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Fracionação de Cells
Olá, todo mundo este é o doutor Vishal Trivedi do departamento de biociências e bio engenharia IIT, Guwahati. E o que estávamos discutindo na palestra anterior é sobre o crescimento, assim como a propagação da célula procariótica, assim como a célula eucariótica. Por isso, nessa palestra também discutimos sobre os diferentes tipos de mídia e assim como o componente de mídia, o que você exige para crescer com sucesso, assim como manipular as células. Por isso, na palestra de hoje ’ vamos discutir sobre a fracionamento das células. Então, o que temos discutido na palestra anterior é que.(Consulte o Tempo do slide: 01:03)Nós discutimos sobre os diferentes tipos de células.(Consulte o Tempo do slide: 01:44)Então, discutimos sobre a célula procariótica, discutimos sobre a levedura e os fungos que estão realmente dentro da célula eucariótica assim como discutimos sobre a célula vegetal assim como as células animais. Então, quando você tem os diferentes tipos de células, essas células são realmente são muito, muito complexas em estruturas. E você pode estar em algum momento interessado em explorar uma determinada molécula ou substância particular de um determinado local daquela célula específica.Por exemplo em alguns casos você pode estar interessado em ver a molécula que está presente na membrana de plasma de uma célula procariótica ou você está procurando por uma molécula que esteja presente dentro do citosol de uma célula procariótica. A situação fica cada vez mais complicada quando falamos da célula animal, assim como da célula vegetal. pois em comparação com a célula procariótica que realmente possui um único corpo celular onde você não tem as múltiplas organelas, exceto a membrana de plasma e o citosol.Além disso você também tem as frações periplasmáticas mas além de estrutura muito simples a célula eucariótica realmente oferece muitas mais complicações. Por exemplo você tem o núcleo, você tem os diferentes tipos de organelas como retículo endoplasmático, mitocôndria, lisossomos, corpos de golgi e todo outro tipo de organelas. E, além disso, quando falamos das células vegetais, as plantas também são contém a parede celular assim como a membrana do plasma e todos os outros tipos de organelas cloroplast, nucléolo resposta.Então, quando se procura o isolamento de um determinado fator da região particular de uma célula se ele é pertencente a uma mitocôndria ou cloroplastia ou retículo endoplasmático ou lisossomos, as coisas se tornam cada vez mais complicadas. Por isso, na palestra de hoje ’ vamos discutir sobre como fracionar a célula procariótica assim como uma célula eucariótica para isolar a proteína de seu interesse de uma determinada célula organela ou de uma parte da célula. Assim, iniciaremos com a célula procariótica.(Consulte o Tempo do slide: 04:02)Então, em célula procariótica, você tem então esta é uma célula bacteriana típica onde você tem a membrana de plasma e fora da membrana de plasma você tem uma parede celular. E esta é uma flagela que realmente permite o movimento de uma célula procariótica típica. E dentro da parede celular o que você tem é você tem a duas camada uma é a camada mais externa e então você tem a camada interna e na entre a camada mais externa assim como a camada interna você tem um espaço que é chamado como espaço periplasmático.Então, o que se vê aqui é a distribuição dos diferentes tipos de proteínas o que está presente dentro da célula bacteriana. Por isso, o que se vê é que nas frações periplasmáticas você tem os 129 tipos diferentes de proteínas onde algumas proteínas são de alto peso molecular e algumas proteínas são de baixo peso molecular. Da mesma forma você tem a membrana externa onde você tem os 50 tipos diferentes de proteínas, 9 proteínas só são pertencentes a uma proteína de alto peso molecular.Então algumas das proteínas são extracelulares na natureza, o que significa que elas vão ser secretadas da bactéria e elas estarão presentes na mídia daquela cultura em particular. Em seguida, você tem a membrana interna e assim como o citoplasma. Por isso, o grande pedaço da proteína está sempre