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Sanduíche e ELISA Competitivo

Olá pessoal, este é o Dr. Vishal Trivedi do Departamento de Ciências Biológicas e da bio engenharia IIT Guwahati e por isso, longe o que discutimos sobre os diferentes tipos de interações anticorpos do antigénio, onde discutimos sobre as reações de explicação que discutimos sobre os imunoensaios de rádio que discutimos sobre as reações de precipitação e na palestra anterior, também discutimos sobre os imunoensaios. Por isso, dentro do imunoensaio temos discutido sobre a Elisa direta assim como a Elisa indireta. Por isso, agora, subsequente a isso nós também vamos discutir sobre o sanduíche Elisa (Consulte o Tempo de Slide: 01:42) Sanduíche Elisa é na verdade um tipo diferente de setup esta configuração é usada para medir o nível de antigénio como a insulina no soro e na configuração direta Elisa uma quantidade conhecida de anticorpo é anticorpo específico para capturar o antigénio. O antigénio é então reconhecido pelo anticorpo secundário ligado à enzima. Um substrato colorimétrico é usado para medir o nível de antígeno. Por isso, que no sanduíche Elisa você usa os 2 anticorpos um é o anticorpo de captura.
Então, o que você pode fazer é primeiro você pegar o poço e então você casaco este bem com um anticorpo capturador e depois você adiciula seu antigénio de interesse. Por exemplo, neste caso é insulina. Então, você adiciina sua amostra de paciente e então a insulina ou o antigénio vai se ligar a este anticorpo de captura, então você faz uma etapa de lavagem e depois adicionou o anticorpo primário adicional. Então, isso na verdade vai reconhecer o antígeno novamente. E aí você acrescenta o anticorpo secundário que na verdade vai reconhecer esse anticorpo em vez desse anticorpo.
E aí você vai adicionar o substrato e que na verdade vai te dar o produto que vai ser colorido na natureza e é assim que você pode ser capaz de medir o nível de antígeno presente na amostra do paciente ou no fluido biológico. Por isso, o objetivo do sanduíche Elisa é medir o antigénio enquanto que, a finalidade da Elisa indireta é medir o nível de anticorpo presente no sangue.
(Consulte O Tempo De Deslizamento: 03:19) Então, neste método de captura anticorpo é usado para coletar o antígeno da amostra. Depois, um segundo anticorpo é usado para detectar o antígeno ligado ao anticorpo de captura. O segundo anticorpo é direcionado contra o antigénio utilizando um epítopo distinto único. O anticorpo está ligado à biotina e que pode ser reconhecido pelo complexo avidin ou streptavidin-HRP. Na última etapa o substrato de próstata é usado para obter uma releitura. Por isso, quando você os utiliza, quando imobiliza os anticorpos de captura, o antígeno vai e se liga ao anticorpo de captura.
Depois você usa o anticorpo de detecção, que na verdade vai usar o epíope diferente presente no mesmo antígeno. E então você tem a opção de usar o anticorpo secundário ou você pode usar o tipo de sistema de reconhecimento de biotina evidente e então você vai adicionar o substrato e que na verdade o substrato vai ser processado pelo HRP. HRP significa, peroxidase de horseradish e que na verdade vai dar o produto colorido e esse produto colorido pode ser reconhecido pelos ácidos calorimétricos.
(Consulte O Tempo De Deslizamento: 04:34) Então, vejamos como fazer isso e quais são os materiais necessários. Portanto, em primeiro lugar se você necessita de um anticorpo de captura por isso, neste caso, estamos mostrando a Elisa para o alfa TNF da amostra de paciente. Então, você está usando o anticorpo monoclonal anti-mouse TNF anti. É 1is a 250 diluição é usada para revestimento no tampão de revestimento utilizando a placa Elisa. Em seguida, você requer um anticorpo de detecção.
