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Module 1: Adsorção de Proteína

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Proteínas Pré-Absoradas

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Vídeo:

Olá a todos, bem-vindos a outra palestra para Engenharia de Entrega de Drogas e Princípios. Basta uma rápida recapitulação do que aprendemos na última aula.
(Consulte O Tempo De Deslizamento: 00:37)

Então, estavam falando de adsorção de proteínas -por que estamos fazendo isso é porque queremos entender o que acontece quando você coloca qualquer material estranho no corpo ou em contato com qualquer tipo de fluido corporal. Digamos que se este é o meu corpo que estou a colocar, e a primeira coisa vai entrar em contacto com claro, o fluido e a grande parte do fluido no nosso corpo não é essencialmente nada, mas a água e depois o próximo componente principal são as proteínas.
Assim, todas aquelas proteínas que estão presentes em um fluido começarão a interagir com esta superfície em particular e então dependendo de como a superfície está-seja ela hidrofóbica ou hidrofilica essas proteínas tenderão então a fazer adsorb em diferentes áreas e uma conformação diferente sobre esta superfície e só então as células que estão novamente nas proximidades entrarão e começarão a interagir com a superfície através dessas proteínas adsorventes.

Então, as células realmente não vêem realmente a superfície muito bem. O que eles veem é na verdade a camada de proteína adsorvida através da qual eles vão começar a interagir.
Por isso, é por isso que se torna muito importante porque o que quer que a célula esteja vendo não é na verdade nada, mas a proteína absorvida. Então, precisamos estudar o que de fato essa proteína absorve é e como ela pode ser modulada para obter essa função desejada. E então falamos que no processo de entender o que a absorção de proteínas é primeiro é o que uma superfície? Então, o que define uma superfície? Como sabemos que se trata de uma superfície é uma interface entre o que quer que os dois médios tenham sido apresentados a ele. Conversamos sobre o que são surfactantes.
Então, novamente o que é surfactante? Os surfactantes não são nada, mas moléculas que possuem domínios hidrofóbicos e hidrofóbicos e que podem fazer fase separam os domínios hidrofóbicos e hidrofóbicos e, essencialmente, vamos dizer se eu digo que isto é petróleo, isto é água então estes surfactantes vão essencialmente alinhá-lo esta interface com o domínio hidrofóbico indo em direção à fase de petróleo e ao domínio hidrofilico indo em direção à fase da água.
E por isso novamente isso se torna importante porque o que estamos dizendo são proteínas são tensoativos leves porque contêm vários aminoácidos cerca de quase todas as proteínas com grandes estruturas terão cerca de 20 aminoácidos, todos os 20 aminoácidos. E então esses 20 aminoácidos alguns são hidrofóbicos, alguns são hidrofóbicos mesmo dentro da estrutura do aminoácido existem domínios hidrofóbicos e hidrofóbicos e por causa disso essas proteínas atuam como tensoativos suaves e sua estrutura vai mudar dependendo de qual são os médios que são. Assim, se eles encontrarem algum domínio hidrofóbico ou superfícies hidrofóbicas o que vai acontecer são os domínios hidrofóbicos começarão a sair e interagir com aquelas superfícies hidrofóbicas.
Então, é por isso que estudamos surfactantes. Depois, conversamos sobre dobragem de proteínas que é novamente uma coisa muito relacionada. Por isso, em processo natural vamos dizer se estamos a falar em células que não é nada, mas sim uma mídia aquosa. Digamos que esta é a proteína desdobrada. Então, a dobradagem de proteínas será de tal forma que todos esses domínios externos serão hidrofilados e a razão para isso é porque esses domínios externos terão que interagir com a água que está presente no entorno.
Então, eles gostam de interagir com a água. Então, é por isso que todos esses domínios hidrofilados virão para fora e então todo esse domínio interno será hidrofóbico e novamente a mesma razão pela qual esses domínios realmente não querem interagir com a água que está presente fora.
Então, eles querem enterrar a si mesmos e evitar que qualquer tipo de interação aconteça com a água do lado de fora. Então, é por isso que a dobragem de proteínas se torna importante porque agora o que estamos dizendo é quando essas proteínas em particular agora de repente começam a enxertar uma superfície hidrofóbica, esses domínios tenderão a sair e então esses domínios tenderão a ir embora e é por isso que a dobragem de proteína vai mudar.
Então, é por isso que estudamos dobramentos de proteínas. Apenas em termos muito muito breves quero dizer que a dobradura de proteína por si só é um fenômeno muito complexo em todo um curso pode ser projetado nele, mas o que falamos é apenas alguns conceitos gerais da maneira como essas proteínas vão se dobrar.
(Consulte O Tempo De Deslizamento: 05:06)