presente dentro do citoplasma. E você tem as duas região que são de seu interesse isolar a proteína, uma é a fração periplasmática e a segunda são as frações citoplasmáticas.Então, a primeira nós vamos discutir sobre as frações periplasmáticas. E lembre-se, a fração periplasmática significa, a fração que está presente dentro da camada mais externa assim como a camada interna. Assim, a região que está presente entre a camada externa e a camada interna é chamada como região periplasmática e essa região é sempre utilizada pela bactéria para armazenar as proteínas para ou, às vezes, elas também utilizam essa proteína para dentro dessa frações periplasmáticas. Às vezes, eles também usam as proteínas para mesmo sequester as drogas e os complexos relacionados.E a fração periplasmática é muito importante mesmo em supor que você gostaria de usar a bactéria para fins de expressão porque a fração periplasmática está dando um ambiente adequado para a dobragem adequada da proteína. Por isso, em alguns casos o que acontece é que você está realmente colocando uma sequência de sinalização ou está colocando uma sequência de localização em sua proteína de seu interesse. E como resultado a proteína está entrando na fração periplasmática. Por isso, vejamos como você pode ser capaz de isolar a fração periplasmática da bactéria.(Consulte o Tempo do slide: 06:50)Então, a fração periplasmática primeiro você tem que colher a célula bacteriana pela centrifugação no 3000g por 20 minutes minutos a quatro graus Celsius. Por isso, lembre-se que o isolamento de fração periplasmática é um muito, muito sensível para as proteínas que é o motivo pelo qual a maior parte desses procedimento tem que ser realizada em 4 graus. Porque a única vez que você isola as bactérias e quando você vai se quebrar e você gostaria de isolar as frações periplasmáticas, as todas as proteases e todos os outros tipos de maquinaria degradante de proteína vai ser ativado nesse processo.É por isso que todo o procedimento tem que ser realizado em 4 grau. Por isso, na primeira etapa, você vai colher a célula bacteriana por centrifugação em 3000g por 20 minutes minutos a 4 grau Celsius. Uma vez que você tem o pellet bacteriano, então você vai descartar a mídia e então você vai remover cuidadosamente a última gota de líquido, de modo que você não vai sugar as células bacterianas.Então as pelotas bacterianas você está suavemente suspende em um ml de tampão TSE usando um laço de fio e então você incuba essa mistura em no gelo por 30 minutes. Por isso, nesta incubação em particular o que vai acontecer é que a bactéria vai se escancarar e na verdade vai dar-lhe as frações periplasmáticas. Então o que você tem que fazer é ter que transferir as células em uma micro centrífuga e centrifugação no 16 ,000g que é a velocidade máxima no microfuge por 30 minutes minutos a 4 graus Celsius.Então você transfere o sobrenadante para um novo tubo de centrifugação, este sobrenadante constitui o extrato do envelope bem como as frações periplasmáticas. Portanto, neste protocolo específico, o que fizemos de fato é que realmente demos um choque de calor demos o choque osmótico para a célula bacteriana após remoção da parede celular e nesse processo, a fração periplasmática é retirada da bactéria ou a proteína o que está presente nas frações periplasmáticas são extraídas.Então, o que se vê é que primeiro você colheu as células, então você já incubou a célula em um tampão do TSE e que na verdade é bom o suficiente para dar-lhes um choque. E então você está realmente centrífuando isso, para que o sobrenadante vá conter as frações periplasmáticas e o pellet vai conter a outra parte da célula.