morfologia dessa amostra específica. Então, não vai atrapalhar a morfologia da amostra, em vez disso vai apenas fazer um revestimento a vapor.Para que você possa ser capaz de estudar a morfologia dessa amostra específica porque onde quer que o ouro esteja presente, ele realmente vai se difundindo e ele na verdade vai espalhando o elétron e é assim que você pode ser capaz de captar o elétron de trás, assim como os elétrons espalhados. O alvo utilizado no sputter é composto por 60% de ouro e o 40% paládio. A deposição uniforme do material sputtered que é o ouro forma até mesmo revestimento na superfície do espécime.E tornar o espécime condutor para executar o microscópio eletrônico de varredura. Então, uma vez que você é feito com este revestimento da amostra, então sua amostra é, você não precisa manter a amostra sob o vácuo e então você pode simplesmente carregar esta amostra no microscópio eletrônico de varredura e então você pode ser capaz de visualizar com o uso do microscópio eletrônico.(Consulte o Tempo do slide: 24:00)E então quando você visualizar, você ficará parecido com isso. Então, o que se vê é que na verdade esta é a bactéria e o que se vê é a superfície da bactéria é assim, pois fizemos algum tratamento e é assim que todas as bactérias o que se vê é de fato ter uma mudança na química da superfície e o que se vê é alguma das formações como esta é a escala através da qual esta foto foi tirada.Então a escala é de 2 mícron, a ampliação o que você vê é 3.63k e esta é coletada no modo elétron secundário, você pode realmente ter o outro tipo de modo também, o que na verdade nos dá mais algumas informações sobre a química de superfície do moléculas. Então agora a partir daqui vamos seguir para o microscópio eletrônico de transmissão e discutirmos sobre como você pode ser capaz de utilizar o microscópio eletrônico de transmissão para responder as algumas das questões biológicas.(Consulte o Tempo do Slide: 24:56)Microcópio Eletrônico de transmissão é muito simples como é como um microscópio de luz, exceto que você está usando o feixe eletrônico como fonte de iluminação em vez da luz. Por isso, tenho dado uma comparação. Por isso, neste caso você tem um microscópio leve. Portanto, o microscópio de luz está usando uma lâmpada e que na verdade está enviando a luz e então ela está sendo focada por uma lente condensadora e então está sendo iluminada os objetos.E então uma vez que ela é iluminada o objeto você pode realmente capturar a imagem com a ajuda das lentes objetivas e então você pode ser capaz de ver que com a ajuda do sobrado. Da mesma forma, no caso do microscópio eletrônico de transmissão, você tem a arma eletrônica através da qual os elétrons estão por vir, e então você tem as bobinas magnéticas através das quais você pode ser capaz de concentrar esses elétrons.E então você tem as lentes focadas e que focando a lente na verdade vai se concentrar os feixes e então ele vai realmente vai eliminar a amostra que vai ser mantida no palco e então qualquer que seja que os elétrons estejam saindo da amostra vão ser focados pela lente de projeção e então ela vai realmente ir para um detector. Por isso, neste caso, você realmente vai ter um detector que é sensível para os elétrons em comparação com isso aqui você pode simplesmente usar os olhos para perceber o sinal.Então, então você pode conseguir obter as mesmas informações. Por isso, aqui também as luzes estão passando pela amostra e é assim que você está realmente obtendo os detalhes da célula assim como o que está presente dentro da célula. Da mesma forma, no caso do microscópio eletrônico de transmissão também você obterá os detalhes de dentro da célula. Por isso, o microscópio eletrônico de transmissão geralmentetem as armas de emissão termônica e os elétrons são acelerados em qualquer lugar entre 40 200 kilo volts potenciais.No entanto, o TEM com mais de 1000 kilo volt potencial de aceleração foi desenvolvido para a obtenção de resoluções mais altas. Devido ao seu brilho e a um ótimo feixe de elétrons, as armas de emissão de elétrons estão se tornando mais populares como as armas de elétrons.