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    Gel Horizontal Eletroforese Olá todo mundo este é Doutor. Vishal Trivedi do departamento de biosciências e bioengenharia IIT Guwahati. E com na eletroforese estávamos discutindo sobre o princípio básico da eletroforese seguida por nós também discutimos sobre a eletroforese de gel vertical e como executar a eletroforese de gel vertical. Então na palestra de hoje ’ s estamosindo começar a discutir sobre a eletroforese de gel horizontal.(Consulte o Tempo do slide 01:31)
    Então na eletroforese de gel horizontal a eletroforese neste sistema de gel é realizada em uma paixão contínua decom os dois eletrodos e cassete de gel são submersos dentro do buffer. O que se quer dizer com a eletroforese contínua é que a corrente não está fluindo através do gel. O que significa que ele é realmente contínuo por exemplo quando você está executando a eletroforese de gel vertical ou se você se recorda você tem as 2 câmaras.
    Uma é a câmara superior onde você está mantendo o tampão ok e que é o eletrodo negativo. E aí você tem a câmara baixa onde tem novamente os buffers ok e então você tem os eletrodos de carga positiva ok. E em entre essas 2 câmaras você tem o gel realmente que está sendo sandwiched dentro das placas de vidro. Então aqui você tem o gel de poliacrilamida e porque e por isso a corrente não pode ir diretamente do negativo para o eletrodo positivo.Considerando que a corrente tem que passar com este gel e então o gel está realmente conectando as 2câmaras de eletrodos. Comparado a isso no gel horizontal você tem uma câmara onde você temos eletrodos negativos e então você tem o eletrodo positivo e então um slab de gel está sendosubmerso com no buffer. Assim, o tampão está na parte superior do gel, o tampão fica na parte inferior deo gel e é por isso que a corrente pode mover-se livremente por todo este sistema.Assim, a corrente pode fluir por toda esta solução de buffer e a solução tampão também écontínua. Considerando que neste caso as câmaras tampão tampão 2 estão conectadas através do gel.(Consulte o Tempo de Deslizamento 03:32)
    Assim, a câmara de eletroforese possui 2 eletrodos de platina colocados em ambas as extremadas e sãoconectados à fonte de alimentação externa a partir de um pacote de alimentação que fornece uma corrente direta ou a tensão DC de. Então você tem uma câmara de eletroforese onde você tem um eletrodo negativo e o eletrodo positivode ambos ao lado. E então esses eletrodos estão conectados com o power cod ao pacote de energia.
    E este pacote de energia pode fornecer a tensão DC do qualquer montante. O tanque é preenchido com o buffer de execuçãoe o gel cascado fica submerso dentro do buffer. Há necessáries adicionaisnecessários para o casting do gel de agarose, como o pente. O Comb é obrigado a preparar os poços diferidosentão exigimos o espaçador, então exigimos o gel caster. Então, como executar o gel de agaroseeletroforese?(Consulte o Slide Time 04:30)
    Então, antes de discutir sobre como executar a eletroforese de gel de agarose, deixe entender o reagenteassim como o instrumento o que você é necessário. Por isso, para o tampão o objetivo de cada reagenteusado na eletroforese de gel horizontal é o seguinte. Então você exige agarose, portanto, agarose é umaçúcar polimérico que é usado para preparar o gel horizontal para a análise do DNA.Então você exigiu o brometo de eidium, portanto, o brometo de etídio é um corante que ele realmente vaiusar para estamem o DNA. Por isso, veja o assim brometo de etídio é necessário para a coloração do gel de agarosepara visualizar o DNA. Depois você requer a sacarose, a sacarose é necessária para a preparação deo corante de carga para o gel horizontal. Se você lembrar que estávamos usando o glicerol no caso dea página SDS.Então você tem uma escolha ou usa o glicerol ou para a sacarose o objetivo é que você querfornecer uma solução de alta densidade. Para que o, qualquer que seja que você carregue no gel permanecerá dentro deo gel. Então você requer que o tris HCL, o tris HCL é o componente do buffer de execução eentão você vai exigir o azul de bromofenol, o bromophenol blue é um corante de rastreamento para monitorar o
    progresso da eletroforese. Agora uma vez que você prepara o buffer e os reagentes então você poderealmente executar a eletroforese de agarose do gel horizontal. ((Consulte o Tempo de Slide 06:04)
    Para realizar a eletroforese de gel de agarose o primeiro você tem que lançar o gel compare com o gel de acrilamidaonde você realmente vai adicionar o linker cruzado e então você vai adicionaro temed e APS para induzir as reações de polimerização. Aqui você na verdade não vai fazerque para o casting do gel. O que você vai fazer é? Você só vai levar a agarose. Entãoagarose é o açúcar.Então, quando você ferve isso e ele é polímero na verdade quando você ferve esse açúcar ele realmente vai paraformar uma solução de geleia. Assim como você pode ter visto quando você cozinha o arroz em sua casae se ferver o arroz na verdade lhe dá alguma quantidade de amido. Por isso, é agarose também é semelhantetipo de carboidratos para onde você se ferve o gel ele realmente forma uma geleia como solução. Eentão se você despeje como geléia como solução em uma bandeja ele realmente contém o pente quando a geleiacomo solução esfriar então você vai ter uma eslab de gel.Então para o casting do gel diferente passo para lançar o gel de agarose para gel horizontaleletroforese são dadas na figura. O pó de agarose é dissolver em um tampão o testeTAE ou tampão TBE. E então você esquentou para derreter a agarose. A agarose quente é derramada no cassete de gele permitiu que ela se fixe. Um pente pode ser inserido na agarose quente para fundar bem o gel paracarregar as amostras.