(Consulte o Tempo do slide: 09:26)Além disso você também pode fazer o isolamento das frações citosólicas. Por isso, não há uma maneira especial de fazer as frações heteroplasmáticas isoladas. O que você tem que fazer é, você tem que tomar as células bacterianas, e então já que a célula bacteriana não contém as organelas, o isolamento da fração citosólica é muito fácil. Porque o que você tem que fazer é ter que tomar as células bacterianas, então você tem as múltiplas opções como através das quais você pode realmente quebrar as células.Então, é preciso primeiro quebrar as células com a ajuda dos diferentes tipos dos métodos de disrupção celular. Por isso, há método mecânico, existem os métodos enzimáticos e há os métodos físicos. Por exemplo, você pode usar o termo liso lysine você pode tirar a fragilidade osmótica você pode tirar a ajuda dos detergentes. Caso você esteja procurando apenas para preparar o liso celular você não está interessado em isolar a proteína ativa.Mas se você estiver interessado em isolar a proteína ativa, você pode até mesmo usar os métodos mecânicos como você pode usar a homogeneização, você pode usar os outros tipos de métodos mecânicos. E como resultado o que vai acontecer é que na verdade vai dar a mistura de celular como onde ele realmente vai conter as células self e mais o sobrenadante. E então o que você tem que fazer é ter que centrifugar essa mistura no 16 ,000g por 20 minutes.E como resultado você vai receber 2 frações, você vai pegar as frações de pelotas, você vai receber as frações sobrenadantes. Esta fração de pallet só vai conter as células quebradas e que você pode realmente descartar. Porque esta células quebradas assim como estas vão realmente ter a parede celular e todos aqueles outros tipos de material enquanto que no sobrenadante você realmente vai ter as frações citosólicas.Então, esta é a maneira como você pode realmente ser capaz de fracionar as células bacterianas ou pode-se isolar a fração periplasmática ou pode isolar as frações citosólicas.(Consulte o Tempo do slide: 11:56)Agora comparada à célula procariótica que na verdade é muito simples e onde você não tem as múltiplas organelas, o isolamento das proteínas das diferentes organelas ou mesmo dentro a presença de citosol é muito, muito complicada quando se fala da célula eucariótica, por exemplo você está falando da célula animal ou para as células vegetais.Então, no caso de célula vegetal você vai ter o problema de parede celular que na verdade vai ser quebrado. Então somente você pode ser capaz de acessar a membrana do plasma, você pode ser capaz de acessar as organelas. Considerando que no caso da célula animal o que de fato vai ser muito, muito sensível para qualquer tipo de tratamento. Você tem que ser muito, muito cuidado com a fragilidade osmática e você sempre tem que ser muito sensível sobre o.Não deve haver nenhuma alteração na osmolaridade das soluções porque assim que você altera a osmolaridade de uma solução e as células de mamíferos estão presentes. Isso mesmo vai quebrar as células que eles também podem perturbar a distribuição geral da proteína dentro da organela também. E como resultado você não vai obter a boa recuperação de sua proteína a partir de uma determinada organela.Por exemplo, se você estiver interessado em isolar a proteína das frações mitocondriais mas por engano se você adicionar a quantidade de água ok. Então, o que vai acontecer é a água vai quebrar a membrana do plasma que vai ser a primeira barreira e depois vai mesmo destruir a membrana mitocondrial também. E afinal o que vai acontecer é que a recuperação da sua proteína particular vai ser muito, muito menos.Então, é por isso que temos que ter muito cuidado quando estamos manipulando as proteínas eucarióticas porque elas são muito sensíveis para diferentes tipos de tratamento o que você vai realizar durante o curso de diferentes tipos de experimentos ou quando você realmente vai isolar as diferentes proteínas dos diferentes locais da célula.(Consulte o Tempo do slide: 14:13)Então, dentro da célula eucariótica majormente você tem as múltiplas opções como você tem os locais como plasma membrana, você tem a mitocôndria, você tem o cloroplastro, você tem o citosol. E, fora isso, você também no caso das plantas, você pode ter o cloroplasto e você pode ter a parede celular também. Então, como fracionar isso porque assim para entender o fracionamento primeiro você tem que entender o ressalto dos instrumentos e assim como o princípio.E aí nós íamos discutir sobre o fracionamento da célula eucariótica e como você pode ser capaz de isolar as diferentes organelas e até mesmo como você pode ser capaz de isolar a proteína daquelas organelas.