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Microscópio Olá pessoal, este é o Dr. Vishal Trivedi do Departamento de Biociência e Bioengenharia do IIT Guwahati. E assim, longe o que discutimos discutimos sobre a culturação das células dos mamíferos. E na palestra anterior, também discutimos sobre como você pode ser capaz de fracionar as células de mamíferos assim como a célula procariótica com a ajuda dos diferentes tipos de centrífugas.Ou você usa as certificações diferenciais ou as certificações de gradiente de densidade, não além do uso das centrífugas ou para separar as células em diferentes frações, também podemos localizar ou podemos localizar também uma célula particular dentro da proteína particular dentro da célula com a ajuda da microscopia. Assim, as células o que você está cultuando com a ajuda dos diferentes tipos de mídias podem ser visualizadas com a ajuda dos diferentes tipos de microscópios.Então, na palestra de hoje, vamos discutir sobre os microscópios e como você pode ser capaz de utilizar esses microscópios para localizar uma determinada proteína dentro da célula ou como você pode ser capaz de utilizar esses microscópios para executar diferentes tipos de experimentos baseados em células.(Consulte o Tempo do slide: 02:18)Então, eu acho que discutimos sobre os diferentes tipos de células, nós tínhamos discutido sobre as células procarióticas assim como as células eucarióticas dentro das células eucarióticas, discutimos sobre as células animais de levedura assim como as células vegetais e para visualizar essas células podemos utilizar os diferentes tipos de ferramentas microscópicas. Por isso, o microscópio é um instrumento que realmente pode ser usado para visualizar as células que são muito, muito pequenas e existem diferentes tipos de microscópios. Então, deixe-nos passar com aqueles.(Consulte o Tempo do slide: 02:50)Então, o microscópio é uma ferramenta que é usada para observar o pequeno organismo ou objeto até mesmo as macromoléculas em um microscópio típico, o que você tem é você ter uma fonte de produção de luz por exemplo, neste caso você tem uma fonte de luz. Por isso, neste lugar você tem uma lâmpada, que na verdade foi feita de fora de tungeston. Por isso, em um microscópio simples, que na verdade este é um microscópio de luz, a luz é produzida por uma lâmpada com a ajuda da lâmpada tungeston como fonte e os raios de luz são focados no espécime pelo condensador.Então, a luz vem daqui e então ela é realmente focada com a ajuda do condensador e o espécime é mantido no palco e formado pelos clipes presentes de lado. Então, aqui você pode ser capaz de manter o espécime e então você pode manter o espécime formas com a ajuda da luz os clipes, a luz diffrada pela amostra é então coletada pela lente objetiva lente objetiva estar realmente na faixa de 10 100x o que significa, uma vez que a luz está sendo refletida pelos objetos ele realmente vai ser coletado pela lente objetiva.Essas lentes objetivas poderiam ser de 10x a 100x, o que significa, ele na verdade vai ampliar o objeto por um fator de 10. Mas há uma ampliação adicional é alcanada pela peça ocular que geralmente é pelo 10x. Por isso, caso você esteja olhando para uma amostra com o objetivo de 10x ele realmente vai te dar uma ampliação de 100x. Da mesma forma, se você estiver olhando para o objeto com 100x então ele vai realmente dar a ampliação total que é 1000x.Então, este é um microscópio simples um microscópio de luz onde você tem uma fonte de luz, esta fonte de luz vai ser focada pelo condensador e então este condensador realmente ilumina os objetos que foram ou a amostra de espécime que é mantida no palco. E uma vez que a luz é difrada da amostra ela é coletada pela lente objetiva e essas lentes objetivas podem ser de desconto de 10 100x e então a ampliação total o que você vai alcançar é pela ampliação pela lente objetiva, bem como pela ampliação pelo sobrado. Principalmente o sobrado são 10x so, você vai obter uma ampliação dos 10 em qualquer que seja a ampliação da lente objetiva.