Assim, o anticorpo monoclonal anti-rato anti-rato anti-rato TNF é usado e o recomendado de 1 é para 500 diluição é necessária no buffer de reação para detecção de TNF alfa na amostra então você requer o substrato enzimático. Por isso, o conjugado de peroxidase de streptavidin-horseradish está sendo usado como um sistema de detecção e então você requer os padrões. Então, no caso disso você realmente precisa dos padrões alfa do mouse TNF.
Então, isso; você pode ser capaz de executar a reação padrão. Então, que você será capaz de medir o nível de TNF alfa nas amostras de pacientes e o tratamento de enzima HRP conjugado. Então, este é o substrato o que você exige usar e a diluição recomendada é de 1 é para 250 em um para detectar o alfa TNF na amostra.
(Consulte O Tempo De Deslizamento: 05:53) Além disso você requer um buffer de revestimento. Então, esta é a composição do tampão de revestimento. O tampão de revestimento tem que ser preparado fresco e você tem que usar isso no intervalo de 7 dias. Então você exige o Assay diluente. Assim, o diluente de assay é um PBS que realmente pode ser usado para preparar as diferentes diluições de amostras. Em seguida, você requer o buffer de lavagem. Sendo assim, o wash buffer contém o PBS mais tween-20 e então você requer a solução de substrato que é o TMB e o peróxido de hidrogênio.
E então, uma vez que a reação acabou, então você exige a solução de parada que contém o ácido H3PO4 ou o ácido sulfúrico. Em seguida, exigia a placa de 96 bem para fazer a Elisa e então você exige o leitor de microplaca que realmente pode ser capaz de capturar a absorvância em 450 nanômetro e então você requer os tubos de micropipeta e a placa ou a parafina.
(Consulte O Tempo De Deslizamento: 06:50) Passo um na etapa um você tem que coletar o espécime ou a amostra do paciente ou do fluido biológico. Por isso, na etapa um você tem que fazer uma coleta de espécimes e o manuseio. O espécime deve ser claro, não hemolízado e não lipêmico. No caso da cultura celular, remova qualquer material particulado por centrifugação e assisto imediatamente ou armazene a amostra a -20 graus Celsius. Evite ciclos repetidos de congelamento de degelo.
Assim, mesmo que você preserve a amostra em -20, você não deve repetir o ciclo de degelo do congelamento porque como muitas vezes você fará o ciclo de degelo do congelamento vai realmente danificar os antígenos, o que está presente dentro da amostra e que realmente vai reduzir sua reatividade cruzada. Considerando que, no caso do sangue do paciente, utilize um tubo separador de soro e permita que a amostra coagida por 30 minutes minutos e, em seguida, envie um pavio para 10 minutes.
Por isso, no caso, se você está processando com o sangue paciente, não precisa do componente sanguíneo você só requer o componente do soro ou o componente fluido. Então, o que você faz é apenas permitir que o sangue coagear e então você tirar o sobrenadante claro para detectar o antigénio ou é TNF alfa ou insulina ou qualquer outro antigénio. Você retira o soro e assalta imediatamente ou armazê-los em -20 grau. Você evita os repetidos ciclos de degelo de congelamento. Então, isso é muito importante que você não deve fazer o ciclo repetido de congelamento de degelo porque isso na verdade vai reduzir a reatividade do antígeno contra o anticorpo.
(Consulte O Tempo De Deslizamento: 08:25) Etapa 2 você tem que preparar as diluições padrão do TNF alfa. Então o que você tem que fazer é começar com o grama de 1000 Pico por ml e então você faz as diluições em série como como discutimos para a Elisa indireta também, e finalmente você vai receber o 15,56 Pico grama por ml diluições. Então, é exatamente isso que você tem que fazer, tem que começar com as soluções de estoque e depois primeiro para preparar o grama de 1000 pico por ml. Você pega o microlitro de 300 que diluiu e é assim que você realmente está se diluindo toda vez que você está diluindo metade no eppendorf individual.
