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Citocinas

Olá pessoal, este é o Dr. Vishal Trivedi do departamento de biociências e bioengenharia IIT, Guwahati. E neste módulo específico, estávamos discutindo sobre os diferentes tipos de ferramentas imunológicas, que se baseiam principalmente na interação entre o antígeno e os anticorpos. Então, o que discutimos até agora é o seguinte.
(Consulte O Tempo De Deslizamento: 01:24) Nós discutimos sobre, se o antígeno é natureza insolúvel então você pode ser capaz de realizar as reações de aglutinação, se o antígeno for insolúvel na natureza, então você pode ser capaz de realizar as reações de precipitação ou a imunodifusão radial e na palestra anterior, nós também discutimos sobre as imunoprecipitações. Fora isso, também já discutimos sobre os diferentes tipos de imunoensaios como a Eliza, a blot ocidental e assim, em diante.
Assim, com essas ferramentas, você pode ser capaz de realizar diferentes tipos de experimentos e pode ser capaz de responder a muitos tipos de questões imunológicas ou as perguntas que estão relacionadas com a biologia. Fora isso, há uma coisa adicional que você também pode explorar com a ajuda das ferramentas imunológicas.
(Consulte O Tempo De Deslizamento: 02:17) Então, você pode imaginar que uma resposta celular de uma célula imunológica como macrófagos ou célula B ou célula T, por exemplo, nesta célula neste caso, é a célula T que está realmente respondendo à lige extracelular e em resposta a isso, ela está realmente conduzindo uma sinalização de downstream e ela está envolvendo todas essas moléculas de sinalização e no final, está ativando o fator de transcrição NF kappa B.
Então, a NF kappa B está indo para dentro do núcleo e depois está ativando seus genes alvo. E em resposta, ela está realmente produzindo os diferentes tipos de proteínas, ela está realmente mudando as atividades transcriptonais dentro da célula. E, como resultado, vai-se realmente fazer uma resposta celular completa, se isso vai ser uma resposta celular humoral ou para a resposta celular celular.
Se vai ser uma imunidade humoral ou a imunidade mediada pelo celular, mas no final, o que se vai ver é que no caso de qualquer tal sinalização, o que vai acontecer é que vai realmente mudar a expressão gênica daquela célula em particular, vai-se mesmo mudar o metabolismo daquela célula específica ou também vai-se alterar as proteínas da célula e se esta célula particular for uma célula imune.
Por exemplo, as células T ou a célula B, ela também vai alterar a secreção de citocinas desta célula específica. Então, se você tem esses 4 parâmetros específicos, o que você gostaria de monitorar você tem diferentes tipos de técnicas. Por exemplo, se você deseja monitorar a profiling de expressão do gene, você pode fazer isso simplesmente usando os chips de microarray. Se você quer estudar os metabolômicos ou as alterações metabólicas, então isso pode ser feito simplesmente com a ajuda das técnicas NMR.
E se você está interessado em ver as mudanças dentro das proteínas, então você pode ser capaz de fazer com a proteômica, mas qual seria a técnica se você gostaria de estudar a profiling completa de citocina de uma célula sob uma determinada resposta celular. Então, para isso temos as múltiplas opções. Uma das maneiras mais fáceis é que você pode realizar a de Eliza.
(Consulte O Slide Time: 04:51) Então, eu acho que na palestra anterior também discutimos sobre os diferentes tipos de Eliza o que estão disponíveis para você explorar e. Então, as citocinas são, na verdade, as moléculas de sinalização. Assim, as citocinas ou o quimiokine são as moléculas de sinalização que mediam a célula para as comunicações celulares, são liberadas das células e têm o papel crítico em muitos processos biológicos como o crescimento celular, as diferenciações e as expressões de genes.
Migrações, imunidade e as inflamações. Na maioria dos processos biológicos, as múltiplas citocinas operam em uma grande rede, onde a ação de uma das citocinas é regulada pela presença ou pela ausência das outras citocinas, isto significa, as citocinas são na verdade muito, muito versáteis na natureza. Então, eles podem ser secretados a partir de uma célula, podem ir para as 5 mais células, e então é assim que eles podem realmente ser capazes de fazer uma rede muito, muito complicada, onde a uma citocina está regulando a secreção assim como a ação das múltiplas citocinas.