(Consulte o Tempo do slide: 27:20)Agora, quando você faz um microscópio eletrônico de transmissão o processamento da amostra é pouco diferente do que você fez para o microscópio eletrônico de varredura e você tem que fazer etapa adicional porque agora você quer que a amostra, elétrons passem pela amostra e então na verdade ela vai dar a imagem. Então, o que você tem que fazer é o primeiro passo é o mesmo que você tem que parar o movimento da macromolécula biológica o que significa, você tem que fazer uma etapa de fixação.Depois da fixação o segundo passo é também o mesmo que você tem que remover a água para que você tenha que fazer uma desidratação, para que a água também não deve interferir no aumento do fundo porque a água vai interagir com os elétrons e ela vai difrar esses elétrons e que como você realmente vai ter o pano de fundo pesado. Então, você tem que remover a água.Depois disso, já que você tem que fazer o, suponha que esta é a sua célula ou esta é a sua célula realmente. Então, na verdade não é possível eliminar uma célula e então você pode ser capaz de olhar para o que você tem que fazer é ter que cortar essa célula em várias peças. E que como a camada única deaquele objeto específico tem que ser iluminado com o elétron porque esses elétrons são elétrons de alta energia mas eles não são tão altos que você pode ser capaz de iluminar o objeto espesso e que realmente vai passar com isso.Então, é assim que você tem que fazer as fatias finas disso, para que você vai iluminar e então você será capaz de coletar os elétrons o que está por vir através do objeto e é assim que realmente você pode ser capaz de reconstruir as imagens. Então, para isso é preciso fazer um bloco duro para cortar e isso é feito com a ajuda de um processo chamado como incorporador. Uma vez que você é feito com a incorporação, o que significa que você colocou isso em um bloco então você pode cortar a seção para que você corte uma seção dele, 10 80 nanômetro.E que você fará com as seções. Uma vez que você é feito com o seccionamento, então o próximo passo é que você tenha que esconder o lado não antigênico, o que significa que você tem que fazer uma etapa de bloqueio e então você tem que fazer uma coloração com o anticorpo o que significa que você tem que fazer uma coloração com o primário assim como os anticorpos secundários. Lembre-se que este é um microscópio eletrônico de transmissão.Então, comparado com a microscopia fluorescente, aqui você tem que usar um anticorpo secundário que na verdade é acoplado ou rotulado com o metal pesado para que ele realmente vá responder ou ele vai interagir com os elétrons, o que você vai usar para iluminar os objetos. Em seguida, é preciso manchar com os reagentes de contraste, para que você consiga enxertar melhor contraste da amostra. E é assim que você realmente vai preparar sua amostra e você pode ser capaz de observar as células com a ajuda do microscópio eletrônico de transmissão para mais detalhes e que realmente detalhes vão estar dentro da célula.Então você tem que também fazer uma mancha para visualizar as estruturas celulares. Assim, você pode adiantar que sua amostra está presente no grid então você pode incubar a grade em um acetato de uranyl por 2 horas e posteriormente em um citrato de chumbo por 2 horas adicionais. Assim, o acetato de uranyl vai manchando permitirá observar as estruturas celulares e estudar as alterações no celular ou na morfologia celular sub. Portanto, se você mancha as células com o acetato de uranyl, ele realmente vai permitir que você veja todos os diferentes tipos de organelas como mitocôndrias, corpos de golgi, retículo endoplasmático, núcleo e tudo mais.(Consulte o Tempo do slide: 39:25)Então você tem que fazer o imunogold labeling. Então, o que você faz é bloquear a grade com a ajuda do BSA, a incubada a grade em 5 anticorpos primários e, em seguida, você faz uma lavagem para remover os anticorpos sem ligação. Assim você mergulha a grade em um PBS por 3 vezes. E isso na verdade vai remover os anticorpos unbound pro. E aí você realmente mergulha a grade em PBS contendo tween 20.E isso de fato vai dar até mesmo a lavagem adicional dos anticorpos e é assim que você vai remover todos os anticorpos não específicos. E aí você a incuba com os anticorpos secundários. Os anticorpos secundários vão acoplados a uma nanopartículas de ouro de 10 nanômetros. Assim você tem as múltiplas opções ou pode usar anticorpo que é acoplado a uma partículas de ouro de 10 nanômetros ou a uma partícula de ouro de 5 nanômetros. Então, você tem as escolhas porque você pode ser capaz de ver muito claramente essas nanopartículas.E é assim que você pode ser capaz de muito pinpontemente dizer que esta é a localização da proteína particular. E aí você tem que fazer uma lavagem exatamente da mesma forma que você tem que fazer primeiro lavando com o PBS e depois PBS contendo o tween. Finalmente você mancha as grades novamente com o acetato de uranyl, para que você, qualquer que seja o acetato de uranyl tenha sido perdido enquanto estiver fazendo este imuno colorido volta-se novamente e ele realmente vai dar-lhe a morfologia das diferentes organelas.