    Em poucos casos podemos adicionar o brometo de eidium dentro do gel para que ele manche o DNA enquanto a eletroforeseestá acontecendo. Então o que você vai fazer é levar a quantidade necessáriado agarose em um copo e depois ferver isso você pode usar o queimador ou pode usaro micro-ondas. E então uma vez que ele se dissolve então nessa etapa você pode realmente ter uma flexibilidadede adicionar o EtBr.E então você despeje-o no cassete de gel e antes que ele fique solidificado você também pode colocar o pentepara que ele realmente vá te dar os poços. E uma vez que os poços são preparados você pode carregaras amostras em até aquele poços em particular e você pode dissolver o DNA do gel para visualizar.(Consulte o Tempo de Deslizamento 08:28)
    Agora o cassete de gel é colocado no tanque de eletroforese sub submerso completamente e o DNAsão carregados no poço com a ajuda de um pipeteiro e são executados com uma voltagem constante. Entãouma vez que o gel é preparado então você pode simplesmente tirar o gel do cassete do gel coloque-o noseu tampão de corrente colocando na câmara de eletroforese e então você se conecta.Então você carrega seu DNA e conecta-o à energia DC com a ajuda do banco de energia vocêpode fornecer a voltagem constante e então você pode dissolver o DNA na agarose. E o DNAfoge do negativo para o final positivo e o brometo de etídio realmente corre presentena mancha de gel no DNA. Observar o gel de agarose na câmara de UV mostra que, o DNAmanchou-se com o EtBr como a fluorescência de cor laranja.
    Então o que acontece neste caso é que quando você tem um eletrodos de carga negativamente e depois você umeletrodos de carga positiva e então você tem um lugar onde você pode realmente carregar o DNA. Entãoo que vai acontecer é o DNA porque o DNA é cobrado negativamente ele realmente corre nessa direçãoporque ele corre em direção ao tamanho positivamente. Considerando que o EtBr é uma carga positivadye so que o EtBr é realmente corre nesse sentido.Então enquanto eles estão correndo em direções opostas o EtBr está manchando o DNA e o EtBr está manchando o DNAdentro do grupo principal e menor o que significa que o EtBr realmente se intercalam dentro do DNA. Então você sabe que o DNA tem 2 de estrado e se essas 2 vertentes estão realmente tendo a basenas laterais. Então dentro da base o EtBr está ficando intercalado e como resultado ele realmente dáa fluorescência laranja quando você visualiza eles sob o UV.E o que você vê é quando você mantém o gel de agarose na câmara UV que você vaiver a cor laranja brilhante DNA brilhando dentro da agarose. Portanto, não há nenhuma etapa de coloraçãonecessária porque o EtBr só dá a fluorescência quando ela interage com o quando interagecom o DNA e intercalado para dentro da base. É por isso que não há nenhuma etapa de coloração énecessária porque o EtBr que não está interagindo com o DNA não dá a fluorescênciaE o que você pode ver é por exemplo nesta imagem representativa específica o que eu sou o que nósestamos mostrando é que os estes são o DNA plasmídeo que tem sido resolvido com o gel de agarosee eles estão mostrando a mancha intensa. O que se vê é esse sinal de embasamento do gel éna verdade o RNA. Por isso, o RNA nunca está sendo resolvido e nunca te dá a banda compactapor causa disso o RNA vai te dar as aparências de hissi.Então com isso nós lhe demos as informações teóricas completas como executar a agaroseeletroforese gel e como executar a eletroforese de gel. Mas as informações teóricas não sãoo suficiente é por isso que eu gostaria de levá-lo ao laboratório onde preparamos um pequeno clipe dedemo onde mostramos como ferver as amostras qual é a precaução que você develevar quando estiver fervendo a solução de agarose e depois como despejar e depois como prepararo gel?
