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Imunoprecipitação Olá todo mundo, este é o Dr. Vishal Trivedi do departamento de biociência e engenharia IIT Guwahati e o que estávamos discutindo, estávamos discutindo sobre os diferentes tipos de ferramentas imunológicas, o que você pode usar. Por isso, em nossas palestras anteriores, discutimos sobre como você pode ser capaz de gerar a policlonal assim como os anticorpos monoclonais e, em seguida, posterior a isso, estávamos discutindo sobre como os anticorpos estão interagindo com o antígeno.E como essa interação pode ser explorada para projetar diferentes tipos de ferramentas imunológicas para responder aos diferentes tipos de problemas biológicos. Por isso, seguindo essa discussão, hoje, vamos discutir poucos mais analíticos ferramentas imunológicas, onde o anticorpo e antígeno e estão interagindo com cada um dos outros.(Consulte o Tempo do Slide: 01:55)Então, é isso que estávamos discutindo de modo que o antígeno se ele é natureza insolúvel, você pode realmente ser capaz de realizar as aglutinações ou se ele é solúvel na natureza, você pode ser capaz de realizar a precipitação assim como o imunoensaio radial bem como o imunoprecipitations. Então, na palestra de hoje ’ nós e subseqüentes a isso, temos também o planejamento de discutir sobre os diferentes tipos de imunoassay que também são baseados nas interações antigénio de anticorposcomo a ELISA RIA e um western blotting. Por isso, subseqüente aos imunoensaios radiais, vamos agora discutir sobre as imunoprecipitações.(Consulte o Tempo do slide: 02:37)Então, imunoprecipitação o princípio básico é muito simples, o princípio é que onde você vai levar as esferas vazias e essas esferas vazias na verdade vão ter os grupos funcionais. Então, com a ajuda desse grupo funcional, o que você vai fazer é você vai anexar o anticorpo em particular, esses anticorpos realmente vão ser um específico para um antigénio particular. E então o que então essa esferas vai ser preparada.Em nós em um paralelo, o que você vai fazer é você vai quebrar a cela e vai preparar um liso de celular. E neste liso de celular, você vai ter os diferentes tipos de proteínas, que eu estou mostrando com os diferentes tipos de esferas ou diferentes tipos de esferas de cores. Portanto, estes são todos os antígenos potenciais, que realmente podem interagir com esse anticorpo, e realmente podem dar a você o que realmente pode ser isolado a partir dessas particularidades celulares lisboeta.Então, na terceira etapa, o que você vai fazer é que vai incubar esses anticorpos ligados à célula, que realmente contém diferentes tipos de anticorpo, tipos diferentes de antígenos, e então quando você faz as incubações faz algum desses fatores proteináceos de antígenos vai ligar o anticorpo e então você vai fazer uma etapa inicial de lavagem e então você vai fazer o identificação deste antigénio em particular com a ajuda de váriastécnicas como você pode executá-lo na página SDS ou você pode fazê-lo como a coloração de prata ou você pode fazer o western blotting com os anticorpos adicionais como executar este assay.(Consulte o Tempo do slide: 04:24)Então, para realizar este assay, estes são o material a seguir que você exige primeiro você requer um tampão de lise este tampão de lise é necessário para preparar um liso de lise. Por isso, tem todos os componentes como o tampão, depois NaCl e depois tem o detergente e depois também tem o inibidor de protease. Portanto, este é um inibidor de protease que você tem que adicionar pouco antes de reconstituir o tampão de lise. Assim, o inibidor de protease vai, na verdade, proteger o liso celular da degradação pelas proteases que vai se apresentar no liso celular.Além disso, você também exige um tampão de lavagem. Então, lavar tampão é exatamente esta competição como o tampão então você requer EDTA NaCl e NP 40. E então você também requer uma pequena centrífuga para que você possa