(Consulte o Tempo do slide: 15:08)Então, para as fracionações, você pode ter que exigir os diferentes tipos de centrífugas. Então, este é o microfuge que na verdade é centrífuga de velocidade muito baixa então você tem a centrífuga de alta velocidade de alto volume. Na verdade também pode ir para o grau de 4, assim como pode chegar a 37 graus Celsius. E então esta é a centrífuga de alta velocidade, esta é a centrifugação o que você usa para fins de cultura celular.Porque também pode ter a flexibilidade de colocar os diferentes tipos de rotores como você pode ter os rotores de ângulo fixo ou você pode ter os rotores de placas. E esta é a centrífuga o que você tem é chamado como a ultra centrífuga porque ela realmente pode ir até as velocidades ultra altas e ela realmente pode ir até mesmo até a um lakh g de fato. Então, isso realmente é necessário para isolar os diferentes componentes da célula.Este é um rotor típico o que você usa em uma ultracentrifugação quando você está usando e esses rotores na verdade são feitos com um metal muito, muito forte. Então, que quando eles estão girando em uma velocidade muito, muito alta, ela realmente resiste a esse tipo de pressão alta.(Consulte o Tempo do slide: 16:30)No que diz respeito à centrifugação, a centrifugação pode ser feita de duas maneiras ou você pode fazer uma centrifugação diferenciada ou para a densidade gradiente de centrifugações. O princípio básico ou o princípio sublinhado da certificação continua o mesmo. E acho que você se lembra de quando falávamos sobre a manutenção assim como o funcionamento da centrífuga temos discutido sobre o princípio básico.Então, o princípio básico é que quando você está girando um objeto em torno do eixo, ele realmente experimenta as duas forças, as forças centrípetas que na verdade está em direção ao eixo e as forças centrífugas que na verdade está afastado do eixo. Então, se você está realmente girando um objeto e em torno de um eixo, então, o que vai acontecer é você vai ter a força centrípeta em direção ao centro do eixo, onde como você vai experimentar a força centrífuga que está longe do eixo.Então, você pode imaginar que se você manter esse objeto em um eppendorf ou em um tubo este objeto tentará mover-se para este lado mas este objeto está presente em um líquido. Então, esse líquido vai realmente se opor ao movimento desse objeto. Então, o que vai acontecer é quando o objeto estiver tentando se afastar do centro por causa da força centrífuga que na verdade vai ser F 3, ele realmente vai ser oposto por 2 forças um é chamado como as forças de sustentação.Então, que você pode imaginar que FB e então você também pode ter as forças friccionais porque quando a molécula está se movendo para através do material viscoso ele realmente vai experimentar 2 coisas, uma é a flutuabilidade. Por causa da densidade da molécula e de outra é o atrito porque a molécula tem algum tamanho. Então, a F 3 vai realmente igual ou maior do que em ambos os casos.Então, F3 pode ser igual a no caso de F B + F F F Quando você estiver falando sobre as centrifugações gradientes de densidade, a F 3 vai ser maior para o F B mais o F F. Porque nesse caso o que vai acontecer é o F 3 vai empurrar este objeto em direção ao final deste tubo. E afinal o que vai acontecer é que porque o tubo é fechado da extremidade inferior o objeto vai e forma a pelagem.Então, se ele está viajando e ele está viajando porque as forças opostas estão muito, muito menos. Aí o que vai acontecer é que esse objeto chegará até o final deste tubo e ele realmente vai ser pelado para baixo. Então, este é o princípio básico da centrifugação no que diz respeito à centrifugação diferencial assim como a centrifugação gradiente de densidade. Ambas as centrífugas estão realmente utilizando as forças centrífugas assim como elas estão explorando o tamanho assim como a densidade do material particular.