Por isso, ter feito tudo isso e ter estabelecido que essas superfícies podem modular a dobra de proteína e adsorção de proteínas, outro conceito que agora está sendo usado no campo bastante é a pré-adsorção dessas proteínas para superfícies e por que você precisaria fazer isso? Então, vamos dizer se eu tenho uma superfície e eu quero que esta superfície sinalize as células de uma determinada maneira. Então, eu quero dizer se eu tenho uma célula que vai interagir com ela e eu quero que esta superfície em particular interaja com a lige do celular, x.

Então, para que isso aconteça eu quero ter certeza de que qualquer que seja a proteína que seja revestida na superfície tenha alguma afinidade por essa lige x ou este receptor x. Então, este é um receptor e vamos dizer que estou colocando alguns ligandos na superfície.
Então, eu posso ou não colocar ligands, mas essencialmente eu quero que esta superfície interaja com as células através deste x. Então, uma das estratégias o uso para isso é para as proteínas pré-adsorb que sabemos que vai interagir com esse receptor x e essa é uma maneira que eu posso controlar a sinalização que vai acontecer através da superfície. Veja a razão para isso é porque uma vez que eu coloco no corpo ou uma vez que eu o coloco em contato com o fluido do corpo existem todos os tipos de proteínas no fluido do corpo, quero dizer que estamos falando de milhares e milhares delas e por isso a probabilidade de que digamos uma certa proteína virá e adsorb a ela é bastante baixa.
Por isso, para evitar que o que fazemos é primeiro tratá-lo com uma solução contendo apenas esta lige L e que garantirá que pelo menos algumas das ligas L permanecerão na superfície e possam interagir com a célula. Então, algumas das proteínas que são muito utilizadas para isso são fibronectina, fibrinogênio, vitronectina e estas não são nada, mas essas são proteínas que contém um sítio adesivo.
E por isso se eu intuo meu biomaterial com essas proteínas por algum tempo o que vai acontecer são essas proteínas vão, então, revestirem a superfície completamente e então eu posso colocar este implante com células ou no corpo. E essas proteínas ainda podem sair e iam falar sobre isso em próximos slides, mas aumenta a probabilidade de que uma dessas proteínas comece agora a interagir com esse receptor de células x e dê a sinalização de que eu quero essa superfície para dar.

(Consulte O Tempo De Deslizamento: 07:33)

Assim, enquanto que, o pré-adsoriamento com um adesivo não celular também pode ser usado. Por isso, digamos que se eu quiser colocar um implante que eu realmente não quero interagir com a célula. Digamos que eu tenho um implante que está carregando uma droga D e tudo o que eu quero fazer a partir desse implante é para ele liberar a droga constantemente e não ter qualquer tipo de proteínas desconhecidas chegando e absorvendo fazendo uma camada fazendo com que essa difusão da droga seja difícil a partir deste implante. Por isso, sabemos que as proteínas vão adsorver a ele não podemos evitá-lo. Então, por que não deixar apenas absorver algo que não interage com as células.
Então, vamos dizer se eu implantei diretamente o que vai acontecer? todo tipo de proteínas aleatórias virá e essencialmente adsorb na superfície e uma vez que eles fazem isso eu não tenho certeza de que o que vai dar aquele sinal para a célula se eles causam uma camada de célula maciça para se formar na superfície e então isso pode voltar a levar a cascata de eventos que podem interagir com outra célula e fazer uma grande camada grande.
Então, essa é a última coisa que eu quero se eu quiser que o medicamento D libe no sistema porque agora o que está acontecendo não é só a droga tem que se difundir a partir de uma matriz, mas agora ela tem que se difundir através dessa camada de proteína e através de múltiplas camadas celulares o que vai ser muito desafiador e é algo que eu não posso controlar direito. Porque eu inicialmente projetei isso deixe-nos dizer para soltar x miligrama por minuto ou algo assim, mas agora uma vez que esta espécie de camada de célula e proteína foi formada não sei se vai liberar x miligrama por minuto talvez vá descer a X por 2, talvez seja por x até 4.
Por isso, como um clínico eu estou muito preocupado agora porque não sei quanta dose estou dando. Por isso, para evitar que o que você pode fazer é essencialmente casaco com uma proteína conhecida que você sabe que não vai interagir com as células. Por isso, mesmo que você tenha uma camada proteica agora, o que você faz é evitar que as células entre e adsorve nele. Então, dessa forma, pelo menos eu sei que o que é a difusão dessa droga dessa matriz através dessa camada de proteína e dessa forma eu tenho alguma boa ideia quanto ao quanto a droga está sendo liberada por tempo unitário ou por dia ou o que quer que seja.