Então, qual é a opção do que temos para medir essas muitas citocinas de uma única célula que para em um momento particular. Por isso, se você se lembra em nossa palestra anterior, discutimos sobre os diferentes tipos de ferramentas imunológicas, o que você pode realmente utilizar para medir o anticorpo ou os antígenos.
(Consulte Slide Time: 06:18) Então, Eliza é uma das ferramentas imunológicas que o que nós discutimos e discutimos sobre os diferentes tipos de Eliza como a direta Eliza, Eliza indireta, a sanduíche Eliza assim como a competitiva Eliza. Por isso, se você lembrar que o sanduíche Eliza é algo que você pode usar para medir o nível do antígeno. Por isso, a sanduíche Eliza pode ser uma potencial ferramenta imunológica, que na verdade você pode usar para medir o nível das citocinas.
Mas o número de citocinas é muito, muito grande. Então, se você realizar o sanduíche Eliza para as citocinas individuais, na verdade vai ser um trabalho muito, muito trabalhoso, e por outro lado, ele realmente vai te dar que é hora de consumir e assim como é de fato vai lhe custar muito dinheiro. Por isso, em vez de fazer um sanduíche Eliza, as pessoas desenvolveram as matrizes citocinas, onde você pode ser capaz de medir o nível de citocinas em um momento particular de uma célula.
Então, se você usa as células ou o sobrenadante celular ou se usa o liso celular ou se usa um tecido, pode ser capaz de medir os diferentes tipos de citocinas. Então, como funciona a matriz cytokine.
(Consulte O Tempo De Deslizamento: 07:39) Então, em uma matriz citocina típica, o que você tem é você ter uma membrana sobre a qual os anticorpos estão sendo imobilizados. Então, esses anticorpos individuais são direcionados contra uma determinada citocinas como. Por isso, um anticorpo é para uma única citocina e você tem múltiplos anticorpos, e então o que você vai fazer é uma vez que você adiciona as amostras, essas amostras são as diferentes moléculas de citocina.
Então, eles vão e se unem aos seus respectivos anticorpos. E uma vez que você é feito com estes, então você pode fazer uma lavagem e então você realmente vai adicionar os anticorpos biotinilados, esses anticorpos biotinilados também são anticorpos monoclonais e eles serão também contra esta citokinas em particular. Então, na verdade você vai ter os múltiplos anticorpos monoclonais que são biotinilados.
E todos esses anticorpos múltiplos vão se ligar às suas respectivas citocinas. E, finalmente, neste estágio novamente você vai se lavar e então você vai realmente adicionar o streptavidin que na verdade está ligado ou com um fluoróforo ou ele está ligado a uma enzima e que realmente vai permitir que você com o para fazer as reações para visualizar as amostras e o que nós vamos ver no chip da matriz, que você vai ver as manchas individuais brilhando após as reações.
Ou eles vão dar o sinal de fluorescência ou eles vão te dar a matriz quimioluminescente 09:15 em alguns casos você também pode usar os filmes de raios X para adquirir a imagem ou adquirir os dados desses chips de matriz cytokine. E em última análise o que você pode fazer é apenas capturar a imagem e você pode ser capaz de fazer a análise deste sinal específico. Então, a questão vem como a matriz de citocina é diferente do sanduíche Eliza.
(Consulte O Tempo De Deslizamento: 09:43) Assim, na matriz de citocina, os anticorpos de captura cuidadosamente selecionados estão sendo vistos em duplicata sobre uma membrana nitrocelulose. A amostra ou a mistura de anticorpo é então incubada com a membrana da matriz citocina, qualquer complexo de detecção de citocina presente é ligado por seu anticorpo de captura imobilizado de cognato sobre a membrana após uma lavagem para remover o material de desvinculação.