(Consulte o Tempo do Slide: 20:04)Então, é por isso que a sedimentação de um determinado objeto é depende do tamanho, forma e densidade diferentes. Então, você pode imaginar que se você tem uma molécula ou tamanhos diferentes assim como as densidades. E se você começar a fazer as centrifugações o que vai acontecer é que as moléculas que são de grande porte que significa de alto peso molecular vão ser peludes para baixo primeiro, então você vai ter o objeto de tamanho médio.E então você vai ter o objeto de tamanho pequeno e no topo você vai ter o solvente que significa a centrifugação diferencial está realmente explorando os 2 fenômenos. Um é o tamanho do objeto e o segundo é a densidade desse objeto em particular porque estes são o parâmetro de 2 que realmente vão decidir em que velocidade de centrifugação eles vão realmente superar as forças de sustentação assim como as forças friccionais, de modo que serão peleadas para baixo.(Consulte o Tempo do slide: 21:14)Então, você pode entender que com a coisa simples que suponhamos que temos os diferentes tipos de objetos. Por exemplo você tem um ferro que é de 100 kg, você pode ter esta pedra que é de 30 kg, você pode ter outro bloco de ferro que é de 10 kg e você pode ter a pedra que é de 10 kg. E então no final você também tem o algodão que é de 8 kg e você tem outro bloco de ferro, que é de 1 kg.Então, lembre-se que você sabe que o ferro é a maior densidade e o so isto é ferro, certo. Por isso, o ferro está realmente tendo a maior densidade, enquanto que a pedra vai ter a densidade média e o algodão vai ter a menor densidade. Então, quando você realmente vai pegar essa misturae você vai girar o que vai acontecer é que independentemente de seu peso significa independentemente de serem 100 Kg, 10 kg ou 1 kg o ferro vai ser pelado no fundo.Então, vai ser na verdade a partícula mais pesada e então a pedra vai ser pelada mais tarde e o algodão vai ficar no topo. Então, o que significa que se você fizer uma centrifugação diferenciada, o que vai acontecer é que o ferro vai ser pelado primeiro ou o ferro vai ser pelado para baixo a uma velocidade muito, muito baixa. Porque na verdade vai ajudar as forças centrífugas e na verdade ela vai.Então, mesmo que você gire a uma velocidade muito lenta a força centrífuga do ferro por causa da densidade vai ser tão pesada que na verdade ela é boa o suficiente para anular o efeito das forças de sustentação, bem como das forças friccionais. Enquanto que naquele momento específico a pedra assim como o algodão não vão ficar pelados para baixo. Mas quando você aumenta a velocidade pouco alto então a pedra vai ser peleada para baixo mas o algodão ainda permanecerá dentro do líquido ok.E então se você aumentar a velocidade mais para cima porque o algodão vai ter a menor densidade, ele requer mais força ou mais velocidade. Porque então só a força centrífuga vai ser boa o suficiente, para que ela seja peleada para baixo. Porque no final a força centrífuga tem que anular o efeito das forças friccionais assim como as forças alheia. E é assim que na verdade você pode ser capaz de paleta para baixo as partículas das diferentes densidades.(Consulte o Tempo do slide: 24:05)Deixe-nos ver no mundo biológico qual é a situação. Então, este é o gráfico o que está sendo mostrado e isso são as densidades. Então, o que se vê é a taxa de sedimentação ou os coeficientes de sedimentação das diferentes moléculas. E o que se vê é que as proteínas que realmente estão tendo o peso molecular muito alto estão, na verdade, tendo a taxa de menos sedimentação. Considerando que as moléculas que são de como você vai deste lado para este lado a taxa de sedimentação está se descindo.E quando a taxa de sedimentação irá descer o que significa que você tem que executar essas moléculas em uma velocidade muito alta. Da mesma forma o que se pode ver aqui é o que está mostrando como a taxa de sedimentação da proteína, o DNA Assim como as outras biomoléculas. E, por isso neste gráfico, o que estamos tentando mostrar é que como a densidade de uma molécula irá subir, você realmente vai ter a maior taxa de sedimentação.E é assim que você pode não ter que rodar a centrífuga em uma velocidade muito alta o que significa porque a molécula em si tem uma tendência a sedimentar que é própria. É por isso que não é preciso girar a uma velocidade muito alta. Por exemplo, as mitocôndrias realmente vão ser peleadas a uma velocidade de 15 ,000g. Considerando que a proteína que está presente na fração solúvel vai realmente ser peletada a uma velocidade de 1 lakh 30 ,000g que significa ou qualquer velocidade que seja superior a 1 lakh g.Então, o que significa e como se pode ver a taxa de sedimentação ou o coeficiente de sedimentação da proteína solúvel encontra-se em um lado inferior. Considerando que o coeficiente de sedimentação das mitocôndrias assim como o núcleo está no lado superior o que significa que essas moléculas são não requer uma alta velocidade para ser sedimentada.