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Module 1: Adsorção de Proteína

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Olá a todos, bem-vindos a outra palestra para Engenharia de Entrega de Drogas e Princípios. Vou falar mais sobre a adsorção de proteínas.
(Consulte O Tempo De Deslizamento: 00:36)

Então, vamos apenas fazer uma rápida recapitulação do que aprendemos na última aula. Por isso, na última aula falamos sobre proteínas pré-adsorventes em superfícies, o que significa basicamente que se eu quiser um certo tipo de resposta de uma superfície, digamos que se eu quisesse ligar essas células, então o que eu posso fazer, eu posso adicionar proteínas de ligands na superfície mesmo antes de colocá-las com as células, então o que vai acontecer é, essas proteínas vão adsorver na superfície e vão começar diretamente a interagir com a célula com seu certo receptor de conhaque.
Então, a vantagem aqui é, eu fico muito mais controle sobre minhas superfícies porque agora eles estão interagindo do jeito que eu quero que eles interajam. E então o certo há muitas aplicações disso que você pode variar para classificar de modulada esta resposta que você está recebendo. Em seguida, falamos sobre um modelo que está sendo usado para estudar adsorção de proteína um deles era um modelo monolayer. Então, o que é? Significa que nos deixe dizer se eu tenho uma superfície, significa apenas que haverá apenas uma camada de proteína, que vai adsorver na superfície para cobrir o que for área exposta e uma vez que essa camada tenha uma adsorb não mais preabsorção acontecerá.
Então, essa é a suposição neste modelo de monolayer e novamente discutiremos hoje que isso não é verdade, mas para o bem deste modelo, será uma orientação como esta não haverá mais proteína que vai vir adsorb aqui. E então ao mesmo tempo discutimos sobre proteínas duras e macias. Por isso, o que estamos dizendo é que existem algumas proteínas que são bastante dificias com um significado bastante rígido não alteram a estrutura muito facilmente a estrutura é muito estável e então há algumas proteínas que são muito propensas à desnaturação, sua estrutura é facilmente mutável. Então, estes são chamados de proteínas suaves.
E então falamos sobre orientação de proteínas e estrutura dizendo essencialmente que se eu voltar a ter uma superfície que está exposta a baixa concentração de proteína. Então, o que vai acontecer é, na proteína que está inicialmente ficando adsorvida terá tempo para se expandir na superfície porque ainda tem esse lado aberto ao lado. Assim, ele vai se manter em expansão até que ou o local fique cheio ou a proteína chegue ao seu estado feliz em termos de equilíbrio.
Portanto, este é um caso em um cenário de baixa concentração enquanto que, se eu tiver alta concentração então o que vai acontecer é, a proteína que fica inicialmente adsorvida não terá espaço deixado por causa da alta concentração como várias outras proteínas também a adsorb e ela tenderá a estar em maior quantidade em uma determinada área da unidade ou o tipo dado da estrutura da proteína também permanecerá mais ou menos rígida ou não mudará muito um lote inteiro.
E então falamos sobre a wetbilidade da própria superfície. Então, o que nós estávamos dizendo é se temos superfície hidrofóbica, significando que ela tem baixa wetbilidade; então ela tenderá a formar laços muito fortes com proteínas, pois o ambiente de água exterior não está competindo com ele e os domínios hidrofóbicos tenderão a interagir com essa superfície hidrofóbica também a superfície também não quer interagir com a água. Então, há um processo energeticamente dirigido, que causa muito mais interação entre proteína e superfície hidrofóbica em comparação a nos deixar dizer que esta é uma superfície muito hidrofílica e então as proteínas vão dar adsoriamento celular a ele, mas sua afinidade com a superfície será muito mais baixa.