Então, este é um aplicativo que estou lhe dando que poderia haver várias outras aplicações-talvez o implante seja tal que não queremos que as células imunes interajam, talvez esteja carregando células dentro e não queremos que as células imunes entrem e ordenem a morte dessas células. Então, são vários aplicativos que você pode pensar nessa direção e, em seguida, várias outras estratégias além de proteínas pré-adsorventes e tudo isso nós vamos falar nas futuras aulas neste curso, mas esse é apenas um exemplo que eu estou dando.
Então, essas são coisas que você pode brincar com adsorção de proteína para si mesmo para obter algum resultado desejado. E então a próxima coisa é que muitas vezes você deve definir a sinalização material in-vivo também. Assim, você pode prevenir a adsorção de proteínas não específicas. Então, uma coisa é prevenir a célula e então outra coisa é prevenir qualquer tipo de proteína para adsorver sobre ela.
Por isso, digamos que se algumas enzimas absorvem para as minhas superfícies e elas começam a degradar essas superfícies ou começam a degradar a própria droga. Por isso, novamente você pode controlar isso por pré-adsorção sob proteínas e que pode tanto atrasar ou pelo menos revogar completamente qualquer um deste processo de acontecer.

(Consulte O Tempo De Deslizamento: 11:15)

Por isso, vamos falar sobre alguns cinéticos de adsorção de proteínas. Então, eu inicialmente disse na introdução dessa turma que a primeira coisa que o implante vai interagir é a água porque esse é o fluido mais abundante em volta e então o próximo vai ser as proteínas e as células vão interagir através dessa proteína. Então, por que é que e então a razão para isso é que a adsorção proteica é um fenômeno muito rápido. Por isso, a única coisa que limita a adsorção proteica é a difusão da proteína do fluido para a superfície do seu implante. Então, o que essencialmente isso significa, é se eu estou colocando um implante e estou olhando para o implante depois de alguns segundos ou poucos minutos que implante neste ponto, eu acredito, seria completamente revestido com suas proteínas que estão presentes nos meios de comunicação circundantes.
Por isso, digamos que esta é a sua mídia circundante, você tem proteínas. A única limitação da adsorção de proteínas é essencialmente a difusão desta proteína para atingir a superfície. Uma vez que chega à superfície estamos falando de menos de milissegundos para que essas proteínas adsortam sobre a superfície. E então o que vai acontecer é uma vez que as proteínas tenham chegado e adsoriadas, a camada inicial da proteína, então digamos que outra proteína esteja agora tentando vir-esta proteína não tem espaço para interagir diretamente com esta superfície em particular ela pode começar a interagir com as proteínas que são revestidas na superfície porque essas proteínas podem também ter alguns domínios que agora estão ficando expostos que não foi mais cedo presente, mas então esta proteína particular que está chegando atrasada ou a fase mais lenta terá de remover estas proteínas da superfície ou não será capaz de interagir diretamente a superfície e teremos que interagir com a camada já coada. Então, eles encontrarão o slot vazio talvez essas proteínas sejam grandes e haja uma pequena proteína que pode se difundir nesses slots vazios.
Então, aqueles poderão entrar, mas então eventualmente toda a superfície será coberta de forma bastante rápida e será muito difícil para qualquer outra proteína vir e interagir com ela.
(Consulte O Tempo De Deslizamento: 13:29)