E é assim que se vai preparar as diluições completas. Então, você leva o que quer que o conteúdo venha junto com o kit em uma água desionizada para obter estoque de 30 nanogramas por ml. E aí você pode fazer as diluições como esta. E você vórtex a mistura para isso vai ser uma diluições homogênea e então só você realmente vai preparar as diluições em série. Porque uma vez que você adiciona as coisas, você tem que misturar isso bem minuciosamente para que ele realmente seja homogêneo e então só você tirar um adicional de 300 microlitro diluído para fazer as diluições adicionais.
(Consulte O Tempo De Deslizamento: 09:45) O passo 3 você tem que fazer o revestimento. Por isso, acrescente os 100 microlitros diluídos capturando anticorpo para cada poço. E então você incuba durante a madrugada em 4 grau e Aspirar e lavar 3 vezes com o tampão de lavagem. Então agora você revestia seu anticorpo de revestimento. Aí você faz o bloqueio. Então, exatamente da mesma forma que você tem que fazer o bloqueio, para que não haja uma interação não específica do antígeno para o plástico desse bem específico. E então você adiciula os 100 microlitros de alfa ou amostra padrão TNF e a incubam por 2 horas em temperatura ambiente.
Em seguida, na etapa 5, você aspirar a amostra e lavar a placa 5 vezes com o tampão de lavagem e, em seguida, a etapa 5, é preciso fazer a detecção. Por isso, adiciam os 100 microlitros de detectores a cada poço. Por isso, detector é um conjugado de streptavidin-HRP. Incuba durante uma hora a temperatura ambiente aspirar a solução do detector lavá-la e depois você a incubar com as soluções de substrato e isso realmente vai dar as reações depois do algum tempo e que na verdade pode ser lido com a ajuda do espectrofotômetro.
(Consulte O Tempo De Deslizamento: 10:57) Agora, determinação do nível de alfa do TNF, portanto, estamos apenas dando um exemplo de TNF alfa, mas isso pode ser feito com qualquer antígeno, a absorvância média do conjunto de cada conjunto da amostra e subtrair a absorvância de fundo a partir de cada média. Traçar uma calibração traindo a consulta alfa TNF padrão contra a absorvância. Então, você realmente absorve você pode traçar a absorvância no eixo y e traçar a concentração de alfa TNF no eixo x.
E isso na verdade vai te dar curva e usar uma análise de regressão e você pode ser capaz de desenhar a equação dessa curva em particular e então você usa essa equação para determinar a concentração de alfa TNF em amostras desconhecidas. Por isso, trata-se de tudo sobre o sanduíche Elisa para determinar o nível de antígeno na amostra de paciente ou o fluido biológico.
(Consulte O Slide Time: 11:56) Agora, esta é a competitiva Elisa. Por isso, a competitiva Elisa é realmente baseada na ligação de competição para o anticorpo primário entre o antigénio alvo numa amostra e o mesmo antigénio que é revestida sobre a placa multi-poço. Neste caso, o que você está fazendo o anticorpo primário é adicionado primeiro à amostra para formar os complexos anticorpos antigénios. A amostra é, então, adicionada ao; bem que são revestidos com o antigénio alvo, apenas o anticorpo primário desvinculado na amostra pode ligar-se ao antigénio coado no poço.
Daí, quanto mais antigénio na amostra, o menos anticorpo está disponível para ligar o antigénio no poço resultando numa redução de sinal que significa, o que é o que isto significa é que você primeiro você faz os complexos antigénios antigénios na amostra. Então, o que você faz é pegar a amostra que você adiciar o anticorpo, assim, o que vai acontecer é o anticorpo irá e ligar-se ao antígeno. Por isso, como eu disse que você sabe anticorpos antigénios estão sempre a fazer um complexo na proporção equimolar. Então, suponhamos; você adicionou o micrograma de 10 de anticorpo.