(Consulte o Tempo do slide: 05:43)Esta instrumentação poderia ser de 2 tipos diferentes ou você pode ter o microscópio vertical ou pode ter o microscópio invertido. No microscópio vertical o esquema geral permanece o mesmo, exceto que o objetivo que o turret onde você tem os objetivos estão sendo fixados é geralmente fixo e a imagem é focada pelo mover o estágio de amostra para cima e para baixo, o que significa em um microscópio vertical, os objetivos são permanecidos fixos.Considerando que a amostra você vai manter no palco e o estágio vai subir e descer com a ajuda dos knobs ajustados. Então, você tem um knob aqui que realmente pode ser girando no sentido horário ou anti no sentido horário e com a ajuda disso, este estágio pode ir para as direções para cima e para baixo e é assim que você vai focalizar as amostras, o que significa que o campo de profundidade vai ser menor no caso do microscópio upright e você não vai ter espaço suficiente para manter um grande tamanho objetivo.Por exemplo, no microscópio vertical você não estará tendo uma flexibilidade para manter as placas na maioria dos microscópios upright, você realmente vai manter apenas os slides só para poder visualizar os slides porque o espaço entre o objetivo fixo e o estágio em movimento vai ser muito estreito. Assim, você não pode ser capaz de manter as placas em comparação a isso você tem um microscópio invertido, o microscópio invertido o caminho geral da luz e tudo permanece o mesmo, exceto que em um microscópio invertido o estágio de amostra é fixo.Então, você vai manter a amostra em um estágio fixo e você vai ter o objetivo em movimento. Então, você pode imaginar que o que quer que o design que você tem, é exatamente o oposto no caso do microscópio invertido, e a turret objetiva está se movendo para cima e para baixo para focar a etapa final porque o objetivo é mover-se e você tem o estágio fixo não há problema de manter qualquer objeto incluindo os slides ou as placas sobre o topo do estágio pois a distância entre este e este permanece o fixo.Mas no topo do estágio você tem o espaço suficiente para manter o objetivo de qualquer espessura o que significa que você pode manter as chapas você pode guardar qualquer coisa e é por isso que o invertido microscópio é realmente útil para observar as células sob dentro dos laboratórios de cultura da célula, o que significa que você pode realmente utilizar o microscópio invertido para observar o arquivo de células eles estão se culpando naqueles pratos de cultura ou você pode realmente observar as células.Suponha que você mancha as células com alguma substância fluorogênica ou alguma tinta fluorogênica então você pode ser capaz de diretamente você sabe observar aquelas células sob o microscópio invertido enquanto que no caso do microscópio vertical, você pode ter que tirar essas células, então você monta ele no slide e então você pode ser capaz de observar porque a distância entre o objetivo e o estágio é muito estreita. Então, esta é a comparação de um microscópio de upright versus microscópio invertido tanto o microscópio tem sua própria vantagem quanto as desvantagens.(Consulte o Tempo do slide: 09:15)Além disso, você também tem os microscópios de fluorescência. Assim, conforme a fonte de luz, você pode ter o microscópio de luz ou o microscópio de fluorescência em um microscópio de fluorescência ou em um microscópio de epifluorescência, a eliminação do espécime bem como a coleta de uma luz fluorogênica é obtida pela lente única. Assim, você pode ver que este é um típico microscópio de fluorescência. Portanto, trata-se de um microscópio de fluorescência ereta.Onde você tem o estágio que realmente pode ser este é o estágio que realmente não é fixo o que realmente pode ir para cima e para baixo com a ajuda dos knobs ajustados que estão presentes aqui. E estes são, na verdade, o turret sobre o qual o objeto está sendo colocado. Então você pode manter um slide ou você pode manter o espécime aqui e então você tem os clipes com a ajuda dos clipes, você pode ser capaz de consertar sua amostra aqui. E então o que se vê é que se você tem uma fonte de luz e através de fonte de luz.A partir dessa fonte de luz, a luz vem daqui, e então ela realmente elimina as amostras. E, porque o usuário vai estar neste site, é por isso que se haverá alguma luz diffrada vinda da amostra, para proteger o usuário, eles também têm um escudo para que ele não vá diretamente para o usuário. Então em um típico esquema de luz, o que você tem é que você tem uma fonte de luz, que de fato vai te dar luz do comprimento de onda mais amplo, e então você vai ter o filtro de excitação.Então, como