(Consulte o Tempo do slide: 40:54)E então você vai mesmo colocar isso ou vai carregar a grade no microscópio eletrônico de transmissão e o que vai acontecer é uma vez que você insere isso no microscópio, ele realmente vai ser iluminado pela arma eletrônica e que para o elétron vai passar e que onde quer que o elétron não passará por, por exemplo, esta é a sua amostra e estes são os lugares onde se tem o ouro.Então, o que vai acontecer é que quando você iluminar este objeto para todos os outros lugares, os elétrons vão ser passados através de que, o elétron não poderá passar a partir desses locais onde você tem as partículas de ouro ou para as partículas pesadas e por causa disso, vai mesmo dar um pontinhos coloridos preto. E é assim que você pode ser capaz de saber que estes são os locais das minhas proteínas.Então esta é a imagem típica o que você vai obter quando fizer uma imagem TEM, análise TEM. Então o que você vai ver é que você não vai ver a membrana muito chique e tudo mais. O que você vai ver é você vai ver um dots como este e estes são os pontos que na verdade são formados quando o anticorpo acoplado em ouro de 10 nanômetros era ligação para um anticorpo primário.E assim, estes são os locais da proteína de seu interesse que estão na célula. Se você quiser ver você pode ver essas células com a ajuda do estado interno a colorir e é assim que ele realmente vai dizer se esses pontos estão presentes nas mitocôndrias ou golgicorpos ou retículo endoplasmático ou núcleo e tudo mais. Esta imagem está sendo fornecida pelo, um do meu amigo em CDRI, Dr. Amogh.(Consulte o Tempo do slide: 42:38)Agora, se você quiser usar o microscópio eletrônico de transmissão, você pode ser capaz de utilizá-lo até mesmo para os estudos de localização de co. Por isso, se você se lembra quando estávamos discutindo sobre o microscópio fluorescente, eu disse que você pode ser capaz de usar 2 diferentes conjunto de anticorpos secundários para localizar a proteína a e a proteína b e você pode ser capaz de fazer as perguntas se a proteína a e a proteína b estão co localizando umas às outras ou não, se elas são localização é diferente e tudo isso.Então, neste caso também você pode ser capaz de fazer esse tipo de anticorpo 1, você pode pegar o anticorpo 2 e similarmente, você pode pegar os anticorpos secundários como x e y e o que você tem que fazer é o x você pode levar o ouro 5 nanômetro etiquetado e neste caso você pode levar o ouro de 10 nanômetro. Então, o que vai acontecer é onde quer que o ab2 esteja presente, ele realmente vai dar a você um círculo do nanômetro de 10.Onde quer que o ab1 esteja presente ele realmente vai dar um círculo de 5 nanômetro. Por exemplo, neste caso você vê estes são realmente os círculos de 5 nanômetro e estes são os círculos de 10 nanômetro. Por isso, em alguns lugares o que se vê é que por exemplo, aqui você verá que o nanômetro de 10 bem como o nanômetro de 5 estão realmente, estão aderindo um ao outro, o que significa, neste local a proteína ab1 e ab2 estão interagindo entre si, o que significa que eles estão realmente co localizando e provavelmente formando um complexo.Considerando que o outro coloca o nanômetro de 10 assim como o sinal de 5 nanômetro é diferente. Então, é assim que você pode ser capaz de muito precisamente poder dizer que se a proteína a e a proteína b estão interagindo uns com os outros ou não, e se eles estão se localizando para um mesmo compartimento ou não. Então, trata-se de tudo sobre os diferentes tipos de técnicas de microscopia. Por isso, longe o que discutimos discutimos sobre a microscopia de luz, discutimos sobre a microscopia fluorescente.E então na palestra de hoje ’ discutimos sobre a escaneamento assim como a microscopia eletrônica de transmissão, também entendemos como processar a amostra para todas essas microscopia ’ s. Por isso, em nossa palestra subsequente, vamos discutir poucos dos experimentos relacionados a essas técnicas de microscopia. E aí também vamos discutir alguns aspectos mais relacionados com as ferramentas biológicas celulares. Por isso, com isso eu gostaria de concluir minha palestra aqui. Obrigado.