Então, o que vai acontecer? O micrograma de anticorpo de 10 vai, na verdade, formar o complexo com o micrograma de 10 de antígeno. Então, agora, imagine que você tem mais quantidade de anticorpo. Então, suponhamos, eu adicionei o micrograma de 100 de anticorpo antigénio e o nível de antigénio que apresenta a sua amostra são apenas os 20 microgramas. Então, o que vai acontecer são os demais anticorpos de micrograma de 80 ainda estão disponíveis, então, eles vão e se unem ao antígeno o que está disponível sobre a placa e é assim que eles realmente vão te dar as releituras.
Mas se você tem mais quantidade de antígeno por exemplo, se você tem 80 micrograma de antígeno, então você só tem as moléculas de anticorpo de 20 disponíveis, o que significa, já que a quantidade de antígeno no fluido biológico está disponível. Na verdade, vai continuar reduzindo o anticorpo disponível para fazer uma interação com o antígeno que está presente no prato. Isto significa, haverá uma competição de antigénio entre o antigénio que está presente na chapa e o antigénio o que está presente na amostra e é por isso que este é chamado como a competitiva Elisa.
Ou direta ou a detecção indireta pode ser usada na competitiva Elisa que significa, você tem um antigénio que na verdade é revestida na chapa. E você tem um anticorpo que está ligado ao antígeno que está na amostra e então quando você os adiciina a isso, assim, anticorpo mais antigénio é assim, a estrela antigénio está a fazer um complexo como o complexo de antigénios antigénio. Então, quando você tem o antígeno que é revestida sobre a placa, este antígeno é na verdade menos.
Então você tem o excesso de anticorpo e esse excesso de anticorpo vai reagir com esse antígeno e que assim, esse anticorpo tem uma enzima então, que na verdade vai processar o substrato e vai dar a cor. A vantagem desta redação é que ela é altamente sensível ela é pode ser usada com a amostra bruta e você pode ser capaz de usar o mudo o sinal o que quer que você obtenha pode ser quantificado seja com a curva padrão de diluição serial.
Então, você pode realmente usar a quantidade diferente de antígeno na solução e isso realmente permitirá medir o nível de antígeno. A desvantagem é que você necessita de um anticorpo primário muito específico para naquele antigénio particular. Não deve ter a cruz reativa.
(Consulte O Tempo De Deslizamento: 15:45) Então, trata-se de tudo sobre as interações anticorpo antigénio. Discutimos sobre a aglutinação que discutimos sobre as precipitações que discutimos sobre aminoácidos de rádio e discutamos sobre as imunoprecipitações. Dentro do imuno assay também discutimos sobre a Elisa. E agora, vamos discutir sobre o blotting ocidental.
(Consulte O Slide Time: 16:09) Assim, o western blotting é uma técnica para detectar as proteínas o que está sendo inchado sobre a membrana nitrocelulose. Por isso, o western blotting é uma técnica popular para detectar a proteína específica presente no liso bruto ou no homogeneato. Ela usa a separação de diferentes proteínas na eletroforese de gel preferencialmente SDS-PAGE e, em seguida, sobre a transferência das proteínas para um sólido suporte como a membrana nitrocelulose.
Um anticorpo primário direcionado contra a proteína do interesse e, em seguida, anticorpo secundário é usado para detectar o anticorpo primário e dar a cor ou o substrato quimioluminescente. Então, o que você tem é que tem as proteínas presentes no SDS que você transfere para a membrana nitrocelulose, aí você adiciona os anticorpos primários, o anticorpo primário irá e se unirá aos seus antigénios alvo, então você retira o passo com a lavagem.
Então, a lavagem irá remover os anticorpos não especificamente ligados, então você vai adicionar os anticorpos secundários e que na verdade vai se ligar ao anticorpo primário e, em seguida, finalmente você poderá ser capaz de adicionar o substrato colorimétrico ou o substrato quimioluminescente. E isso na verdade vai dar o sinal ao lado da proteína onde o anticorpo anti-primário está ligado. Então, vamos ver como realizar o western blotting.