você sabe que a fluorescência em um fenômeno de fluorescência o que você tem que fazer é ter que excitar as amostras com um comprimento de onda de excitação, e então a amostra vai emitir um comprimento de onda que vai emitindo uma luz, que vai ser de um comprimento de onda maior. E então esse comprimento de onda tem que ser coletado com um filtro de emissão, e então que você pode ser capaz de visualizar com a ajuda dos diferentes tipos de objetivos assim como o globo ocular.Então o que vai acontecer é que você tem uma fonte de luz, que de fato vai dar uma luz do comprimento de onda mais amplo, então você pode realmente focar que com a ajuda do filtro de excitação. E, então, a partir do filtro de excitação, a luz irá desde que a luz se vai, e então ela vai sendo atingida por um espelho dichroico, porque a luz vai ser de um comprimento de onda alto, ela realmente vai refletir e ir eliminar amostra agora da amostra, a luz vai ser produzida.Então esta luz, o que se vê é uma luz de cor vermelha vai realmente ter a emissão de lambda. Assim, a emissão de lambda vai estar fora de um comprimento de onda maior. Por isso, uma vez que o comprimento de onda mais alto vai, ele realmente volta a ser atingido pelo espelho dichroico. E por este tempo, em vez de ir se refletir, na verdade vai direto. E aí você realmente vai ter o filtro de emissão. E esse filtro de emissão volta a se filtrar, quaisquer que sejam os comprimentos de onda que estão vindo da amostra, e então ele vai realmente mostrar a você a luz do seu comprimento de onda desejado.E é assim que ele realmente irá para o usuário observador. Então, isso é realmente ir para a câmera que na verdade foi colocada aqui. Mas se você usa esse knob e você muda o campo de visão, ele realmente pode ir para o sobrado, e é assim que você pode ser capaz de observar esses deslizes de fluorescência. Então, esse desvio da luz com a ajuda de um espelho dichroico só é possível porque o espelho dichroico é em grande parte reflexivo para a luz abaixo de um comprimento de onda de limiar e um transmissivo para uma luz acima daquele comprimento de onda particular para espelho dichroico é um espelho especial.O qual realmente reflete uma luz quando o comprimento de onda é de uma visão inferior. Por isso, ele realmente reflete essa luz, e então é assim que a luz refletida vai e atingiu a amostra, mas quando um comprimento de onda maior sai da amostra, então para aquele comprimento de onda particular, o espelho dichroico é transmissivo. Então, ele realmente permitiu a transmissão dessa luz particular e que assim, ela realmente é voltada novamente pelo filtro de emissão ou ela é filtrada por um filtro de emissão.Sobre isso é como ele vai para dentro do globo ocular ou para a câmera CCD para coleta da imagem. A análise de microscópios de imunofluorescência do marcador de superfície celular é uma direta enquanto que as células são tratadas com os anticorpos fluorescentemente rotulados e estudados sob os microscópios. Assim, porque você pode ser capaz de iluminar a amostra com um comprimento de onda fixo padrão e você pode ser capaz de adquirir a luz da amostra com a ajuda destes comprimentos de onda fixos, você pode ser capaz de utilizar o microscópio fluorescente.Se você marcar as células com um anticorpos fluorescentemente rotulado. Assim, que você pode fazer simplesmente pelo colorido das células com ele fluorescentemente rotulados de anticorpos ou para as sondas de etiquetas fluorescentes.(Consulte o Tempo do slide: 14:24)Então, você pode imaginar que você tem células de mamíferos e apenas me dê um exemplo de uma célula de mamíferos como você pode ser capaz de realizar estudos de Immuno-Localização, mas que pode ser replicado ou que pode ser feito com poucas modificações mesmo para a célula vegetal assim como as células (()) (14:43) ou para as células bacterianas. Então em uma célula vegetal, o que você tem é você tem os diferentes tipos de organelas como o núcleo, você tem as mitocôndrias, você tem a mitocôndria, você tem a membrana do plasma então você tem os corpos Golgi e todo esse tipo de coisa.Então, e todas essas moléculas estão realmente sob o equilíbrio dinâmico, o que significa que não há lugar fixo para uma mitocôndria permanecer ali ou não há lugar fixo para o outro tipo de organelas, pois todas essas organelas estão suspensas