(Consulte o Tempo de deslizamento: 26:17)Então, vamos discutir sobre o isolamento das organelas celulares. Então, eu já tomei uns 2 exemplos, no primeiro exemplo estamos tentando processar as células do fígado. Então, na célula do fígado o que vai acontecer é que o se quiser isolar as células e então se você gostaria de se interessar por isolar as organelas celulares, o que você tem que fazer é que primeiro você tem que fazer um processo chamado de perfusão. Então, a perfusão é um processo que realmente retira o sangue do fígado porque você sabe que o fígado é um órgão vascularizado.Então, o fígado está tendo o suprimento total de sangue e por causa disso quando você está tentando isolar as células hepáticas você também vai ter a contaminação dos glóbulos sanguíneos. Porque o sangue está presente no fígado, por isso o fígado pode ser perfusado com uma solução isotônica como você pode usar a salina salina ou o tampão fosfato. E isso na verdade vai remover o sangue o que está presente dentro do fígado e que na verdade vai remover as células contaminantes.Caso contrário, quando você estiver tentando isolar uma organela, por exemplo, se você estiver interessado em isolar as mitocôndrias dos hepatócitos que estão basicamente fazendo as células do fígado você não serácapaz de isolar as mitocôndrias somente da célula hepática. Porque a mitocôndria também vai ser contribuir com as células (()) (27:54) e os outros tipos de células imunes mas está presente no sangue.Então, no primeiro passo você retira o sangue do fígado em um processo chamado perfusão. E então o que você tem que fazer é você dissecar esse fígado em pequenos pedaços e você homogeneizar em um tampão que é isotônico ou você pode usar o PBS significa como salina tampão fosfato. Ou você pode usar uma salina, salina simples como tanto que ambos vão ser isotônicos e depois você faz a homogeneização. Então, a homogeneização que você pode fazer em um homogeneizador, o homogenizador é um tipo de disruptores de células mecânicas.Então estamos falando da centrifugação gradiente de densidade. Assim, você pode ver as densidades das diferentes moléculas biológicas como as células microbianas que vai para 1,05 115. Aí você tem as células de mamíferos que na verdade está nessa faixa, então você tem os diferentes tipos de organelas que vai de 1,1 1,6. Depois você tem as proteínas que vão para 1,3 DNA e RNA.Então, a centrifugação gradiente de densidade explora de fato a propriedade física de uma molécula que onde a força centrífuga é igual a forças além e as friccionais. Então, o que você viu na centrifugação diferencial de que estamos realmente aumentando a força centrífuga e é assim que você é na verdade você sabe que está anulando as forças além das forças friccionais.Considerando que neste caso você está simplesmente fazendo o inverso o que significa que você está mantendo a força centrífuga constante. Agora o que você está fazendo é realmente aumentar o além das forças, assim como as forças friccionais, especialmente as além das forças. E é assim que o que vai acontecer é a molécula que pode ser peletada na ausência do além das forças. Na verdade, na verdade não vai ser pelado porque está a aumentar o além das forças. E como resultado a molécula vai se manter no sobrenadante e ela vai ser localizada em uma determinada região.