Os reagentes de detecção de Streptavidin-HRP e quimioluminescentes são adicionados posteriormente, a luz é produzida em cada mancha na proporção da quantidade de citocina presente. Então, esta é na verdade uma matriz de citocina onde você tem uma membrana onde os anticorpos estão sendo imobilizados e esses anticorpos irão ligar as citocinas que estão presentes em sua amostra. Aquela matriz de citocina e a ideia completa de fazer uma matriz citocina é muito semelhante ao sanduíche Eliza, exceto que, neste caso, você está usando os diferentes anticorpos.
E assim como você é na verdade é exatamente assim você está realizando as reações de 40 ou 50 Eliza ao mesmo tempo, mas a única questão é que os anticorpos são imobilizados na membrana nitrocelulose e você está usando 2 anticorpos exatamente como um sanduíche Eliza. Se você se lembra em um sanduíche Eliza também temos um anticorpo de captura, que realmente vai captar o antígeno a partir das reações.
E então você está realmente adicionando o anticorpo monoclonal adicional que de fato vai reconhecer o antigénio, mas não com o mesmo epítopo que vai reconhecer com o epítopo diferente e então você está realmente adicionando o anticorpo secundário que é acoplado à enzima e então você está adicionando o substrato e que na verdade vai dar o sinal.
Então, é exatamente o mesmo que a matriz cytokine não é nada além do sanduíche Eliza que é você está se apresentando mas ela está presente em uma fina folha de membrana em vez de fazê-lo no poço. Vamos ver como realizar isso.
(Consulte Slide Time: 11:51) Então, para realizar a matriz cytokine, o que você precisa é que você precise da matriz de citocina a partir de uma determinada empresa você requer os buffers, diferentes tipos de buffers, então você requer os buffers Bosch, você requer um anticorpo de detecção, anticorpo de detecção também vai ser o anticorpo monoclonal direcionado contra um conjunto de citocinas para os quais a matriz também foi projetada.
Então você precisa de um complexo de streptavidin-HRP que realmente vai reconhecer o anticorpo de detecção e então você requer que os agentes quimioteráicos gerem o sinal. Então, isso você exigia para gerar o sinal e então você exige o bem ou prato onde você vai fazer as incubações com as matrizes citocinas ou você também requer uma cobertura. Assim, você protegerá a evaporação e outras coisas.
(Consulte O Tempo De Deslizamento: 12:57) Em seguida, como reconstituir os diferentes tipos de reagentes. Por isso, na etapa 1, ou qual é o procedimento. Assim, na etapa 1 você vai preparar as amostras e vai ter os múltiplos tipos de amostra como culturas de células, liso celular, você pode ter o soro, você pode ter o plasma e pode ter os tecidos e o processamento de todas essas amostras são diferentes, exceto que você tem diferente dependendo do tipo dos agentes contaminantes o que está presente e como processar.
Por exemplo, no caso do sobrenadante de cultura de células você não precisa fazer nada, exceto que você remova a matéria particulada e então você é simplesmente pode usar esses sobrenadantes no assadão da matriz cytokine. A única coisa que você tem que evitar é você ter que evitar os repetidos ciclos de degelo de congelamento. Da mesma forma para o liso celular que você pode ter para você saber passar pelo liso celular através de 0,2 filtros de micron e outros tipos de coisas.
Então, que não haverá agentes interferentes presentes e então você tem que fazer estimação de proteínas. Então, isso não vai agregar muitas citocinas e muito pouca citocinas caso contrário as detecções vão ser não perfeitas. Da mesma forma, o tipo similar de coisa que você tem que fazer para o soro, assim como o plasma e a análise de tecido também está sendo feito com um conjunto de protocolos, que você tem que seguir.
E em última análise o que você vai obter seguindo qualquer um desses processos é você vai obter uma mistura das proteínas e onde suas citocinas estão presentes. E então a ideia é que você deve usar aquela mistura de célula particular ou a mistura de proteína imediatamente ou você apenas mantê-lo em um-20, você evita o ciclo de degelo do congelamento e então também deve fazer as estimativas de proteína. Então, que você não deve ver muita variabilidade de seus resultados de um lote para outro lote.