(Consulte O Tempo De Deslizamento: 04:18)

Então, agora tendo feito tudo isso, como mencionei brevemente esse modelo monolayer é um modelo que não é realmente bem aceito neste momento porque cada vez mais pesquisas mostraram que na verdade se formam múltiplas camadas de proteína em uma superfície. Então, para explicar isso o seu simplesmente outro modelo é proposto este é um modelo multicamada.
E o que significa, essencialmente, é que há uma estrutura 3D para uma proteína esta interface. Então, mesmo que eu tenha uma superfície, poderia haver várias camadas de proteínas que vão vir e anexar a ele. E essencialmente o que vai acontecer é o seu definido como uma espécie de corona dura e macia. Por isso, uma corona dura é definida como algo que é bastante estável em uma superfície, é muito difícil arrancar essa proteína da superfície. Então, algo que está diretamente interagindo com o material e ele é muito próximo do material é tipicamente chamado de corona dura e algo que então vem e depois interage com essa corona dura é chamado de corona macia.
E toda a razão para a corona macia acontecer e esta pode ser nanopartícula ou o implante, não tem de ser uma partícula pode ser um dispositivo a granel e a razão pela qual esta corona macia comece a interagir a corona dura porque esta corona dura tem na verdade uma mudança na estrutura. Então, isso não é representado nesta imagem, mas digamos que esta proteína circular agora se tornou elíptica onde sua adsorb. Então, ela agora expôs novos locais ao corpo que nunca foram expostos anteriormente. Então, agora, poderia haver uma outra proteína que vem e espécie de anexação a esses locais expostos e tem alguma afinidade com eles. Então, é por isso que você fica com a corona macia e pode não ser uma interação muito forte naquele ponto, mas eles celulares alguma interação para ele.
Então, como novamente é retratado aqui também, então você tem uma superfície física, então você tem alguma quantidade de proteína que vem e então existe alguma outra proteína que vem em cima dessas proteínas e isso essencialmente cria uma corona inteira de proteína em torno de uma partícula.
(Consulte O Tempo De Deslizamento: 06:34)

E então há um outro conceito chamado adsorção competitiva. Então, o que isto é, é a proteína adsorvida de equilíbrio na composição é definida pelo quanto é a proteína total primeiro no local e depois qual é a concentração relativa de proteína. Então, isso é fenômenos muito complexos e muito muito mal compreendidos para a maioria dos materiais que usamos e então a cinética deste também se tornou importante. Então, o que ele essencialmente está dizendo é, é novamente se eu tiver uma superfície, primeiro de toda a quantidade de proteína que está chegando depende da quantidade total de proteína que está ficando adsorvida.
Depende de quantos tipos de proteínas existem, então também vai depender do que são as suas concentrações. Por isso, tudo claro, nem todas as proteínas terão a mesma concentração-algumas terão muito alto, algumas terão muito baixo e então a cinética também se torna importante. Então, se nos deixar dizer uma proteína mesmo sendo uma concentração menor, ela fica completamente adsorvida na superfície muito rapidamente, então aquelas vão dominar ou de outra forma vice-versa vai acontecer para outros tipos de situações.

Assim, a cinética dessas adsorção de proteínas e novamente a cinética de diferentes proteínas será diferente e então também é dependente do tempo e da localização do implante e por que estou dizendo que é porque o que vai acontecer ao longo do tempo é deixar-nos dizer que o ambiente está mudando, mais células entrando, elas estão secretando mais proteínas e as concentrações de proteínas estão mudando, os tipos de proteínas estão mudando e por causa disso o que vai acontecer é esse equilíbrio que está sendo mantido vai mudando constantemente ou se o implante realmente está se movendo ou deixa-nos a sua partícula que é atravessando o corpo e depois é claro, você terá efeitos diferentes ocorrendo naquele momento.
Por isso, essencialmente dizendo que a camada adsorvida dessa composição é bastante dinâmica e tipicamente como eu descrevi anteriormente a corona dura ainda é bastante estável, mas pode ser dinâmica e o que também pode acontecer é que inicialmente as proteínas que são adsorvida podem ser deslocadas por outras proteínas ao longo do tempo com afinidade muito alta. Por isso, digamos que se eu tiver uma proteína adsorvendo em uma superfície com certa afinidade x e então eu tenho outra proteína com afinidade de 4 x, mesmo que essa proteína esteja em uma concentração menor e talvez tenha demorado tempo para se difundir para a superfície e x já esteja adsorvida para ela, o que vai acontecer é essa proteína será capaz de, lentamente e lentamente, ser capaz de dispensar isso e ficar adsorvida lá porque um equilíbrio diz que a afinidade mais alta vai dominar sobre a menor afinidade. Assim, para este fenômenos em particular onde essencialmente as proteínas de afinidade mais alta conseguem substituir as proteínas de afinidade inferior da superfície é também conhecido como efeito Vroman-você verá que usamos bastante um pouco na literatura. Então, só algo para lembrar.