dentro do citosol e elas estão se mantendo movendo-se dentro da célula. Então, para se você gostaria de fazer um imuno-localizações a primeira coisa, o que você tem que fazer é ter que parar o movimento do self.E esse vai ser o primeiro passo, se você está interessado na localização imunológica, isso significa que o primeiro evento o que você tem que fazer é, você tem que parar o movimento das macromoléculas biológicas. E não só as organelas, as macromoléculas também estão livremente se movendo, por exemplo, dentro das mitocôndrias, você tem as cadeias de transporte de elétrons, mas as outras moléculas como as enzimas dos ciclos e tudo o que realmente se move livremente no interior das mitocôndrias. Por isso, se você está interessado em localizar essa enzima particular.Ele pode realmente se movimentar você sabe, mudar de localização ou ele realmente pode mudar sua posição. Então, por exemplo, se eu estou localizando uma enzima, e ela é localizada aqui na hora x, depois de 10 minutes, ela poderia ser localizada em algum lugar aqui na verdade. Então, isso na verdade é muito, muito problemático, pois se você estiver informando que, a molécula particular é localizada à membrana do plasma, e então depois de 10 minutes, ela pode realmente porque está sob o equilíbrio dinâmico com o citosol, a molécula pode ir para os próximos locais.Então, é por isso que é importante que primeiro você pare o movimento das organelas, assim como o movimento da molécula macro o que está presente dentro da célula. Então, que você realmente vai fazer ou ir fazer com a ajuda de procedimento ou o protocolo chamado fixação. Uma vez que você fixou as células, então as células vão realmente cessar sua atividade biológica, ela realmente vai morrer e então todas essas organelas vão realmente ser transversais ligadas pelos diferentes tipos de fibras e que são todas as moléculas vão ficar como uma situação fixa.O que significa que eles não vão ser autorizados a se mover para que você consiga ver a localização sob as situações fixas, há condições eram na verdade você pode fazer a localização mesmo sob as condições da lifecell, mas essas são condições diferentes e há a maneira diferente em que você pode ser capaz de fazer isso, já que você é feito que então você tem que fazer o caminho porque sabe que as células não são permeáveis para os anticorpos, o que significa que os anticorpos não podem entrar nas células.Porque as células de mamíferos ou as células vegetais ou mesmo as células bacterianas são apenas permeáveis para as moléculas hidrofóbicas assim como as moléculas pequenas, mas elas não são permeáveis para as moléculas maiores como anticorpos para fazer a parte para os anticorpos que é o segundo passo o que você tem que fazer. Por isso, na segunda etapa, é preciso fazer o caminho para que o anticorpo entre na célula e que esteja sendo feito com a ajuda de uma etapa chamada permeabilização.Agora, uma vez que você permeou as células, você realmente vai fazer as trilhas dentro da célula o que significa usar essas vias ou usar esses caminhos, usar os anticorpos pode entrar mas uma vez que o anticorpo vai entrar na célula, ele não vai interagir apenas com o antígeno do seu interesse também vai interagir com todas as proteínas o que está presente na célula. Então, para evitar isso,você também tem que esconder os sites não antigênicos e que você tem a ver com a ajuda do bloqueio. Então, uma vez que você tenha feito com a permeabilização e bloqueio de fixação.Então você está realmente pronto para estamir as células de mamíferos com as primárias, assim como os anticorpos secundários. E depois, depois disso, você tem que fazer as observações significa que você tem que ver as células. Assim, por observar as células, é preciso fazer novamente um procedimento que é chamado como a montagem o que significa que você tem que montar as células em um deslize de tampa e então você pode manter a tampa desliza sob o microscópio e então você pode ser capaz de visualizar ali é uma possibilidade que você pode realmente utilizar o microscópio invertido e então você não precisa fazer uma montagem.Mas nesse caso também você pode ter que manter algumas soluções. De modo que a amostra não deve ser destruída quando estiver ficando iluminada com um feixe alto da luz fluorescente ou alto feixe da luz que está vindo da fonte. Por