ser capaz de fazer a pilotagem e tudo mais.Você assiste a mistura A-sepharose tenta em tampão de lavagem contendo 900 milli molar NaCl. Então, esta é a consulta de alto site que você vai usar, então, que você irá remover a proteína não especificamente ligada aos anticorpos assim como às esferas para remover a ligação não específica. Por fim, lave a mistura uma vez em um tampão de lavagem. Por isso, agora, uma vez que você é feito com a lavagem com o tampão da licença, além de lavar com o tampão de lavagem, sua amostra já está pronta. E agora o que você pode fazer é elucidar os antígenos dos anticorpos e então você pode ser capaz de analisá-los.(Consulte o Tempo do slide: 08:09)Então, na etapa subsequente na etapa 3, você vai fazer a análise ou amostra na página do SDS. Assim, você retira o sobrenadante após a centrifugação em alta velocidade para a proteína A-sepharose esfolia esferas em 800 microlitros de 1 x SDS gel carregando tampão e ferva-o por 4 minutes de carga a amostra no grande poço do gel de gradiente de página SDS descontínua e rode o gel a uma temperatura constante de 10 miliamps. Então, uma vez que você tem as esferas, que na verdade tem os anticorpos e anticorpos são ligação para o antigénio particular do liso de células você toma aquelas esferas, lave-o remove o supernatante e depois você adiciula o buffer de carregamento de 1 x SDS e então você o aquece e ferve-o. Por isso, nesse processo todo odeterminante intergênico porque o anticorpo vai ser desnaturado quando você o faz, e o anticorpo vai liberar o antígeno para o sobrenadante. E aquele sobrenadante você pode carregá-lo na página do SDS.Nesse caso, estamos usando a página de SDS gradiente para que a resolução vá ser ainda melhor. E então você a administra por em constante corrente por 10 miliamps. Porque nós queremos, não queremos criar o calor no sistema para que haja uma desnaturação do antígeno. É por isso que você tem que executá-lo em uma corrente de 10 miliamps a uma taxa muito, muito lenta. Para que ele realmente vá resolver as amostras, mas não vai esquentar as gelas.Então você vai para 4 o passo 4 você pode visualizar as proteínas com a ajuda do azul coomasie (()) (09:45) coloração azul ou a coloração de prata mais sensível nisso é estágio o que você também pode fazer é você pode pegar o gel SDS, e na verdade pode fazer o western blotting com um anticorpo específico. Por exemplo, se eu estou esperando que o actina seja apresentado com um ligado aos anticorpos, o que eu posso fazer é só posso pegar esse supernatante carregá-lo na página do SDS.Eu posso fazer uma coloração com a coomasie ou prata colorida para verificar que estou recebendo uma banda muito próxima destes ao nível do actina, mas alternativamente o que eu posso fazer é simplesmente transferir esse gel para uma membrana de nitrocelulose e então eu posso fazer um western blotting com os anticorpos de actina NT, e que na verdade vai me dar as informações específicas sobre a proteína o que está presente na página do SDS se é uma proteína actina ou alguma outra proteínas.(Consulte o tempo de deslizamento: 10:40)Os resultados a proteína interagindo dará uma banda extra no gel SDS e pode ser ainda mais caracterizada por meio da análise da proteína na página do SDS com outro anticorpo em uma blot ocidental. Então, esse é um resultado típico o que se vê. Por isso, na pista 1 carregamos a pista de marcadores moleculares 1 é na verdade apenas anticorpos, a pista 2 é na verdade as esferas mais liso e a pista 3 é na verdade a reação completa.Então, o que se pode ver é a pista 1 está mostrando alguma banda porque parte da proteína vai se ligar aos anticorpos, a pista 2 está mostrando mais número de bandas e essas são a banda não específica que na verdade é ligação para o anticorpo, além de encadernação para as esferas. Então, esses 2 realmente vão ser estes 2 proteína que são obrigatórias para as esferas assim como a proteína que são