(Consulte o Tempo do slide: 36:48)Então, o que você vai fazer na centrifugação gradiente de densidade é que suponha que eu tenha usado centrifugação de gradiente de densidade de sucrose. E então eu carretei as moléculas das diferentes densidades sobre isso. Por isso, no início todas as moléculas são misturadas e você tem uma mistura. Aí o que vai acontecer é quando você comandar isso por 30 minutes o que vai acontecer é que já que todas essas moléculas estão tendo a taxa de sedimentação diferenciada porque na verdade estão associadas às forças centrífugas diferenciadas.Então, o que vai acontecer é que a força centrífuga vai se opor, na verdade, pelas forças além das forças friccionais. Então, se eu aumentar o além das forças ou se você manipular o além das forças, o que vai acontecer é que as moléculas vão ser localizadas em diferentes zonas dentro daquele sobrenadante particular em vez de serem peladas para baixo. Porque o que você está fazendo é você estárealmente manipulando com o além das forças e em um lugar onde eles realmente vão parar.O que significa neste ponto para essas pelotas de cor azul o que vai acontecer é que a força centrífuga para essas moléculas são realmente equivalentes ou as iguais para as forças friccionais, portanto, como resultado ele realmente vai ser localizado a isso. Da mesma forma se este for o local para isso, então neste local em particular as forças agora estão equalizadas. E o que vai acontecer é se você continuar fazendo isso a molécula vai se localizando para uma determinada região.E é assim que eles realmente vão ser separados o que significa que as moléculas realmente vão utilizar suas densidades para gerar um tipo particular de força centrífuga. E essa força centrífuga vai, na verdade, ser oposta às forças superiores mais as forças friccionais. Mas em um determinado ponto as forças friccionais mais além das forças vão ser equalizadas pelas forças centrífugas e esse é o lugar onde a molécula vai permanecer ali, ela não vai ser peletada para baixo.Porque se você for mais para cima e se você aumentar mais a força centrífuga então a molécula vai ser peleada para baixo e ela permanecerá no fundo desse tubo em particular. Assim, em comparação com as centrifugações diferenciais a centrifugação gradiente de densidade realmente explora as densidades da molécula assim como as densidades desse particular o meio também.(Consulte o tempo de deslizamento: 39:37)Então, estes são o fracionamento que é a maneira como você vai fazer o fracionamento que significa quando você vai começar. Então, as moléculas vão ser localizadas e então se você quiser pode realmente quebrar esses tubos e você pode ser capaz de coletar todas as frações individuais.(Consulte o Tempo do slide: 40:00)Como coletar as frações quando você for fazer a centrifugação de gradiente de densidade. Então, você pode imaginar que eu tenho mistura bruta quando eu corro ela para as 3 horas em 1, 50 ,000g, o que vai acontecer é ter forma os diferentes tipos de bandas. Como a banda que na verdade tem sido correspondente às frações pesadas, frações leves, tríades e assim como a membrana da superfície.Então o que vai acontecer é se eu tiver que remover estes o que eu posso fazer é, eu tenho as 2 opções ou eu posso simplesmente usar as pipetas e eu posso simplesmente chupá-lo. Então, eu posso colocar pipeta para próximo a esta fração em particular e eu posso simplesmente sugar esse líquido todo e isso realmente vai remover. Coletor de fração automática para gradientes instáveis e o segundo, terceiro caso é você pode fazer o congelamento e o fatiamento.Então, o que acontece é no congelamento e fatiar o que você faz é supor que esta é a frações que você tem os diferentes tipos de frações. Então, o que você faz é você congelar isso e então você realmente vai cortar tudo isso em pequenas fatias e depois fatia individual você pode remover e deglutificar e isso na verdade vai te dar aquela frações individuais. Então, trata-se de tudo sobre as fraccionações celulares e como você pode ser capaz de explorar os diferentes tipos de centrifugações.Ou você usa as centrifugações diferenciais ou as centrífureições de gradiente de densidade para isolar os diferentes tipos de organelas das células eucarióticas. Nós também discutimos sobre a célula procariótica e como você pode ser capaz de fracionar em células procarióticas para isolar a fração periplasmática assim como as frações citoplasmáticas. Por isso, com isso eu gostaria de concluir minha palestra aqui, obrigado.