Por isso, então existem vários modelos que estão sendo usados para classificar de estudo essa adsorção de proteínas. Então, um é um modelo monolayer que é um modelo bastante simples e o que ele é que ele assume com a adsorção proteica é limitado a um monolayer. Então, o que está dizendo é deixar-nos dizer é-se eu tenho uma superfície. Então, o que este modelo monolayer supõe é deixar-nos dizer se há proteínas nas proximidades estas proteínas vão adsorver sobre a superfície e se há outra proteína que precisa vir em deixe-nos dizer que tenho outra proteína que quer vir e adsorb na superfície, ela não pode vir e adsorver em cima da superfície.
Então, isso não é e a única coisa que pode acontecer é isso chegar nele, retira uma da unidade de proteína e depois vai e começa a interagir com aquele espaço vazio que está sendo criado. Então, esse é um modelo simples de monolayer e se você passar por isso o que está dizendo é você ter nos deixado dizer uma certa concentração de proteína sendo adsorvida. Por isso, à medida que você aumenta a concentração de proteína a quantidade de proteína adsorvida vai aumentar e nós vamos chegar e discutir sobre o motivo pelo qual isso vai aumentar e por que isso não será constante e apenas arcar comigo para um par de slides.
(Consulte O Tempo De Deslizamento: 14:58)

Depois, há um outro conceito que é de proteínas duras e suaves. Então, o que isso significa assim; isso significa, que algumas das proteínas poderiam ser bastante duras significando que elas não são muito flexíveis. Então, alguns desses exemplos são dados aqui ribonuclease, lysozyme e outras proteínas eles são considerados muito duros. Então, eles têm uma estabilidade interna muito alta o que significa que eles não vão realmente mudar a estrutura um lote inteiro eles ainda irão interagir com a sua superfície, mas a estrutura da proteína ainda permanecerá e ela realmente não vai mudar muito do que foi a estrutura inicial. E aí o outro é a proteína macia e que, como o nome sugere, não é nada, mas a sua estabilidade interna muito baixa o que significa que se encontrarem uma nova superfície a estrutura pode mudar bastante dependendo da contribuição da hidrofobicidade e hidrofilicidade da superfície.
Assim, alguns desses exemplos são IgG, beta-caseína, hemoglobina e vários outros exemplos na verdade a maioria das proteínas encontrarão são proteínas suaves e suas estruturas facilmente mudarão.

(Consulte O Tempo De Deslizamento: 16:01)

Então, a próxima coisa de que eu inicialmente estava falando era essa orientação proteica e o que essencialmente; isso significa, é isso alguns exemplos aqui. Assim, você pode ter uma proteína globular essencialmente significando uma espécie de uma grande proteína grande com uma estrutura esférica que vem e há alguma mudança na estrutura desta como você pode ver essas esferas agora se tornam mais como elipse e ela se casta em uma superfície o outro modelo poderia ser-dependendo da concentração que você usou, digamos que a proteína de forma elipse vem em você pode ter uma configuração onde muito pouca quantidade de proteína como adsorcama, mas ainda cobre a superfície comparada a uma orientação onde muita proteína adsoria e sobre a superfície. Então, o que você tipicamente encontra na literatura é e durante os experimentos é que isso se mantém variando dependendo da concentração que você está usando.
Por isso, digamos se eu tenho uma superfície e venho com um micrograma por ml de concentração de uma proteína e por isso o que vai acontecer é já que estou falando de concentrações muito baixas de proteína na solução é uma espécie de limitação de difusão quanto à quanta proteína pode entrar e adsorver na superfície. O que você vai encontrar é deixar-nos dizer que eu tenho uma proteína que tem essa estrutura de 8. Então, vai vir que vai meio que começar a interagir com ele e o que vai acontecer ao longo do tempo é que vai começar a se expandir sobre ele porque pode encontrar mais espaço. Então, essa estrutura de 8 fica alongada e alongada.
Daí a estrutura ter mudado bastante mais um pouco mais uma única proteína é ocupado um espaço bastante grande. Agora considere um caso com o mesmo exemplo em que nos deixe em vez de 1 micrograma por ml eu venho com 100 micrograma por ml, agora sobre esta superfície em particular. Então, agora, o que vai acontecer agora eu tenho muito mais concentração de proteína no entorno. Então, a fusão não será tão limitada. Assim, as proteínas virão de forma bastante rápida.
Então, vamos dizer que uma proteína fica adsorvida. Ele é capaz de mudar um pouco a superfície porque ainda tem mais algum espaço para o qual ele pode absorver, mas no momento em que vai para essa configuração todo o resto dos locais estão ocupados porque é uma concentração bastante elevada de proteína que está presente nas proximidades. Então, todos eles estão chegando e essencialmente ocupando a superfície. Não pode realmente expandir-se fazer algo como esse estado que não está acontecendo e a mesma coisa vai acontecer se eu for numa concentração ainda mais alta.
Por isso, o que você vai encontrar não é apenas a adsorção proteica é dependente do tipo de proteínas que estão presentes no entorno, ela também é dependente da concentração, pois a concentração pode mudar a orientação da orientação da proteína assim como a estrutura da proteína. Então, se você olhar para esta estrutura isso é diferente da estrutura que está aqui, mesmo que você use a mesma proteína para começar, mas em concentrações diferentes. E então agora se eu voltar para dois slides mais cedo o que eu estava dizendo. Então, digamos que se eu agora tiver uma proteína em uma concentração de 0,5 mg por ml.
Então, a quantidade de proteína que vai absorver vai ser diferente do que nos deixar dizer a 2 mg por ml ou 3 mg por ml e a razão para isso são as proteínas que estão vindo para adsorb na superfície têm tempo para mudar sua orientação e ainda ocupar mais espaço.
Assim, você terá um cenário em que o que você obterá é essencialmente em concentrações mais baixas você tem um pouco de proteína em uma superfície enquanto que, em uma concentração maior você pode ter um pouco de proteína que está ficando adsorvida porque há proteína suficiente nas proximidades e não há tempo suficiente para a proteína mudar é orientação.
Então, é por isso que você vê uma curva como esta mesmo sendo a mesma proteína, fibrinogênio, que foi dada à superfície, mas dependendo da concentração inicial você consegue esse tipo de aumento e então uma vez que você chega a uma concentração de saturação em que a difusão não é mais uma limitação há moléculas suficientes nas vizinhanças que vão saturar completamente a superfície, então não importa. Então, neste caso específico isso se mostra mais em torno de 2 mg por ml indo para ele diferente para cada proteína com a qual você está manipulando, mas todas as proteínas tipicamente mostrarão uma estrutura como esta e esta claro, é uma suposição com um modelo monolayer e falaremos sobre outros modelos também neste caso.
(Consulte O Tempo De Deslizamento: 21:04)