(Consulte O Tempo De Deslizamento: 17:30) Então, o material o que você requer do material o que você exige. Se as células. Neste caso, as células de E.coli que está sobreexpressando o GFP, você requer os buffers de transferência de proteína, membrana de transferência como as membranas de nitrocelulose, a bandeja de plástico, espátula, folhas de blotting, unidades de coagulação de eletrodomésticos semi seca, isso é necessário para eletro as proteínas do gel para a membrana nitrocelulose então você requer que o reagente para realizar a eletroforese você requer que os anticorpos primários detectem as proteínas que eles requerem os anticorpos secundários que é acoplado ao HRP e então você requer os reagentes em desenvolvimento.
(Consulte O Tempo De Deslizamento: 18:12) Na etapa 1, é preciso preparar as amostras para que, a preparação da amostra dependa do tipo de célula para um tecido Primeiro, o tecido a seguir como o tumor ou o fígado inteiro ou o cérebro, ele é primeiro mecanicamente dividido nas células individuais usando um liquidificante e, em seguida, homogeneizá-lo para as sonicações. Uma vez que as células individuais são obtidas, ela será processada conforme descrito a seguir. Para a célula, as células individuais são incubadas com o tampão lisis contendo detergente juntamente com a protease assim como o coquetel inibidor de fosfato para proteger a amostra da degradação.
Assim, o coquetel inibidor de fosfato só você usará se estiver interessado em sondar os anticorpos ou grupo o antígeno que é fosforilado. Por isso, porque você não quer uma fosfatase para remover o fosfato das proteínas fosforiladas. Etapa 2 você tem que eletroforese a amostra. Por isso, sua amostra é bem resolvida na página do SDS, então a etapa 3 você transfere o gel de proteína sobre a membrana de blotting.
E então o antes de você fazer a transferência da membrana de blotting, você tem os múltiplos passos como tem que preparar a membrana de transferência. Então você tem que cortar a membrana no mesmo tamanho que o gel como se você tivesse um gel desse tamanho você tem que cortar a membrana desse tamanho. E então você tem que processar a membrana de maneira diferente dependendo de qual membrana você está usando. Por isso, por exemplo, se você não estiver usando a membrana nitrocelulose, coloque a membrana no papel de transferência.
E observado que o líquido tem maldade a membrana na sua apareceu como um ponto branco precisa de uma consideração especial que significa se você adicionar o tampão de transferência, esta membrana vai ficar completamente molhada. Não haverá nenhum ponto branco presente nesta membrana o que significa que esta membrana não será visível. Na verdade vai submergir para a transferência e ele vai ocupar a mesma cor do seu buffer de transferência que indicará que a membrana é que tomou conta do buffer de transferência.
Se você está usando a membrana PVDF, que na verdade é uma membrana hidrofóbica, então o que você tem que fazer é imergir a membrana em metanol 100% etanol, porque então você tem que fazer uma etapa de carregamento porque a membrana PVDF tem que ser porque é uma membrana hidrofóbica. Então, não vai ligar a proteína muito bem. Então, ele tem que ser carregado com um solvente polar. Então, o que você tem que fazer é primeiramente incubar a membrana PVDF em 100 por cento de metanol por algum tempo e então você adiciona a transferência.
E então você adicionar a transferência o esforço de transferência deve ocupar o PVDF o buffer e ele deve ser também não pode mostrar qualquer cor branca. Decantar o metanol e submergir a membrana em um tampão de transferência e adicional de 10 a 30 minutes. Então, com isso a membrana de transferência vai ficar pronta e então você tem que montar o eletroplante.