obrigatórias para apenas anticorpos ou tem que ser subtraída.E então você pode realmente ser analisado a amostra que está realmente no número 3 onde o anticorpo bem como o bead mais liso está presente. E nisso o que você vê é que há bandas específicas que estão aparecendo nisso e agora o que você pode fazer é também fazer um blogue ocidental dessa amostra com os anticorpos anti-anticorpos específicos ou antigénios que o antigénio que você está esperando que deve apresentar neste particular imunoprecipitações.Ou em alguns casos, se você não tem certeza, então você pode passar com o peso molecular e então você pode provavelmente fazer uma adivinhação inteligente e então realmente ser capaz desondar a página do SDS com o anticorpo em particular e reconhecer ou identificar este particular proteína em uma abordagem genérica, se você não conhece nenhuma dessas coisas ou não sabe até mesmo o caminho, então o que você deve fazer é ter que tirar aquela proteína particular do gel que você tem que fazer (()) (12:36).Então, que ela deve produzir o peptídeo e então você pode enviar esse peptídeo para a espectrometria de massa e então você pode fazer os estudos de proteômica e então realmente isso também permitirá identificar essa proteína específica. Agora, além da imunoprecipitação, em que você está realmente usando o anticorpo como uma sonda, então, que ele irá se ligar às esferas e então você pode usar que amarrar os anticorpos de ligação de ligação para obter as proteínas do liso celular ou obter o antígeno do liso celular.Muitas pessoas também estão usando ou também realizando uma versão levemente derivada disso, que é chamada como o ensaio de retirada. Por isso, nos ensaios de retirada, você está usando os anticorpos ou também está usando a alguma outra proteína que é ligação com as esferas. Então, vamos discutir sobre a redação do pull-down que na verdade é uma modificação dos ensaios de imunoprecipitação.(Consulte o Slide Time: 13:38)Então, em uma redação de recuo, o que as pessoas estão fazendo é que estão tomando um GST esferas e banhos de GST tem o grupo funcional. Então, esse grupo funcional do grupo GST está presente e aquele grupo funcional. Então, eles estão preparando os 2 baits um é o bead de controle onde você tem os banhos GST com um grupo funcional o outro é a sonda bead ou sonda bead. Então, onde você está realmentetendo as esferas do GST e sobre o grupo funcional você tem a sonda esta sonda também é chamada como proteína de bait.Então, aquela proteína de isca é uma proteína específica sobre a qual você está interessado em ver quantas proteínas estão interagindo e então o que você faz é pegar a célula você colchete com o tampão de lise para gerar o liso celular e o liso de células realmente contém os diferentes tipos de antígenos e então o que você faz é dividir o liso celular em 2 reações e então você incuba estes com os estes 2 de preparação das esferas e então estas 2 esferas são na verdade vai ligar a proteína não específica.Por exemplo, neste caso ele tem amarrado esta proteína particular então este e enquanto que neste caso ele tem amarrado a proteína de cor amarela assim como a proteína de cor rosa. Então agora o que você faz é fazer uma lavagem e então você faz a identificação da proteína com a ajuda dos diferentes tipos de corantes analíticos disponíveis ou diferentes tipos de western blotting via experimentos. Assim, como realizar o ensaio de retirada de pull-down.(Consulte o Tempo de deslizamento: 15:14)Então, a quantidade de sonda que significa a proteína de fusão GST e a proteína de controle adicionada deve ser uma proporção molar equi incubada o tubo por 1 hora em 4 grau com mixagem, então a etapa 3, você centrifuga a amostra na velocidade máxima e em um microfuge, que significa como 15.000 G.