(Consulte O Tempo De Deslizamento: 14:55) Então, o reagente o que você precisa para preparar uma região é que você tem que preparar a matriz cytokine. Então, você vai obter a membrana nitrocelulose que realmente contém os anticorpos citocinas, a única coisa que você tem que fazer é porque estas são membranas citocinas muito sensíveis. Então, você não deve manusear as membranas apenas com a mão gamada e você usa as pinças em vez da mão ou das luvas.
Então, você usa as luvas e assim como você usa as pinças, então você tem que preparar o anticorpo de detecção. Então, o que a empresa vai te dar, vai dar um estoque concentrado e então você tem que simplesmente diluir o estoque concentrado e reconstituir com a ajuda do tampão para a mesa fornecer ou você pode usar a água destilada, então você tem que preparar o tampão de lavagem, tem que preparar os reagentes quimioteráteis.
E tudo isso que você vai usar ou vai se preparar conforme as instruções o que a empresa vai te dar nos folhetos.
(Consulte O Tempo De Deslizamento: 15:55)
E então como realizar os assédios. Por isso, traga tudo antes de iniciar esse processo você tem que garantir que todos os reagentes estão na temperatura do quarto e então você os incubar e sua amostra está no gelo, para evitar a descontaminação é preciso usar as luvas enquanto executa os procedimentos. Porque você sabe que as mãos humanas também são contém os diferentes tipos de é feita de pele.
Por isso, as células da pele são muito frágeis. Por isso, quando você está fazendo todos esses procedimentos, a célula da pele também pode realmente ser descascada e eles também podem ser capazes de contaminar a sua amostra e que realmente vai dar a variabilidade. É por isso que tem de ser usar as luvas caso. Então, que você não deve adicionar as proteínas do seu corpo. Primeiro você prepara todo o reagente e como discutimos.
Então você realmente vai fazer o que você sabe que tem que molhar o buffer e então você tem que usar o buffer de assay 6 como um buffer de blocos. Em seguida, é preciso usar a pinça de ponta plana e remover a cada membrana para ser usada entre as folhas de proteção e colocá-la em um poço ou para bem multi prato, o número na membrana deve estar virado para cima. Por isso, a membrana quando você é ela foi mantida em um entre a folha de 2 de polietileno.
E isso tem que ser removido e então essa membrana tem o algum material impresso e que material impresso deve estar virado para cima. Em seguida, você incuba isso com o com sua amostra em uma plataforma de balanço e orienta as bandejas. Assim, que cada uma das rochas membranas terminam para terminar em swell. Enquanto as membranas estão bloqueando preparar a amostra adicionando 1 ml de cada amostra, 2,5 ml de tampão da matriz 4 nos tubos separados.
Ajuste para o volume final de 1,5 ml com o buffer de matriz 6 conforme necessário. Em seguida, você adiciula 15 microlitros de matriz de citocina de rato reconstituído, anticorpos de detecção, coquetel a cada amostra preparada, misture e incuba para temperatura ambiente por 1 hora.
(Consulte O Tempo De Deslizamento: 18:02) Em seguida, você incubou o durante a noite em um shaker de plataforma de balanço, remova cuidadosamente cada membrana e coloque-a no recipiente de plástico individual com 20 ml de tampão de lavagem 1X. Enxágue os 4 bem diversos desionizados ou secos minuciosamente. Lave cada membrana com tampão de lavagem 1X por 10 minutes minutos em uma plataforma de roking. Repita 2 vezes para um total de 3 washes, então você vai fazer uma detecção.
Então, com isso você vai fazer uma detecção da amostra. Por isso, agora sua membrana está pronta para ser detectada pelo sistema streptavidin-HRP. Em seguida, você pipeta os 2 ml de mistura de HRP diluídos no cada poço do 4 bem multi prato. Em seguida, retire cuidadosamente cada membrana de seu recipiente de lavagem, permita o excesso de tampão para escoar da membrana. Retorne a membrana para o recipiente de 4 bem multi prato, a escuta diluída que.
Coberta o poço com a tampa, incubada por 30 minutes minutos. Assim, que o complexo de streptavidin-HRP irá e se unirá aos anticorpos biotinilados.