isso, vamos discutir todas essas etapas em um mais detalhado.Então, esta não é uma regra fixa que você faz para 15 minutes, ela pode ser otimizada. Em alguns casos as pessoas não usam o BSA, usam a alguma solução de proteína mais complexa por exemplo, você pode usar o soro você pode usar as outras fontes de proteína também, pois o BSA é proteína muito simples. Então, pode realmente não ser capaz de você saber te dar o bloqueio muito bom comparado a isso se você usar o soro e outro tipo de amostras biológicas complexas.E é assim que você realmente otimiza, para que você obtenha a coloração específica para o seu antigénio de interesse, mas ao mesmo tempo bloqueia o sinal não específico para reduzir os antecedos. Depois, depois disso, você vai fazer uma coloração primária tão incubada a amostra com o anticorpo primário principalmente 1 é para 50 diluições em um PSA de 2% para durante a noite em 4 grau ou você pode fazer uma 1 hora a 37 graus Celsius, a coloração primária em baixa temperatura está reduzindo o sinal de fundo e dá a boa coloração para amostra.Considerando que, a coloração em temperatura ambiente dá mais quantidade de sinal não específico. Por isso, quando você faz a coloração primária, a coloração primária tem que ser feita com a ajuda do anticorpo primário o que você desenvolveu no coelho ou mouse ou o que quer que tenha realmente comprado da empresa e que tenha que fazer como uma consulta de 1 é para 50. Então, este énão fixo que você faz uma consulta de 1 é para 50 diluições você pode ter que otimizar isso e depende do titer de anticorpo desse antigénio particular.Porque se o titer do anticorpo é muito alto, então você pode até mesmo se dar ao luxo de ir até 1 ou 1 é para 500 mas se o titer de anticorpo é muito baixo, então você tem que ir com o 1 é para 100 1 é para 50. E o outro ponto é que você tem que fazer o imunoscontendo a uma temperatura muito baixa para que você consiga parar as interações de nonstick, pois a uma temperatura baixa, na verdade você está apenas permitindo que o anticorpo interaja com os antígenos específicos e você é realmente você sabe, evitando a interação não específica.Considerando que, se você estiver rapidamente deseja testar o protocolo, você rapidamente quer testar se o anticorpo está manchando meu antígeno ou não, então você pode fazer a 1 hora 37 graus Celsius que realmente vai dizer se o anticorpo que você desenvolveu é bom o suficiente para fazer o imuno-localização na célula ou não, mas acaba por dar-lhe um background muito elevado. Então, uma vez que você tem certeza de que realmente vai dar a boa coloração.Então você pode realmente realizar o mesmo experimento sob o em baixa temperatura a 4 graus Celsius. Você pode fazer então a lavagem do anticorpo primário precisa lavar para reduzir o sinal de fundo e a amostra é lavada com o 2% BSA preparado na PBS. Por isso, a etapa de lavagem também é um passo onde você realmente pode fazer alguma quantidade de otimizações. Para que você possa ser capaz de reduzir o sinal de fundo enquanto mantém o seu interesse de seus sinais.(Consulte o Tempo do slide: 34:42)Agora uma vez que você é feito com a lavagem, então você pode fazer uma coloração secundária. Por isso, incubar a amostra com um anticorpo secundário principalmente em um 1 é de 500 em um 1 é para 500 de diluição em 2% PSA para durante a noite ou a 1 hora para 37 graus Celsius então você vai fazer uma lavagem. Por isso, a etapa secundária de lavagem precisa lavar para reduzir o sinal de fundo e a amostra é lavada com 2% BSA preparada em PBS, então o último passo é a montagem a amostra é sensível à perda de água e necessidade de preservar em uma mídia de montagem contendo glicerol.Além disso, o sinal de fluorescência é sensível ao feixe de laser de alta energia e ele requer proteção adicionando agentes anti-fading. Por isso, quando você está fazendo uma montagem já que neste caso estamos fazendo a imunofluorescência e a fluorescente a instância de luz é muito brilhante os pés realmente podem saciar o seu sinal o que significa, ele realmente vai para você saber iluminar a farinha de 4 a um feixe tão alto que ele eventualmente em vez de te dar a luz ele realmente vai destrui-lo e este fenômenos é chamado como o quenching.O que significa, se você está iluminando uma determinada biomoléculas ou se você está eliminando uma sonda