(Consulte O Tempo De Deslizamento: 10:08)

Por isso, novamente apenas para resumir essa adsorção de proteínas, por isso estamos dizendo que materiais estranhos sintéticos adquitam bioreatividade apenas depois de primeiro interagir com proteínas dissolvidas.
Então, quer dizer, mesmo que eu tenha um material que não tenha sítios que possam ligar para a célula, o que vai acontecer são as proteínas vão adsorver-se a ele, essas proteínas terão sítios que podem se ligar à célula e é assim que eles podem mediar a interação celular e dá bioreatividade à superfície.
E qualquer tipo de interação celular ou interação enzimatizada que vai acontecer será mediada por essa camada proteica. E depois há alguns princípios de adsorção de proteínas.
Há um site de adsorção limitado e por isso, há muita concorrência que acontece entre as proteínas para classificar de se fazer representar na superfície e depois há forças motrizes isto pode ser várias coisas-pode ser a hidrofobicidade e tudo mais.
As próprias superfícies vão mudar; quer dizer se estou usando PLGA versus PEG versus deixar-nos dizer PLA versus PCL, todos estes têm hidrofobicidade diferente, hidrofilicidade, têm diferentes grupos de superfície, têm interação diferente com as proteínas.
Por isso, o tipo de proteínas que podem absorver nessas superfícies vai ser muito diferente e então novamente a atividade biológica da proteína adsorvida varia em superfícies diferentes como acabamos de discutir.
Assim, uma vez que a proteína adsorb, mais ela muda de conformação a menor será a sua atividade. Então, se uma proteína que tem uma estrutura como essa, é absorvida e se torna uma estrutura como essa, mudou bastante estrutura. Assim, sua atividade pode ficar gravemente danificada ou pode não ser mesmo ativa em todo o momento, se a mesma coisa se tornar assim o seu bastante similar. Então, você pode pensar em um cenário em que isso pode estar ainda 70-80% ativo do que quando estava em solução, então essas coisas também podem variar.
(Consulte O Tempo De Deslizamento: 12:11)

Então, novamente isso está apenas mostrando como uma nanopartícula realmente interagindo com a célula, a célula não é realmente vista a superfície de nanopartícula diretamente porque já é adsorvida proteína na superfície dentro de menos de milissegundos e sua realmente interagindo através da proteína adsorvida. Por isso, torna-se muito importante estudar adsorção de proteínas.
E então outra coisa interessante é, você pode conjugar uma partícula com vários ligands você pensa que eles podem ser usados para interagir com a superfície celular, mas olha o que aconteceu uma vez que você colocou na mídia existe toda uma camada de adsorção de proteína que entrou e esta específica direcionamento lige não é nem acessível para a célula. Pode ser acessível em alguns casos, depende da superfície e da própria lige, mas isso é algo a considerar enquanto você coloca esses ligands que eles podem não ser realmente interagir diretamente com a célula.

(Consulte O Tempo De Deslizamento: 13:08)

E vamos falar sobre como podemos estudar essa quantificação de proteína na superfície. Então, uma coisa é fazer um SDS PAGE. E, assim, é bastante simples o que você faz é colocar seu implante ou partícula e se incubar com deixe-nos dizer soro e assim, o que vai acontecer é, o que quaisquer proteínas diferentes estão lá virão e adsorb e soro é apenas um exemplo você pode colocá-lo em algum outro fluido, talvez se você for dar a ele pulmões para inovação, você vai colocá-lo em fluido ou lavagem pulmonar, se você for dar através de oralmente você pode talvez colocar com saliva.
Por isso, há todos os diferentes tipos de fluidos biológicos que podem ser usados-depende da aplicação. Então, uma vez que essas proteínas se revestiam desse implante, você pega esse implante que eu quero dizer novamente como eu disse que esta é uma questão de milissegundos de que estamos falando. Então, você pode deixá-los por alguns minutos e levar o implante que você centrífuga para remover qualquer coisa que seja externa e resuspendo ela nos deixe dizer em água e uma vez que você tenha feito isso, você pode usar um SDS PAGE.
Por isso, a SDS é novamente um detergente muito forte. Então, o que faz é essa denotada completamente a proteína e interage com a proteína em uma afinidade tão alta que ela desce desse implante tanto a corona dura como a corona macia. E aí você pode simplesmente rodar um gel PAGE que não é nada, mas como gel que separa a proteína para fora com base em seu tamanho ou peso molecular e nesse sentido então você pode estudar o que todas as proteínas estão lá através do western blotting.