(Consulte O Tempo De Deslizamento: 19:12)
E então você remove a membrana do cada poço permitindo o excesso de lavagem tampão para drenar por meio do blotting a borda inferior sobre a toalha de papel. Coloque cada membrana sobre a folha inferior das folhas de plástico protetora com o número de identificação voltada para cima. Em seguida, pipetar 1 ml dos reagentes quimioterápicos sobre a cada membrana e, em seguida, cobrir cuidadosamente com as folhas principais do protetor de papel plástico.
Gentilmente alise qualquer bolha de ar e garanta que você vai se espalhar uniformemente a todos os cantos da cada membrana, incubada por 1 minute minutos e então você vai adquirir a imagem. Porque uma vez que você adicio os reagentes quimioterais você tem que fazer para os 1 minute. Então, que o substrato o que está presente nos reagentes quimioteráceos vai ser processado pela enzima e aí vai dar o sinal e aí você tem que capturar a imagem.
(Consulte O Tempo De Deslizamento: 20:06) Então, então você vai enrolar o excesso de membrana plástica em volta da parte de trás do protetor da folha. Então, que a membrana e os protetores de folha estejam completamente enrolados. Então, isso é tudo sobre o protocolo o que você tem que seguir e eu gostaria de levá-lo ao meu laboratório onde os alunos realmente vão te mostrar como usar a matriz de citocinas para medir os diferentes tipos de citocinas.
E com esta demo, eles vão realmente dizer a você cada uma e todas as precauções o que você tem que tomar e quais são os diferentes passos o que você tem que seguir. (Vídeo Começa: 20:41) Hoje eu vou demonstrar como realizar uma matriz de citocina. A matriz citocina não passa de uma matriz proteica onde você pode detectar meus contatos completos a partir da amostragem. As amostras podem ser da cultura da célula sobrenadante ou dos proprietários de tecidos algo ou liso de células.
Você pode usar soro ou sangue também. Então, eu geralmente coloco por trás dessa matrizes citocinas cuidadosamente selecionadas anticorpos de captura são vistos em uma membrana de matriz, quando esses anticorpos de captura entram em contato com o contrário que eles irão anexar, então novamente você tem que fornecer um anticorpos de detecção, que formarão um complexo com o seu analito que é simultaneamente detectado com o substrato de quimioluminescência.
Por isso, hoje vamos utilizar os sistemas R e D a maioria das citocinas (()) (21:46). Então, basta virar, então eu vou abrir esse painel de citocina, despejar painéis de matriz cytokine, como você pode ver que há pontos azuis, cada ponto azul indica anticorpo de captura. Então, o que nós temos que fazer, primeiro temos que bloquear esse índice. Então, para fazer isso, usamos um dispense de buffer de matriz 6, fizemos de buffer de matriz 6 em cada poço neste painel de 4 bem.
Então, a próxima coisa é você ter que colocar essas matrizes neste buffer de matriz 6. Então, cuidadosamente tirar a membrana do lado de fora daquela bolsa para este filme, este número o que você pode vê-lo deve encarar lado ascendente. Por isso, quando eu mantenho em buffer de matriz 6, como você pode ver a cor azul gradualmente desaparece. Então, essa cor de borrão apareceu o que temos que fazer é temos que cobrir essa e manter-se em um shaker por 1 hora em temperatura ambiente, enquanto o bloqueio da matriz está acontecendo, temos que nos preparar para amostras, estes são os sobrenadantes da cultura celular. Por isso, primeiro temos que centrifugar para remover qualquer detrito. E fora disso temos que tirar 1 ml de amostra e torná-la até 1,5 ml usando o buffer array 4 ok. Então, já centrifugado. Agora eu vou adicionar buffer de matriz 4 em amostras. Uma vez adicionado buffer de matriz 4 em amostras.
A próxima coisa você tem que preparar coquetel de anticorpos de detecção adicionando 100 microlitros de água destilada para detecção de anticorpo. Então, isso eu me preparei adicionando 100 microlitros que você tem que suspender corretamente. Então, fora disso você tem que tirar 15 microlitros e adicionar cada amostra. Então, vamos fazer isso, aqui agora vamos manter essas amostras sob plataforma rocking com tremer constante por 1 hora em temperatura ambiente.