    Como preparar os poços? Como carregar o DNA? Qual a precaução que você deve tomar enquantovocê está carregando o DNA em para a câmara em até os poços? E em última análise; como visualizaresses gel nas câmaras UV? Qual é a precaução que você deve tomar ao visualizar o DNAnas câmaras UV porque como você sabe que o EtBr UV e todos estes são perigosospara perigosos para o ser humano. EtBr é a é uma molécula cancerígena.Então, ela realmente causa o câncer. Por isso, é por isso que você tem que sempre usar as luvas quando estiverrealizando a eletroforese de gel de agarose. Por isso, neste demo os alunos mostraram a você comoexecutar o gel eletro para a eletroforese de gel horizontal, a eletroforese em gel de agarose.(Início Vídeo: 13:05)(Consulte O Slide Time 13:05)
    Hoje nós vamos dar a você a demo da eletroforese de gel de agarose que usamos paradissolver o DNA. Por isso em um gel típico de agarose eletroforese separadores o que você precisa é vocêter horizontal você tem a câmara tampão onde você pode ter os 2 eletrodos. Você pode tero ânodo que é o eletrodo de cor preta e então você pode ter o cátodo.Este cátodo e anode irá e casa na câmara tampão. Conectando esses cordões aos cordões de energiavocê tem os 2 cordos diferentes um é o fio vermelho e um é o cords preto. Ealém destes você também precisa de um caster de gel onde você pode ser capaz de lançar o gel. Portanto, esta é abandeja de gel pequena que você pode usar para causar as gelas de agarose. E além disso você também tem o penteque realmente pode ser usado para preparar o poço.
    E além deste reagente o que você precisa para realizar a eletroforese de gel de agarose você precisa do pó de agaroseque você pode comprar do sigma ou de qualquer outra empresa de altíssima qualidade.Então você requer o EtBr que é o corante colorretal e como você pode ver que o EtBr está sendomantido em um frasco que é coberto com o foil porque o EtBr é sensível à luz. E assim deve serprotegido da luz.E além disso você também requer o buffer de execução que é o STA 50 e assim vamos começaro casting do gel de agarose e realizar a eletroforese de gel. Antes de iniciar a preparação dodo gel de agarose o que você tem que fazer é ter que configurar a bandeja para poder colocar a bandeja para poderdespejar o agarose em até aquele gel específico em determinada bandeja e então você poderia escalar.O que você tem que fazer é ter que limpar cuidadosamente as bandejas ecom a água assim como, para que fique livre de qualquer tipo de contaminações e qualquer tipo deporque você sabe que o DNA é muito sensível para o DNA ’ s para o outro tipo de enzimas.Então o que você tem que fazer é ter que manter esta bandeja desta forma em caster deste gel e com a ajuda desses parafusos você tem que sacudir a bandeja de gel.E você tem que apertá-la e como você pode ver que eu estou apertando-a com um tanto os parafusossimultaneamente para que ele seja completamente selado. E então agora uma vez que esta bandeja foi selada evocê está pronto para despejar o agarose o que você tem que fazer é você ter que primeiro colocar o pente. Equando você coloca o pente o que você tem que fazer é ter que garantir que há uma lacuna suficienteentre o pente assim como a extremidade inferior do pente assim como a bandeja que o espaço o agarosevai preencher e é assim que ele vai te ajudar a preparar o poço.Então, para o gel típico agarose gel eletroforese o que você tem que fazer é ter que primeiro prepararo tampão 1X TAE para um tipo típico de câmara pequena. Você exigia em algum lugar por volta de 300400 ml de tampão e para o gel também você necessita de pelo menos 30 40 ml. Mas, por isso, para um lado mais seguro o que nóspodemos fazer é só podemos preparar o gel de agarose de 50 ml e para um DNA de cerca de 1 KB a cerca de 1KB você pode realmente rodar gel de 0,8% porque como o tamanho do DNA baixará você tem que manteraumentando o tamanho da porcentagem de agarose.