Por isso, espero que todo mundo conheça o western blotting-tudo o que é para transferi-lo para uma membrana e então uma vez que sua transferência para uma membrana deixe-nos dizer agora esta é a própria membrana que você pode vir com anticorpos contra proteínas conhecidas. Então, digamos que se eu estou prevendo a fibronectina é uma das proteínas que está se envolvendo, eu vou entrar com o anticorpo de fibronectina e me incubarei com isso. Então, se a fibronectina é uma das proteínas que estava no implante, então esse corpo vazio vai se ligar à fibronectina e eu posso marcar esse anticorpo com algum fluoróforo inicialmente, então isso vai começar a fluorescência ou eu posso colocar alguma enzima e permitir alguma cor em torno desta banda.
Então, dessa forma eu posso saber que a fibronectina presente neste milieu ou em seu não presente neste milieu e similarmente você pode fazê-lo para várias outras proteínas. Por isso, novamente este caminho é bastante semi-quantitativo, seu não muito quantitativo. Outra boa maneira de fazer isso é usando algo bem uma ressonância plasmon de superfície que é novamente muito utilizada. Assim, seu altamente sensível e que depende do dielétrico da superfície. Então, o que você pode fazer é, você pode tirar a sua superfície que você quer testar. Então, isso é aqui; você pode então revestiá-lo com alguma camada de metal. Por isso, neste caso vamos dizer se temos revestidos de ouro.
Assim, uma vez que as proteínas adsorrem a ela, o dielétrico desta camada de proteína específica vai ser diferente da sua superfície inicial e porque o seu diferente você pode brilhar uma luz-sua ida para espalhar-se de forma diferente e você pode lê-la através de um detector e isso vai dar um efeito de plasmon de superfície porque o dielétrico é alterado e através disso você pode então quantificar executando alguns padrões de quantidades conhecidas, você pode então quantificar se a proteína é antes de tudo adsorvante e interagindo com a superfície.
E depois, em segundo lugar, se é então qual é a quantidade de proteína que vem na superfície porque este dielétrico estará diretamente relacionado com a quantidade da proteína que veio e adsorb na superfície. Então, essa é uma maneira que você pode estudar a adsorção proteica.

(Consulte O Tempo De Deslizamento: 17:23)

Por isso, o que faremos é, vamos tirar um exemplo da literatura-isso é apenas para classificar de dar uma ideia de como a pesquisa está acontecendo. Então, este é um papel que foi publicado bastante enquanto volta agora em 2010 e é sobre como a nanopartícula pode induzir desdobramentos de uma proteína chamada fibrinogênio e este desdobramento então resulta em sinalização através de um receptor chamado receptor Mac- 1 e que causa inflamação. Por isso, aqui está apenas um exemplo de como um material estrangeiro que é introduzido causa inflamação. Então, a sua mesa mais mecanicista.
(Consulte O Tempo De Deslizamento: 17:59)

Então, o que os autores fizeram neste papel é que eles levaram nanopartículas de ouro. Então, isso é nanopartícula de ouro, eles revestiam essas nanopartículas de ouro com polímeros-durante a síntese usa vários polímeros e um deles é o PAA que é o Poly Acrílico Acid.
Então, o que eles fizeram? Eles revestiam o ouro com ácido acrílico poly e então eles a incubaram com uma proteína chamada fibrinogênio-sua proteína muito disponível e é encontrada uma quantidade bastante abundante em nosso soro também. Por isso, e o que eles mostraram neste papel é bem essa adsorção acontece, ela ativa Mac-1 em células imunes ou na verdade em outras células de mamíferos.
E uma vez que ativa Mac-1-Mac- 1 vai para o núcleo que a sinalização vai para o núcleo e faz com que a regulação em alta da via NF-kB que é muito conhecida por ser um regulador de mestrado para inflamação e que cause a liberação de muitas citocinas inflamatórias e que possa causar algumas reações no corpo, você pode começar a ter febre-resposta muito semelhante a quando adoecemos.
(Consulte O Tempo De Deslizamento: 19:41)