(Consulte o Tempo do slide: 18:36)Então você vai para a etapa 4 e a etapa 4 é uma etapa de lavagem. E lembre-se que o que quer que você esteja fazendo, seja fazendo a imunoprecipitação ou faça os ensaios de retirada, você sempre tem que manter os sobrenadantes que tem para continuar salvando o sobrenadante. Então, que se não haverá nenhuma proteína presente após a etapa final, você pode ser capaz de cruzar verificar em que passo você fez algo errado para que os complexos de proteína sejam vínculos com as esferas, mas eles foram descolados para que você possa realmente variar ou você pode ser capaz de otimizar a condição de buffer.Então, que profundo, ele realmente permite que os complexos proteicos venham e se unam às esferas, pois isso é muito importante para monitorar. Por isso, é por isso que em cada fase em que você está fazendo a fiação e jogando o sobrenadante em vez de jogar o sobrenadante você preserva aquele sobrenadante em tubos adicionais de eppendorf para que você possa cruzar verificar se lá alguma coisa dá errado com os experimentos. Por isso, na etapa 4, você vai fazer uma lavagem lavar assim as esferas com 1 ml de lise gelada GST de gelo bufou duas vezes, usando uma centrífuga na velocidade superior para 1 minute.E então você descarta o sobrenadante embora eu esteja escrevendo descarte o sobrenadante mas como eu disse, você sabe que tem que preservar o sobrenadante para verificação cruzada se algo der errado. Então a etapa 5 você vai fazer eluição para elucutar a proteína de fusão GST e qualquer proteína ligada a ela adicionando os 50 microlitros de 20 milli molar reduzido glutationa em 50 milímetro HCl para as esferas, centrifugar as esferas por 2 minutes em uma micro centrifugação e então você preparar a amostra. Por isso, misture a bead ou a proteína eluída com uma quantidade igual de 2 x tampão SDS e ferva-o por 1 minute e analise na página do SDS.(Consulte o Tempo do slide: 20:28)O passo 7 você vai fazer a análise na página SDS a proteína associada à proteína de fusão poderia ser analisada usando a coomassie ou a coloração de prata por imunoblotting para uma análise de proteína específica e também pode ser analisada usando a espectrometria de massa em alternativas de para isto é que se você usa a radioatividade ou se usa a proteína rotulada radioativamente do liso, então você também pode realizar o audiograma automático a verifique a presença de uma proteína particular deou você pode simplesmente fazer rádio de auto de rádio e isso realmente vai dar o padrão das proteínas.(Consulte o Tempo do slide: 21:08)Deixe-nos ver como os resultados se parecem. Por isso, nos resultados, você vai ver uma banda extra na coomassie ou a banda específica com o imunoblot mostrando a especificidade da proteína. Então, o que se pode ver esta é uma das imagens representativas da literatura e o que se vê é que este é o marcador, então o número 1 é na verdade a sonda GST, que na verdade é a sonda GST, que na verdade o passo 2 é o GST, que na verdade é o GST sozinho, e então o passo 3 é realmente a sonda sozinho.Então, o que se pode ver é, na verdade, a banda da sonda, o que está presente na reação número 1 e esta é a banda do GST e esta é a banda do GST e o que se pode ver é que estas 2 bandas que estão presentes nesta reação completa são, na verdade, são uma proteína específica que estão interagindo com a proteína bait ou o pro proteína. Então, essas são as proteínas específicas podem ser identificadas por múltiplos métodos ou você pode ir com a abordagem proteômica, o que significa, você pode simplesmente simplesmente fazer o isolante dessa proteína do gel e então você faz o (()) (22:19) e jusante todas as etapas de proteômica.E então você acaba podendo fazer a espectrometria de massa e identificar ou você pode realmente fazer um western blotting com um anticorpo específico, que na verdade você pode dizer simplesmente porque se você sabe o peso molecular dessa proteína, então você pode dizer qual será o peso molecular dessa proteína particular e é assim que você pode ser capaz de identificar essa proteína particular. Então, esseé tudo sobre os ensaios de retirada ou os ensaios de imunoprecipitação, onde você está usando o anticorpo como todas as colunas de afinidade para recuperação ou para isolar um antígeno específico do liso celular.