    Então, por exemplo, se você é instruído a explorar o que sabe compõe ou segmentação direta emaqueles casos a banda de gel ou a banda de DNA o que você está esperando é de 200 de peso base paramaior peso molecular. Por isso, nesses casos, normalmente corremos a agarose de 2%. Mas no maisdos casos o que fazemos é rodar cerca de 0,8% gel de agarose e isso é bom o suficiente para resolvera maioria dos tamanhos de DNA.Então, para preparar um 50 ml 0,8% agarose o que você precisa é ter que apenas usar as 0,4 gramas dea agarose e então você tem que ferver no micro-ondas e então você pode se preparar. Por isso, vamosentender como fazer isso. Agora o que fizemos temos peso a quantidade necessária deagarose e depois preparamos o tampão 1X TI e alguns tampão que temos derramado ema própria câmara e o para preparar o gel de agarose o que fizemos foi tomarmosquase 70 ml do tampão porque quando você ferver haverá sempre uma perda de alguns buffers.Então o que calculamos? Calculamos de 50 ml e agora estamos mantendo de 10 15 mlde mais água porque quando você ferve isso você vai armazená-lo a água vai amontoá-lae é por isso que você vai soltar um pouco de água. Por isso, uma vez que você vai despejar oagarose no tampão e então você vai fazer a ebulição. Então o que você pode fazer é você podeusar um micro-ondas e você apenas ligar o micro-ondas e o que você tem para garantir no micro-ondasestá realmente fervendo a agarose e derretendo-a.Então neste processo o que vai acontecer é que a água vai se aquecer e a agarose éindo derreter. E uma vez que a agarose vai derreter ela vai realmente incorrer e ela vai parapegar a água. E nesse processo vai-se realmente fazer um material viscoso ou oviscoso geleia como material e é isso que está no gel de agarose. Por isso, mas antes porque o éir ferver é na verdade também pode sair da do copo. Então você tem que manterabrindo e manter a verificação de que é algo que não está acontecendo.E no meio entre você tem que sempre misturar porque o agarose é o feito de açúcar. Por isso, tambémpode ficar carbonizado se conseguir aquecimento localizado. E uma vez que seu agarose vai aquecer então vocêpode ser capaz de usar isso e você tem que garantir que ferva-o muito cudamente. De modo que todos osgrânulos o que está presente no você sabe que a agarose deve ser derretido. Vamos verificar seaqueles agarose foram derretidos ou não.
    Para verificar o que fazemos é temos diferentes tipos das luvas que as luvas como são feitasem cima da borracha e estas são as luvas o que você pode usar para tocar as soluções quentes porque onossas luvas normais o que eu estou usando agora não é bom o suficiente. Por isso, temos que esquentar poucomais porque ainda assim consigo ver alguns grânulos de agarose. Então uma vez que essa etapa acaba então você tempara apenas tirar a agarose o que você tem para ver que é a água está fervendo agora ok evapor estão saindo.Então esta é realmente áspera estimativa de que você vai se soltar em algum lugar por volta de 10 15 ml de águaem processo de ebulição. Agora o que você tem que fazer é ter que simplesmente deixar esfriar paraalgum dia e então você tem que adicionar o corante. Por isso, neste caso estamos adicionando o EtBr assim uma vez que ficaesfriar você pode apenas adicionar o microlitro de 3 do EtBr e lembrar do EtBr é um corante de agente de elenco.Então você tem que muito cuidado você sempre tem que usar as luvas e você tem que descartar essas dicasmuito minuciosamente ou muito porque você não quer contaminar o ambiente. Por isso, essa dica comobem como toda a fosforia tem que ser descartada de uma maneira para que não seja para fora. Assim você adiciica oEtBr e então você mantém essa dica em um espaço garantido para que você consiga jogar isso em uma sacolabag que é feito para coletar o material de carpenagem.Agora sua solução está pronta e eu posso despejar isso na sua bandeja. Então você pode simplesmente despejar isso ema bandeja e nós temos que emagrece para algum momento para que ele fique solidificado e então você pode carregaro DNA e nós podemos executar a agarose. Agora você pode ver que o gel de agarose está sendo solidificadoe você pode ver que ele é claro. Portanto, não há grânulos ou o granulado ou o material precipitadopresente. E agora o que temos que fazer é ter que remover esse formulário e temos que manter em atéa câmara e depois nós vamos estar prontos para usar.Então antes de você fazer isso você tem que adicionar alguma quantidade de buffer nessa bandeja. Então o que você tem quefazer é você ter que adicionar alguma quantidade de buffer ok. E aí você tem que muito cuidadosamente semfazer qualquer movimento na direção longitutional você tem que verticalmente uplift o pente ema câmara superior como esta ok. E isso na verdade vai preparar o poço. Então o que você pode veragora são os poços neste bloco de agarose em particular ok.