Então, deixe-nos ir um pouco mais a fundo, então o que o fez é eles fazem três tamanhos diferentes de partículas. Então, 5,10 e 20 nanômetros de tamanho -este é o diâmetro e então o que eles fizeram foi, eles incubaram isso com soro e depois o mesmo processo que eu acabei de descrever com o SDS-PAGE. Então, isso é apenas um SDS-PAGE. Então, o que você pode ver aqui são vários tipos de proteínas ter chegado e adsorb nessas e o que você vê aqui é 5 nanômetro tem bastante proteína e então 20 nanômetro tem menos proteína para a mesma quantidade de

o ouro. E o que eles observaram principalmente foi que as cadeias de 65, 55 e 45 kDa de fibrinogênio eram muito abundantes.
Então, essencialmente quando eu falo sobre isso, eu estou olhando para 65 que é esse cara, o 55 que é esse cara e depois o 45 que é esse cara. Então, essas três bandas foram muito proeminentes cada vez que fizeram essa experiência. Então, então eles descobriram que isso na verdade não é nada, mas três correntes diferentes de fibrinogênio.
(Consulte O Tempo De Deslizamento: 20:48)

Então, é isso que eles estão descrevendo aqui. Por isso, fibrinogênio compreende de três cadeias de proteína a alfa, beta e gama e esta é a confirmação-molécula bastante grande 45 nanômetro e é um dimer. Então, o que eles são mais evidenciados é que este termino C que é bastante coberto em uma estrutura de proteína normal como você pode ver aqui tem um site de ligação para um receptor chamado Mac- 1 em uma célula.
Assim, o receptor Mac- 1 pode vir e ligar-se a este site embora o site não esteja tipicamente exposto. Assim, o Mac- 1 não se une a fibrinogênio por si mesmo, a não ser que a estrutura fibrinogênese seja um tanto danificada ou desnaturada, de modo que este site de Mac- 1 esteja exposto. E então o que isso mostrou é que a adição dessas nanopartículas de ouro coado PAA resultou na perda da estrutura secundária de proteína. Então, como você pode ver aqui, então o que eles mostraram é, este é um dichroísmo circular seu um seu método que mede as estruturas secundárias na proteína. Por isso, proteínas quando elas se dobam têm estruturas como alfa helix e folhas beta e outras também. Então, essas alfa helix e folhas beta têm um certo comprimento de onda através do qual dão sinais.
Portanto, se esta é uma estrutura de proteína normal que o C neste caso. Então, essa linha vermelha é uma proteína normal, então o que significa que se você está recebendo esta linha vermelha a proteína está nessa configuração particular; mas à medida que você adiciica mais e mais nanopartículas de ouro à sua solução o que você encontra é que a estrutura está realmente mudando e você pode ver esse sinal que você recebe da estrutura secundária está realmente diminuindo à medida que você vai para frente.
Então, essa deve ser a maior concentração. Por isso, neste ponto você está falando de 10 micrograma por ml de fibrinogênio e dê para este micrograma de 40 por ml de suas partículas de ouro.
E só para mostrar que o ouro em si não tem nenhuma estrutura secundária eles só vão rodar o ouro sozinho. Mas, assim, o que se pode ver é que há um pouco de mudança na estrutura ou perda na estrutura secundária, o que na verdade está provando o ponto que uma vez que essa proteína vai para as partículas, ela muda de estrutura.
(Consulte O Tempo De Deslizamento: 23:24)

Em seguida, eles mostraram que este fibrinogênio tem ligação seletiva para seus receptores de Mac- 1. Então, o que eles mostraram é que utilizaram células THP-1 que são um monócitos humanos; e este THP-1 tem um receptor Mac- 1. E então outro eles têm o uso HL-60 que não tem um receptor Mac- 1.