(Consulte o Tempo do slide: 23:02)Agora, vamos seguir para os imunoassays. Assim, um dos imunoassos é o ELISA, ELISA é uma técnica imunológica usada para medir o nível de anticorpos ou antígeno no fluido do corpo, ela tem sido usada em diagnósticos para identificar o antigénio ou os anticorpos reativos cruzados, ELISA pode ser realizada de diferentes formas para medir o anticorpo ou o antigénio. Sendo assim, o ELISA pode ser realizado como ELISA direta ELISA, indireto ELISA sandwich ELISA assim como o ELISA competitivo e todos estes ELISAs são realmente projetados para medir o nível dos anticorpos ou para a medida o nível de antígeno. Então, vamos discutir sobre cada um e cada ELISA em detalhes.(Consulte o Tempo do slide: 23:48)Então o ELISA direto no ELISA direto o antigénio direto é primeiro revestida sobre uma placa multi bem e então você está detectando um anticorpo primário vinculado que significa que você vai dar um bem, você o bata com o antígeno o que você está interessado em identificar e então você vai adicionar o anticorpo primário que significa que você vai adicionar o anticorpo que na verdade é acoplado a uma enzima e então o que você pode fazer é você apenas adicionar o substrato e esse substrato vai dar a cor ou substrato é na verdade vai dar algumas releituras.É simples e rápido executar devido às etapas mínimas necessárias. Sendo assim, essa é a vantagem do ELISA direto. Mas o ELISA direto só depende da especificidade dos anticorpos primários, o que significa que não há controle. Então, é por isso que se existe algum problema com a especificidade do anticorpo primário, ele realmente vai dar-lhe os falsos resultados positivos. É por isso que a especificidade do anticorpo primário pode ser afetada pela enzima que liga o anticorpo primário e é por isso que é muito, muito problemático realizar.Porque uma vez que você tem o anticorpo primário você tem que fazer uma reações de acoplamento para que a enzima vai ser acoplada ao anticorpo primário e nesse processo algum tempo, ela realmente afeta a especificidade do próprio anticorpo. A segunda coisa é porque não tem a etapa de amplificação porque, se você assim, o sinal vai ser tão proporcional à quantidade de anticorpo primário ligado ao antigénio.Então, se você tiver um anticorpo monoclonal por exemplo, então ele vai realmente interagir apenas com os epítopos únicos o que está presente sobre um determinado antígeno e nesse caso, o sinal vai ser menos muito baixo em comparação com se você estiver usando um anticorpo policletonal. E assim, se o sinal for baixo, ele realmente vai afetar diretamente a sensibilidade do também.(Consulte o Tempo de Slide: 25:56)Então você tem o ELISA indireto. Por isso, no ELISA indireto, o que você está fazendo para fazer é realmente estar revestida a superfície com o antígeno então você está coando o anticorpo primário para detectar o antigénio e depois você está adicionando o anticorpo secundário para detectar o anticorpo primário e então o anticorpo secundário está tendo a enzima e então você está realmente adicionando o substrato e esse substrato está sendo convertido em um produto.E esse produto está dando a você a cor ou as releituras legíveis e isso realmente pode ser feito. Então, no secundário. Então, esse tipo de ELISA indireta está sendo usado tanto para medir o nível de antigénio como para medir o nível dos anticorpos. Assim, essa configuração é usada para medir o nível de anticorpos no soro e o uso para calcular o titer dos anticorpos na configuração ELISA indireta uma quantidade conhecida de antígeno é revestida sobre o poço e é incubada com diferentes diluições dos anticorpos.O anticorpo ligado antígeno é então reconhecido por um anticorpo secundário ligado à enzima um substrato colorimétrico é usado para medir o nível de anticorpos. Por isso, vejamos como realizar o ELISA indireto.