    E uma vez que você tem certeza de que não há vazamento e há todos esses poços são bons o suficiente e entãoo que você pode fazer é? Você pode deslixar esta bandeja ou o cassete e nós vamos remover o pente. Então o que nós vamos fazer é? Nós vamos remover isso nesta câmara e então nósvamos remover o pente cuidadosamente você remove o pente ok. E aí você vai paraencher a câmara com o tampão.Então, quando você preenchê-lo com um tampão integral o gel vai ficar submerso e é por isso que estetipo específico de eletroforese de gel é chamado como eletroforese de gel contínuo. Agora o quevocê pode ver é que podemos ver os poços no gel. Por isso, se você ver o gel você pode ver o poçona verdade e agora vamos carregar a amostra para aqueles bem e aí vamos paraconectar a câmara à fonte de alimentação do eletroforese.E aí vai executar a eletroforese. Para preparar a amostra de DNA o que temosfeito é temos que adicionar na verdade tinta de carregamento 10X. Então, assim, basta você pegar o DNAvocê adicionar essa pequena quantidade do buffer e então você adicionar o buffer de carregamento de tal forma para queele vá ser 1X e então você vai carregar a amostra. Por isso, neste caso estamos carregando o 25micro litro da amostra.Então você vai levar a amostra para a pipeta ok certificar-se de que não há bolha de ar. Eentão você vai visualizar o gel e o que você pode ver na verdade ou em algum momento se há um problemaem olhar para um poços ou há um problema de visibilidade dos poços porque algum tempoa câmara baixa ou o plano de fundo inferior também vai ser transparente. Nesse caso você podebasta colocar um papel preto nisso naquele lugar onde você tem os poços.E isso realmente vai permitir que você veja o poço corretamente. Então deixe ver como carregar isso tãovocê segura sua pipeta ok e aí você traz a sua dica ao lado do poço ok e aí você carrega a amostra. E o que se verá é que o DNA está sendo construído para o poço. Então agora veja aquicomo eu estou carregando a amostra ok. Então eu tomei o microlitro de 20 e primeiro farei é levarminha dica para dentro do poço e depois vou carregar o que você vai ver é quando eu estiver carregando eu vou muitodevagar eu estou mantendo minha dica para fora ok.Então que o todo bem vai preencher com essa dica mas o que você tem que lembrar é que enquantosua dica é ou enquanto sua dica está dentro do poço você não deve deixar seu êmbolo. Para que ele deve
    não criar nenhuma bolha de ar porque ela que acontece o DNA vai sair ok. Por enquanto o que nósfaremos é vamos conectar isso ao cordão para que o preto vá com o preto e vermelho irá como vermelho. Por isso, antes de fazer isso temos que colocar a tampa para que não haja evaporação do buffer.Então você só conecta o preto ao preto e vermelho ao vermelho e agora temos que ligar o banco de energia.Então em um banco de energia você tem um switch aqui que realmente permite a virada. Conectada a câmaraou a câmara de eletroforese com uma unidade de fonte de alimentação estamos configurá-la em 80 volt e agoraela está em execução. E o que você verá é uma vez que a tintura de DNA (()) (26:39) chegará até o final do gel. Depois, na verdade vamos retirar o gel do aparelho.E então, já que só adicionamos o EtBr no gel. O EtBr vai correr do lado negativo dopara lado positivo. Considerando que o DNA vai correr da direção do lado positivoporque o DNA é carregado negativamente e o EtBr é o carregado positivamente. Assim, eles irãocorrer em um lado oposto enquanto estiverem executando o EtBr vai se intercalando dentro da base deo DNA. E é assim que realmente vai ficar no gel no DNA no presente no gel.Então, depois disso o que você tem que fazer é ter que tirar essa bandeja e colocá-la na máquina de gel doce que na verdade vai visualizar. Então feche a coisa ácido nucléico de aplicaçãoExposição de brometo de etídio, exposição ideal ou podemos selecionar manual também então vamos adquiriras imagens. Agora você pode encontrar aqui esta é a escada de DNA este é o produto amplificado PCR.(Video Ends: 28:29)Então na demo que eu expliquei todos os aspectos relacionados à eletroforese em gel de agarosecomo executar a eletroforese de gel? E com isso eu gostaria de concluir nossa palestra aquie em uma palestra subsequente também vamos discutir diferentes variantes da eletroforeseeletroforese de gel e como você pode ser capaz de utilizá-las para explorar a resposta ou pararesolvendo as questões experimentais obrigado.