Depois de bloquear a matriz alterada temos que remover o papel preto. Em seguida, nós como se detectamos anticorpos incubados com essas amostras. Agora temos que introduzir as amostras em um membros. Então, eu vou despejar todos esses dentro dessa membrana, para cada amostra temos que usar ponta separada. Então, que não vamos obter nenhuma sinalização cruzada. Uma vez que você insere esta amostra, feche cuidadosamente a tampa e mantenha-a em 4 graus Celsius em um tremor constante durante a madrugada.
Então, depois disso temos que desenvolver incubada com o anticorpo conjugado do streptavidin-HRP então vamos embasar, mas que será mais adiante, agora vamos manter essa plataforma de balanço durante a madrugada de 4 grau Celsius. Por isso, incubamos durante a madrugada com amostra e agora temos que remover seção do bloco, depois de remover solução de amostra, temos que adicionar tampão de lavagem para remover anticorpos sem limite.
Cubra a tampa e você como manter 10 minutes em um shaker de plataforma de rocking, depois de lavarmos aqui removemos o buffer de lavagem a partir disso, uma vez que você remova todo o buffer de lavagem você tem que adicionar solução diluída de streptavidin-HRP para esta bandeja. Então, o que você tem que fazer você tem que preparar o streptavidin-HRP diluído conforme as instruções do fabricante, este é o substrato do streptavidin-HRP.
Como você pode ver diluir 1 é para 2000. Então, eu já preparei solução diluída, esta é solução diluída do streptavidin-HRP. Então, depois deste 2, 2 ml você tem que adicionar a cada matriz. Então, eu vou adicionar esta. Por isso, durante esse processo, não deixe o blat secar, uma vez que você adicionou este streptavidin-HRP mantenha este placas em uma plataforma de balanço para 30 minutes. Por isso, após a incubação com o streptavidin-HRP agora temos que lavar pelo menos 3 vezes usando o buffer de lavagem.
Em seguida, vamos desenvolver o caldo. Então, estes são lavados e prontos para se desenvolver. Assim, utilizaremos o fabricante fornecido agente de reagente de quimioterapia. Então, temos que misturar um reagente de quimioterapia 1 com quimi reagente 2 em 1 é para 1 proporção, então vamos adicioná-lo à matriz, então veremos isso em dados de quimioterapia. Então, você tem que adicionar reagente de quimioterapia em cima dele, permitir que ele se enrole sobre o blat, então você desliza suavemente para remover o excesso de quimi reagente, só nós vamos desenvolver a amostra.
Por isso, enquanto expõe você tem que se manter constante para cada amostragem para evitar qualquer incompatibilidade de sinal. Então, estas são a exposição de sinal apenas nós vamos utilizar a normalização das citocinas presentes em amostra. Então, como você pode ver aqui, esta é a citocina real. O que são os pontos vermelhos estão mostrando aqueles que na verdade são pixels saturados. Então, nós podemos remover esse simplesmente. Então, esta é a matriz citocina como podemos ver, cada ponto representa 1 citocina e cantos um. Este cantos um, estes 3 representa um pontos de controle que podemos usar para a normalização.
E aqui 2 pontos de fato nós não podemos ver, que na verdade é PBS 1. Então, esta é a matriz citocina. Durante esse processo, às vezes, podemos não obter sinal ou podemos obter excesso de sinal. Então, nesse caso, você tem que olhar com cuidado para o seu protocolo e todos os buffers, se você preparou a concentração certa de tampão. E por isso sempre use luvas. (Vídeo Ends: 35:15) Então, com demo, tenho certeza que você pode ter entendido o protocolo o que você tem que seguir e como detectar as citocinas no uso da matriz cytokine.
(Consulte O Tempo De Deslizamento: 35:30) O resultado o que você vê depois de estar fazendo com este assay é o número de spots o que você vai ver na membrana. Então, você pode imaginar que você tem 2 amostras, uma é amostra não tratada, a outra é uma amostra tratada. E o que você vai ver são essas manchas, o que está lá na esquina, e essas manchas são na verdade as manchas de referência. Então, o que você tem é você ter uma folha de matriz de citocina onde eles lhe deram que o que é significa pelo A 1 A 2 e tudo mais.