(Consulte o Tempo do slide: 27:20)E quais são os materiais que você é necessário. Então, os materiais o que você exige é o tampão bicarbonato que você exige para o revestimento então você requer a placa Elisa que é o que você requer para o revestimento do antigénio então você requer a solução de antigénio de 5 micrograma por ml no tampão do bicarbonato pH 9,2 então você requer o anticorpo do bicarbonato e então você requer o anticorpo primário e o anticorpo secundário e então você requer o PBS que contém o Tween 20.(Consulte o Tempo de Slide: 27:57)Então, em um procedimento, o que você vai fazer primeiro você vai fazer o revestimento do antigénio sobre as placas discadoras de placas, então você vai incubar que com o anticorpo primário, então você vai remover você vai fazer uma etapa de lavagem para remover os anticorpos de unbound,então você vai adicionar os anticorpos secundários então você vai fazer uma lavagem para remover o excesso de anticorpos e então você vai adicionar o substrato e que na verdade vai dar as cores. Vamos ver como executar essas etapas.(Consulte o Tempo do slide: 28:33)Então, na etapa 1 você vai fazer um revestimento de antígeno. Então, você prepara o micrograma de 5 por ml de soluções antigénio em um tampão de bicarbonato dispense os 50 microlitros por poço da placa de microtiter coloque-o durante a noite dentro da geladeira e isso é suficiente para que o antigénio bata até a placa de microtiter então você vai fazer uma etapa de bloqueio. Por isso, na etapa 2 você bloqueia cada bem com o 1% BSA em um amortecedor de bicarbonato durante a madrugada. Essa etapa de bloqueio é necessária porque quando você está revestida o antígeno, você está realmente revestida o antígeno em um poço.Então, você vai ter as diferentes moléculas de antígeno, mas em entre a molécula de antígeno este este espaço está vazio o que significa como o plástico está vazio e este plástico pode facilmente fornecer o local de fixação para os anticorpos primários. Por isso, antes de adicionar o anticorpo primário, você tem que preencher toda essa cavidade ou preencher com isso tudo bem com nossa solução proteinácea para que você realmente cubra toda a superfície. Então, o bloqueio não vai bloquear os sites epitópicos em relação ao antigénio mas ele realmente vai bloquear todas as superfícies restantes o que está disponível no poço.(Consulte o Tempo do slide: 29:54)Agora foi uma vez que o seu bloqueio acabou então você pode preparar as diluições de anticorpos primários. Então, você pode fazer uma diluição de 1 é para 100, 1 é para 1000, 1 é para 2000 assim, então o que você tem que fazer é ter que levar esses 1 e 20 microlitros de soro original e então você mistura com 198 microlitro de PBS que realmente vai dar um 200 microlitro de 1 é para 1000 diluído então você tem que fazer um estoque de anticorpo diluído em série e que realmente pode ser usado em uma etapa subsequente para as incubações.Então você dispense os 50 microlitros de cada estoque de anticorpo diluído em seu bem, e então incubado por 45 minutes por 37 graus Celsius.(Consulte O Tempo De Deslizamento: 30:59)Em seguida, na etapa 4, você vai fazer uma lavagem tão na lavagem por 4 5 minutos com o PBS contendo tween 20. E então o passo 5 você tem que adicionar os anticorpos secundários. Então, você tem que adicionar a concentração adequada do anticorpo secundário, e então dispensar o micro litro de 50 por poço e incubar em 37 graus Celsius por mais 45 minutes minutos. Na etapa 6, novamente, você tem que lavar para que os anticorpos secundários da camada de acesso possam ser removidos.E então na etapa 7, você vai fazer um desenvolvimento então dispense 1 mg por ml OPD mais H2O no buffer de citrato. Pare a reação por 7,5% ácido sulfúrico e leve a absorbância em 460 nanômetro. Por isso, vamos ver como os resultados vêm.