(Consulte O Tempo De Deslizamento: 21:07) Então, montagem do cassete de transferência. Então, o que você tem que fazer é retirar o gel de empilhamento da página e incubar o gel em um transformador por 10 30 minutes minutos. Coloque um par de folhas de blotting sobre as placas de anode. Então, as operadoras de transferência estão tendo um ânodo de um lado e o cátodo de um lado e então você tem que montar as coisas assim, você tem que primeiro colocar os papéis do filtro então você tem que manter sua membrana nitrocelulose ou então você mantém o seu gel.
E aí você mantém a sua membrana de transferência ou pode fazer reverso que colocou primeiro o papel de filtro então você coloca o gel então você coloca a membrana e então você mantém a próxima camada dos papéis do filtro. Você tem que garantir que não haja nenhuma bolha presente entre a membrana de gel e nitrocelulose porque ela faz haverá uma bolha de ar presente que a área não vai ser vai não vai permitir a transferência de proteína do gel para a membrana nitrocelulose.
Por isso coloque a membrana de tancet sobre a parte superior de folhas de blotting e retire o ar apriste enrolando o tubo de ensaio ou a haste de vidro. Em seguida, você coloca o gel PAGE em cima de membrana e remove gentilmente a bolha de ar aprisada ao rodar o tubo de ensaio você coloca as outras folhas de blotting sobre o topo. E, em seguida, retire a bolha de ar aprisionada rolando o tubo de ensaio ou a haste de vidro e, finalmente, mantenha a placa catódica geralmente a placa de cátodo vermelho colorido e maré a transferência capturada pelos 4 parafusos.
Então, uma vez que você tenha feito isso, você tem o parafuso de 4 em todas as laterais e que na verdade você vai colocar para sacanar o tal cassete de gel em particular ele e então você conecta ele ao eletrodo para a placa de energia e que realmente permitirá a transferência da proteína do gel para a membrana da nitrocelulose.
(Consulte O Tempo De Deslizamento: 23:08) Em seguida, você transfere a proteína do gel para a membrana mais aquele lugar o Cassete de transferência no tanque preenchido com o tampão de transferência conecta os operadores de transferência para a fonte de alimentação e aplique a tensão constante após a transferência desmontar toda a fita e verificar cuidadosamente a transferência da membrana de transferência e verificar a transferência pela mancha de sapato de pênalti use um lápis e rotular o diferente o que significa se você conseguiu essas pistas e essas membranas você tem que escrever o número da pista.
Para que esse número de pista possa ser usado posteriormente quando você estiver fazendo o desenvolvimento de planta química ou estiver usando o autoradiogramy ou qualquer outro método, este número irá realmente permitir identificar a rota em particular.
(Consulte O Tempo De Deslizamento: 23:54) A etapa 4 você tem que fazer o bloqueio do bloqueio exatamente o mesmo e, em seguida, o passo 5, você tem que fazer a apuração. Por isso, na blot ocidental a proteína pode ser feita de 2 maneiras. Na apuração da etapa de 2 você tem que primeiro adicionar o anticorpo primário seguido pelos anticorpos secundários. Então, você tem que tomar a diluição adequada do anticorpo primário que você tem para adicionar o anticorpo primário seguido da lavagem e então você tinha que adicionar os anticorpos secundários ou em uma apuração de 1 passos.
O que você tem que fazer em um passo a si mesmo você adiciona o anticorpo primário que está contendo a enzima que significa o anticorpo primário que é rotulado com a enzima ou a sonda fluorescente, e que pode ser usado. Uma apuração de etapa é muito incomum, pois a análise de um passo não permite que você faça porque o nível de sensibilidade é muito baixo com a apuração de um passo.
(Consulte O Tempo De Deslizamento: 24:49) Em seguida, é preciso fazer o desenvolvimento do bloco. Existem múltiplas formas de desenvolver o bloco que está presente na membrana. Você tem os substratos cromogênicos baseados em HRP como 4-cloro-napthol DAB ou TMB ou você pode ter a enzima fosfatase alcalina também. Então; você para isso você pode usar o sistema BCIP/NBT ou você tem os substratos luminescentes como para o HRP, você tem o luminol e H2O2 ou para fosfatase alcalina você tem o fosfato de 1 2 de dioxetane substituido.