Então, o que isso aqui ver é se você acabou de colocar proteína, a quantidade de proteína que fica ligada à superfície celular é bastante baixa, mas uma vez que você coloca proteína mais nanopartícula de ouro você recebe bastante proteína que vai na célula e a razão para isso é agora porque o site do receptor Mac- 1 agora está acessível, o receptor Mac- 1 na superfície celular agora pode se ligar a

este.
Enquanto que, na linha de células negativas você não vê isso e se você incubar com albumina também não se vê isso, porque já a albumina revestiu a partícula. Então, a partícula não pode ligar-se ao fibrinogênio. Então, apenas descrevendo o que eu acabei de dizer que causa o desdobramento e é por isso que ele pode interagir com o receptor Mac.
(Consulte O Tempo De Deslizamento: 24:47)

E então esses caras foram mais adiante e mostram que os experimentos que faria com 20 nanômetro não mostraram nenhuma proteína ligada significativa. Então o que eles fizeram foi esta de novo a sua proteína ligada nessas células THP-1 e o que ver se você tem apenas fibrinogênio sua estrutura é preservada. Então, isso não causa nada. Se você tem 5 nanômetros apenas como a última figura ela causa bastante ligação da proteína. Se você usa 20 nanômetro, o que mostramos anteriormente, ele não se liga e muda a estrutura que muito, você vê novamente que há uma redução naquela proteína que está ficando adsorvida.

(Consulte O Tempo De Deslizamento: 25:27)

E então eles mostraram que você pode usar algum inibidor desse receptor específico de Mac- 1 e assim, se você colocar receptores que se ligam ao Mac-1, então sua proteína coada fibrinogênica na partícula não pode se ligar a isso e assim é o que eles mostraram aqui. Então, a proteína ligada está realmente diminuindo enquanto, se você usa outro peptídeo que não tem afinidade, ele não faz nada. Então, é mais uma confirmação de que este é receptor Mac-1 que está realmente interagindo com a sua proteína.
(Consulte O Tempo De Deslizamento: 26:02)

E então eles foram adiante e mostraram que a ligação do fibrinogênio ativa a sinalização do NF-kB. Então, se você pegar este último exemplo o que eles fizeram foi eles adicionaram todas as fibrinogen, nanopartículas de ouro PAA, bem como anticorpo que se liga ao domínio NF-kB P65 e assim, o que você pode ver é por causa disso você consegue um grande turno.

Então, se o NF-kB nos deixar dizer foi por um exemplo x kDa e vamos dizer em um gel normal o x kD virá aqui. Uma vez que se liga ao anticorpo agora o seu peso molecular é aumentado por x mais o peso molecular anticorpo, de modo que agora foi e deslocado para lá em cima. Então, mais uma confirmação de que realmente esse fibrinogênio ligado nanopartícula de ouro não só está ativando Mac-1, mas que estão causando mais sinalização na está realmente em causar uma expressão de NF-kB.
(Consulte O Tempo De Deslizamento: 27:09)

E então novamente como eu disse que o NF-kB é um regulador master. Então, vai secretar muitas citocinas.
Por isso, neste caso você está vendo IL-6, IL-8 e TNF alfa que são ambas citocinas inflamatórias. Então, o nível de expressão deles sobe quando você tem sinalização do NF-kB e que é novamente uma grande causa da inflamação que está acontecendo. Por isso, novamente as células THP-1 foram usadas aqui que mostravam que a secreção de IL-8 e TNF alfa.

(Consulte O Tempo De Deslizamento: 27:38)

E, assim, a característica de superfície realmente influencia a ligação de proteína? Então, o que eles fizeram foi, agora a mudança a superfície.
(Consulte O Tempo De Deslizamento: 27:45)

Então, neste caso o que eles fizeram foi quando fizeram essas partículas de ouro que mantiveram em diminuir a concentração do PAA, o PAA, como eu disse é o Polacrílico Acid, que é altamente negativamente carregado. Então, quando usar 100 por cento PAA você recebe uma partícula carregada bastante negativa o potencial zeta é uma maneira de medir a carga e à medida que você diminui essa quantidade de PAA a carga aumenta porque essa carga negativa está caindo e assim, o que eles mais mostram agora é que sua ligação de proteína está realmente diminuindo para as partículas de ouro à medida que você está mudando a carga.
Então, eles substituíram o PAA com esse PDHA e eles estão mais mostrando que cobrar é o que é responsável por ligar essa proteína a essas células e se você tem menor carga, então o seu fibrinogênio não é vinculativo para a sua partícula de ouro ou mesmo se sua ligação, não está expondo Mac-1. Então, isso como uma densidade de carga superficial é de ligação crítica ou fibrinogênio neste caso. Então, eu acho que é aí que vamos parar e vamos levar mais adiante na próxima aula.
Obrigado.