(Consulte o Tempo do slide: 31:47)Os resultados vão te dar como este onde esta é a maior concentração de anticorpos e esta é a menor concentração de anticorpos. Então, o que se vê é uma reação de cor laranja que é uma cor o que você recebe quando se usa a OPD e o que você e se trafegam essas absorvências contra a concentração do anticorpo, o que se vê é que na verdade vai dar uma curva sigmoidal e conosco usando esta curva sigmoidal, você pode ser capaz de determinar o titer dos anticorpos.Então, trata-se de tudo sobre os passos teóricos o que temos discutido sobre a Elisa indireta. Agora, para mostrar todos esses passos, posso levá-los ao meu laboratório para mostrar a vocês uma pequena demo e com esta demo, vamos mostrar a vocês cada passo e, em seguida, finalmente os alunos estão indopara mostrar o desenvolvimento de Elisa assim como isso realmente vai ser útil para você entender todo o processo.(Video Starts: 32:51)Nesse vídeo vamos demonstrar como usar um kit de detecção de infecções patogênicas e qual é o princípio subjacente disso. Assim, principalmente os kits de detecção, versão imunoassay. Assim, o que é um imunoensaio em imunoensaio, utilizaremos anticorpos específicos como anticorpos monoclonais contra doenças específicas ou patogênicos antígenos específicos antigénios, depois desenvolvamos no substrato. Então, isso dará alguma cor pastosa e que será detectada por leitura espectrofotômetro.Então, os passos incluem primeiro passo é temos que caber a placa de cloreto de poliamida da placa com o anticorpo de captura após captura do antígeno real, antigénio específico da doença. Por suponhamos na maioria dos casos em infecção viral, detectará a proteína do casaco e na infecção bacteriana, o externo (()) (34:02). Esse tipo de antígeno ele vai detectar. Uma vez que o anticorpo é revestido na placa, então iremos incubar com a amostra retirada de paciente em lá ela é saliva ou amostra de soro.Após a incubação, lavaremos adequadamente em seguida, novamente, incubaremos com o anticorpo primário específico para aquele antigénio específico. É ela principalmente deve ser anticorpo monoclonal, caso contrário, essa detecção é não específica. Na próxima etapa, após lavarmos o anticorpo primário sem limite, iremos incubar com o anticorpo secundário que é septravidin conjugado ao HRP. Assim, uma vez que a incubação do anticorpo secundário acabar, lavaremos e essa solução de substrato principalmente ela é TMB ou variantes de TMB também disponíveis para detecção de cromophoria aprimorada.Então lemos o desenvolvimento de cores usando espectrofotômetro. Estes são os passos principais. Por isso, no passo a passo, agora, vamos demonstrar como realizar o imunoensaio a fim de realizar um imunoensaio precisamos dos seguintes materiais. Primeiro precisamos de cloreto de poliamida bem placa 96 bem placa que deve ser plano inferior, depois os outros materiais que precisamos é tampão de revestimento que é o sistema tampão bicarbonato que pH 9,6. Então, uma vez que estiver pronto você está ajustado pH então vamos diluir o anticorpo de captura no tampão de revestimento.Em seguida, adicionar 100 microlitros dispense cada um para este dispence. Então, uma vez que o dispense acabar, então vamos incubar essa placa a 4 graus Celsius preferencialmente, mas podemos incubar em temperatura ambiente também por 2 horas. Se você está incubando a 4 graus Celsius você tem que mantê-lo durante a noite, caso contrário, 2 horas é suficiente. Então, agora temos o buffer de revestimento Então, eu dispensado em reservatório então eu vou pegar o anticorpo de captura. Temos que ver a diluição.Com isso, gostaria de concluir minha palestra aqui e no vídeo do demo, o aluno poderia ter discutido detalhinho sobre os diferentes passos relacionados à Elisa e espero que isso seja útil para você realizar o assê em seu laboratório. Então, com isso, eu gostaria de concluir minha palestra aqui. Obrigado.