com um feixe de energia muito alta, então, em vez de dar a conhecer a fluorescência, na verdade está ficando oxidado com a ajuda dessa alta energia e é assim que ela realmente vai ser destruída. Por isso, para evitar que você também tenha que montar a amostra com a ajuda de agentes anti-fading. Por isso, agentes anti-fading são a amostra ou os agentes antifading são o composto que realmente tonificou o sinal.E ele realmente absorve de qualquer que seja o calor extra o que está presente naquele feixe de energia elevada. Então, por causa disso, ela realmente permite que a amostra permita que a sonda fique iluminada ou a farinha o que você adicionou para ser iluminada, mas não permite que a energia extra seja adquirida pelo chão para que ela seja atenuada. Por isso, um dos agentes antifading clássico é chamado como o PPD ou o pará fenilenodiamina e o pará fenilenodiamina vai realmente proteger a amostra de obter o quench.Então, você pode realmente misturar o PPD em uma mídia de montagem e ele é pode ser usado para montagem de amostras fluorescentes. Então, você pode imaginar que, se você tiver uma amostra em uma tinta fluorescente em uma amostra e tiver um coverslip assim, o que vai acontecer é o PPD realmente vai se apresentar em toda essa amostra e é assim que ele realmente vai absorver luz extra o que você está realmente usando para iluminar a amostra e ela está apenas permitindo que ela seja apenas como você conhece filtro. Então, ele realmente reduz a intensidade e ele reduz a energia extra, mas na verdade permitiu que o fluxo para lhe dar a fluorescência em vez de ser atenuado.(Consulte o Tempo do slide: 37:46)Agora esta é uma observação e visualização típica. Por isso, a amostra é fixada no estágio do microscópio e depois você observa sob a luz brilhante para verificar a morfologia celular girando o botão de focalização. Então, esta é a imagem de luz brilhante e se a amostra é morfolgica é boa, então ela pode ser observada sob os canais de fluorescência. Então, o que se pode ver é que eu estou observando o mesmo slide sob o canal de fluorescência e assim, todas as células estão me mostrando um sinal fluorescente e ele está me mostrando um sinal fluorescente e ele está realmente me mostrando um sinal fora do antígeno.Se eu for com as maiores ampliações e se eu for com o número mais elevado de fluorescente por exemplo, se eu usar suponha que eu esteja interessado em ver se a proteína do meu interesse está presente nos corpos das mitocôndrias ou lisossomos e Golgi e tudo isso, então o que eu posso fazer é eu posso estamir essas células com a determinada sonda específica organelas como bem por exemplo, eu posso usar o vermelho mitotracker, então nisso e eu posso usar o corante fluorescentemente como o verde.Então, o que vai acontecer é se eu o fizer, e se vejo uma co localização do verde em vermelho, então que realmente se vai provar que a proteína do meu interesse está presente no núcleo, quero ver se a proteína do meu interesse está presente no núcleo, então o que eu posso fazer é apenas mancir as células com uma corante nuclear por exemplo, posso usar o (()) (39:14) ou posso usar o iodeto de propídio e ou o accretar laranja e que na verdade vai estampar o núcleo.E se eu ver um co localização o que significa se eu vejo uma superposição dos 2 sinais, então eu direi que minha proteína de interesse está presente dentro do núcleo. Na verdade, você pode realmente até aperfeiçoar sintonia você pode realmente ir mais para baixo e dizer, se a minha proteína está interagindo com a cadeia de transporte de elétrons de você conhece as mitocôndrias ou não. Por isso, se eu fizer um imunoscontendo o mesmo procedimento se eu fizer imunostenção para o algum do complexo é o que está presente na cadeia de transporte de elétrons. E se eu faço proteína do meu interesse com alguma outra enzima.Então, o que eu posso fazer é eu posso usar um anticorpo com o verde eu posso usar o anticorpo com vermelho e se eu ver uma sobreposição de sinal, o que significa onde quer que o verde esteja presente o mesmo lugar você pode ver um sinal vermelho. Então, essa é uma maneira que realmente vai dizer que estou mostrando a co localização desses 2 sinais, o que significa que minha proteína está realmente presente muito perto das cadeias de transporte de elétrons, você se lembra que estes são os sinais