E aí, e o efeito da wetbilidade? Então, as tendências gerais se você assume este modelo sobre adsorção proteica é que as proteínas vão adsorver bastante apertada e fortemente às superfícies hidrofóbicas e isso é muito óbvio. Porque vamos dizer se eu tenho uma superfície que é bastante hidrofóbica então as proteínas podem mudar bastante a estrutura sobre isso.

Digamos que esta é uma proteína que veio e começou a interagir e há muitas interações de van-der waals que vai acontecer entre a proteína e a superfície e não há realmente nenhuma força concorrente para esta superfície hidrofóbica porque em todos os lugares do entorno o fluido contém água e isso é hidrofilico.
Então, esses domínios hidrofóbicos serão muito felizes interagindo com essa superfície hidrofóbica e eles realmente não querem mudar o que quer que seja a estrutura porque o entorno é hidrofilo. Por isso, tipicamente o que se vê é aquela interação muito apertada e forte de proteínas com superfícies hidrofóbicas. A conformação e a extensão da desnaturação também dependerão da wetbilidade da água novamente antes de tudo isso vai depender se a proteína é macia ou dura.
Assim, as proteínas tipicamente duras não mudarão a estrutura, as proteínas suaves mudarão a estrutura, mas bastante e então quanto mais hidrofóbica for a superfície mais a mudança na estrutura e depois novamente a razão para isso é muito semelhante porque mais cedo as proteínas estavam situadas na água e todas elas são domínios hidrofóbicos estavam fora enquanto que, para interagir com a superfície hidrofóbica sua estrutura quase tem que ir para uma revisão completa onde todos os domínios hidrofóbicos internos vão sair e começar a se extrair interagindo com a superfície.
Assim, você verá aquele bastante um pouco de mudança que vai acontecer nessa estrutura. E, então, novamente como eu disse que é muito energeticamente favorável para que eles descoloquem água do ponto de vista da superfície como bem direita a superfície também não quer realmente interagir com a água. Por isso, a superfície também fica muito feliz quando entra em contato com esses domínios hidrofóbicos. Então, vamos parar aqui mesmo nesta palestra e vamos continuar mais na próxima aula.