Então, o que se vê é que você tem a numeração sobre o lado esquerdo, que é como A B C D assim, e você tem os números de para este lado. Então, todos esses números são realmente correspondentes às citocinas individuais. Por exemplo, o semelhante assim A 3 é correspondente a algo e de forma semelhante, o A 4 é correspondente a alguma coisa. Então, você sabe, o que faz parte é correspondente ao que.
E estas são as manchas de referências. Por isso, essas manchas de referências estão sendo usadas para alinhar a membrana com a folha de referência. Assim, que você saberá quais manchas são realmente correspondentes ao que e as manchas de referência também são usadas para finalidades equalizadoras. Por exemplo, se você está tentando comparar isso e versus isso, então todas as intensidades têm que ser comparadas umas com as outras usando isso como fatores equalizadores.
Então, como analisar esses resultados, então, o que você vai ver é, você vai ver um tipos diferentes de manchas e o que você tem que fazer é você. Por isso, por exemplo, essas 2 vagas são uma parte da dupla como as 2 citocinas, uma vez uma única citocina em duplicatas. Então, você tem que medir a intensidade deste ponto específico. E de forma semelhante, você tem que ir vaga na amostra tratada também e depois tem que medir.
E, então, usando esses pontos de referência, é preciso calcular qual será a dobra de multiplicações que eu tenho que usar para equalizar essa mancha com essa mancha e então só você pode ser capaz de traçar a intensidade dessa citocina em particular se ela está se regulando ou descente regulando.
(Consulte Slide Time: 37:42) Então, sinal positivo o que você vê no filme desenvolvido pode ser identificado a colocação no modelo de sobreposição transparente sobre a imagem da matriz e alinhando-o com o par de pontos de referências no canto 3 do cada matriz, as spots de referências estão incluídas para alinhar a transparência e para demonstrar que a matriz foi incubada com o streptavidin-HRP durante o procedimento de assay.
Então, isso de fato referências estão sendo feitas simplesmente porque eles realmente vão ser um controle positivo de que o nada está errado com o sistema de streptavidin-HRP ou sistema de detecção e você está realmente conseguindo as reações funcionar. Mas, por exemplo, em alguns casos se você não obter os resultados, então o ponto de referência tudo definitivamente deve dar o sinal independentemente de a amostra estar dando um sinal ou não.
Como o ponto de referência não tem os anticorpos primários, eles estão simplesmente tendo os outros anticorpos e é por isso que o streptavidin vai definitivamente ir e se ligar a esses pontos, então você tem que medir a intensidade do pixel no cada mancha e então você tem que usar qualquer software de análise de imagem para comparar a intensidade de pixel da amostra não tratada versus a amostra tratada, você tem que usar essas referências spot como os fatores equalizantes para multiplicar ou para dividir os sinais.
E é assim que se pode comparar para saber se o que sinal é sobre expressar ou qual sinal está por baixo expressando. Por exemplo, se eu mostrar a você que, esta imagem que o que se vê é que este sinal realmente não está presente nesta amostra específica não tratada, mas é muito intenso na amostra tratada. Da mesma forma, este sinal é fraco comparado com o sinal é muito alto.
E o que se vê é que todos os outros estes em circled sinalizam todos estes sinais são bastante elevados comparados a isso, são muito, muito fracos na amostra não tratada, o que significa que estas são as citocinas que realmente estão a aumentar quando se está a tratar as células com um particular com um tratamento. Isso significa que essas citocinas provavelmente poderiam ter algum papel na condução dos processos biológicos ou eles poderiam ter papel na condução das respostas imunológicas.
Assim, trata-se de tudo sobre os diferentes tipos de ferramentas imunológicas o que desutilizamos com base nas interações antigénio e anticorpo, discutimos também alguns dos imunoensaios o que você também pode utilizar para monitorar as reações imunológicas ou também pode usá-las para responder algumas das questões biológicas. Então, com isso eu gostaria de concluir minha palestra aqui, em uma palestra subsequente nós vamos realmente discutir algum aspecto mais relacionado à biotecnologia experimental, obrigado.