fluorescentes.Então, eles têm esses, não vão dizer se até onde eles estão, mas vão estar no intervalo de 10 às tempestades 50x que é tudo o que é de fato vai dizer que eles estão muito próximos por se você quer ser muito pinpoint e quer dizer bem, o quão perto eles estão, então você pode realmente ser capaz de usar microscopia de resolução muito alta também. Nesse caso, você pode realmente fazeruma localização com a ajuda da cadeia de transporte de elétrons com a ajuda da microscopia eletrônica.E que na verdade vai te dizer com muita precisão até que ponto essas 2 proteínas estão presentes dentro das cadeias de transporte de elétrons que de qualquer maneira vamos discutir em uma subsequente palestras. Por isso, vejamos como você pode ser capaz de utilizar a microscopia de fluorescência para entender os alguns dos fenômenos biológicos.(Consulte o Tempo do slide: 41:23)Então, um dos fenômenos biológicos básicos é chamado como fagocitose. Por isso, a fagocitose sempre é feita pela maioria das células imunes em especialmente como macrófagos. Então, o que acontece é que, quando os macrófagos estão sendo encontrados uma bactéria Então, suponhamos que esta seja uma bactéria, então, se os macrófagos são encontrados que isso existe uma bactéria e assim, a fagocitose significa essa alimentação pela célula, o que significa que a célula vai comer ou Ingles, essas partículas particulares, então, o que supor, isso é uma macrofagia e esta é uma bactéria.Então, incuba a placa por 1 hora 37 graus Celsius. Assim, 1 hora é boa o suficiente para o self to fagocytose as partículas. Se você quiser fazer um curso de tempo então você pode realmente tirar os pratos, você pode tirar as aulas de covers em vários pontos de tempo. E é assim que você pode ser capaz de apenas colocá-los em uma solução fixadora e é assim que você pode ser capaz de interromper o processo de fagocitose. Portanto, se você quiser fazer um curso de tempo, você pode fazer isso também.Lavar o poço com DMEM de 1 ml sem FBS para remover as células não inicializadas e então você fixar a amostra biológica com a mistura de metanol acetona a 20 graus Celsius, você hidrata a amostra com 1x PBS para que ele adquira a morfologia de volta então você mancha as células com Filipin por 1 hora a 37 graus Celsius em escuro. Como eu disse que você sabe Filipin é um corante fluorescente então ele realmente vai dar a você a fluorescência e é assim que ele é realmente suscetível para você conhecer a luz.Então, você tem que fazer todas essas declarações sob o escuro ou você pode realmente cobrir a amostra com a folha de alumínio mantenha uma gota de mídia de montagem contendo o agente antifading como BPD na tampa da tampa e mantenha os óculos cobertos nele formados os óculos de tampa fazendo o aro grosso pelo esmalte. O que isso significa é que quando você tem um slide de capa, você fica com o vidro da tampa e depois em cima disso você tem que manter uma espuma espessa do esmalte para que ela realmente permaneça forma sobre aquele lugar em particular que ele não deve não deve se moviar. Agora sua amostra está pronta para visualizacoes.(Consulte o Tempo do slide: 52:53)E o que você verá é uma fagocitose típica de bead será representada pela aparência de um bead em um rosto e o mesmo bead com um cerceamento por uma fluorescência o que significa que você vai ver um encéfalo da fluorescência por exemplo, neste caso, o que se vê é que há um bead que esteve presente sobre a célula e o mesmo bead está realmente tendo a cor azul fluorescência em torno dele o que significa que estas beadas são internalizadas pelos macrófagos.Então, isso tudo é sobre a utilização de o microscópio fluorescente há muito mais experimentos o que podemos realmente discutir e a forma como o microscópio fluorescente pode ser usado em uma das abordagens o que também podemos fazer é podemos realmente estudar a interação das proteínas com as outras proteínas com a ajuda do você conhece a dupla etiquetagem da célula. Então, isso de fato dirá se essas 2 proteínas estão presentes quando estão no mesmo compartimento se estão interagindo umas com as outras ou não.Então, há muitas aplicações uma o que quando se pode fazer há muitos tipos de experimento pode-se realmente projetar com a ajuda do microscópio fluorescente. Mas, com isso, eu gostaria de concluir minha palestra aqui. Obrigado.