Então, todos esses substratos estão permitindo que você detecte as proteínas o que está sendo inchado sobre a membrana nitrocelulose ou você tem os métodos colorométricos ou tem os métodos quimioluminescentes. Assim, ambos os métodos estão realmente permitindo que você detecte as proteínas de detecção colorimétrica tem a menor sensibilidade em comparação com as detecções quimioluminescentes.
(Consulte O Tempo De Deslizamento: 25:49) Então, trata-se do blotting ocidental. Por isso, discutimos todos esses passos e depois também discutimos sobre como executar essas etapas. E agora, para mostrar como fazer essas experiências, eu vou gostar de levá-lo ao meu laboratório e onde os alunos vão realizar esses experimentos, onde eles realmente vão discutir cada um e cada passos como executar e quais são os diferentes passos que você deve tomar, como remover o ar aprisinado das bolhas de ar ou ar apriste entre o gel assim como o sanduíche.
Como processar a membrana? Então, que realmente vai ser útil para transferir as proteínas da página SDS para a membrana nitrocelulose ou a membrana PVDF. E com esses passos, você será capaz de entender o como realizar o western blotting em seus laboratórios.
(Início do vídeo: 26:40) Neste vídeo, vamos demonstrá-lo como fazer um blot ocidental e como analisar o resultado usando substrato de eletro-quimioluminescência ACL. Então, aqui o que nós vamos fazer temos que rodar gel primeiro, então vamos transferir o método de transferência como fazer a transferência vai mostrar neste vídeo. Em vídeo anterior já mostramos que como correr como preparar as páginas do SDS e como executar amostras de proteínas. Por isso, neste vídeo, particularmente estamos interessados em fatores associados ao blotting ocidental.
Por fazer blot ocidental precisamos de membrana e tampão de transferência e o Medium Transfer este aqui é usamos para transferir este gel de execução para membrana. Então, aqui a membrana pode ser de 2 tipos. Uma é a nitrocelulose que tem baixa eficiência de ligação de proteína e a natureza hidrofóbica outra membrana é PVDF esta é membrana hidrofóbica e maior capacidade de ligação de proteínas. Por isso, o processamento para a blot Western é diferente de diferente para a nitrocelulose e PVDF.
Se você estiver usando membrana PVDF, temos que tirar temos que cortar a parte se se você tiver leitores de corte pré-cortado pré-corte, então normalmente se você tem se está tirando de uma ligação, você tem que cortar precisamente quantos poços você deseja. Então, depois disso, você tem que rotular a frente no preto onde o lado da frente pode ser usado para transferir a proteína e isso pode ser usado na etapa anterior etapas adicionais também como incubação de anticorpos. Então aqui para se você quiser usar membrana PVDF você tem que cobrar com o metanol.
Assim, uma vez que o PVDF é uma membrana hidrofóbica, você não pode transferir diretamente a transferência no primeiro você tem que manter em metanol por pelo menos 20 minutes minutos. Então, depois disso pode ser chamado como tarifação. Então, depois disso, usaremos isso para transferência. Portanto, isso é pré-embebido em metanol e equilibrados em buffer de Transferência. Por isso, aqui fazendo transferência precisamos considerar algumas coisas que o tampão sempre deve estar em condição gelada.
Caso contrário durante essa transferência em alta voltagem ela irá gerar altas temperaturas para que possa degradar sua proteína ou diminuir a eficiência da transferência. É por isso que precisamos manter o tampão sempre em condição gelada e deixar começar a apresentação. Por isso, precisamos de um gel para que já tenhamos terminado o gel, além disso, também precisamos de esponjas, que darão almofada ao gel, para que o gel não possa ser destruído durante a transferência.
Portanto, este é o Cassete que utilizaremos para a transferência. Então, este é lado negativo de Cassete e este é o lado positivo. Então, nós vamos manter gel no lado negativo e o lado positivo a membrana da blot. Assim, quando aplicamos voltagem deste lado para este lado, a proteína negativa ela será transferida, ela será transferida para o lado positivo e será uma capturada na membrana. Por isso, primeiro por fazer essas esponjas precisamos manter e também isso talvez dar alguma ligação não específica para membrana.
Então, o que faremos, colocaremos folhas de blotting em cima disso. Então, depois disso você tem que remover bolhas de ar se algum presente. Então, uma vez que você inseriu a folha blotilhada, então você tem que manter o seu gel. Por isso, aqui quando temos que lembrar que gel depois de terminar o SDS está rodando você tem que manter em buffer de Transferência. Então, que vai dar condição idêntica ou equilíbrio tipo de coisa durante a transferência. Então, essa transferência de proteína pode ser fácil. Então, este é o gel e mantendo-se no lado negativo.
Então, depois disso temos que sobrepor com a membrana. A seguir temos que remover quaisquer bolhas de ar. Temos que sobrepor outra folha de blotting e remover as bolhas de ar. Cada vez mais quando se apresenta algo é preciso remover um bolhas de ar. Então, esta é a folha final. Então, este é o lado positivo do Cassete. Só como assim, estes são os parafusos que temos para apertá-lo em seguida, apenas o contato entre o gel e a membrana será suficiente para ser transferido.
Primeiro você não aperta inicialmente você apenas mantém e depois dessa prensa o lado positivo daquele cassete então aperta o parafuso. Então, todas essas coisas devem ser feitas no buffer de transferência somente a menos que especificado. Portanto, este é o buffer de transferência de refrigeração. Agora vamos fazer transferência. Despeje tampão suficiente. E guarde este pacote de gelo também se o resfriamento não for suficiente, então pode haver geração de calor. Por isso, para evitar isso, usaremos este pacote de gelo. Então, isso manterá o buffer cool até o fim de transferência da transferência.
Então, uma vez que isso acabou, você tira diretamente o cassete e fica. Se houver uma insuficiência de amortecedor, você pode adicionar em cima disso. Certifique-se de que o cassetete completamente submerso, para que a transferência seja adequada e não haja bolhas de ar. Então, uma vez que o setup acabou, agora, você pode transferir. A transferência está indo bem. Então, quanta voltagem precisamos dar, depende de transferência para transferia-lo varia. Geralmente em nosso laboratório daremos pelo menos 2 horas de transferência ele 120 volts o que é suficiente para transferir quando proteínas de baixo peso molecular também.
Mas, do instrumento para o instrumento também ele varia. Precisamos que você tenha necessidade de otimizar antes de fazer transferência. Depois de 2 horas, temos que remover a blot e incubar com o tampão de bloqueio. Então, eu vou parar aqui remover o cassete guarde que em uma bandeja, retire os parafusos corretamente retire suavemente os Sponges. Tire o blot e guarde-o em buffer de bloqueio. Nessa condição, temos que manter se você está mantendo a temperatura ambiente, ela fica por 2 horas pelo menos.
Se você estiver se mantendo em 4 graus Celsius, você pode manter durante a noite o armazenador de tampão de bloqueio de skim ou BSA junto com tween-20. A transferência da blot ocidental é tudo depende da eficiência, como exatamente você está fazendo a transferência. Por exemplo, você não deve usar as próprias mãos enquanto manuseio o blot ou gel. Assim, quaisquer que sejam as proteínas presentes em seus dedos, ele será transferido em gel ou membrana que dará alto plano de fundo durante o desenvolvimento da blot.
Então, sempre use luvas. Fora isso, enquanto manuseio o instrumento, certifique-se de que pode haver possibilidade de eletricidade o choque pode acontecer algum dia. Então, nós temos que esse tempo também precisamos usar luvas e depois de finis