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Reagentes em Gel Eletroforese Hello todo mundo, este é o Dr. Vishal Trivedi do departamento de biociências e bioengenharia IIT Guwahati. E comecemos o nosso novo tópico e o novo tópico é a eletroforese. Por isso, a eletroforese é uma técnica que tem sido utilizada para analisar as biomoléculas como a proteína ou o DNA. E para separá-los com base na carga ou no peso molecular ou em todas as outras propriedades bioquímicas. Então, vamos começar a discutir sobre a eletroforese. (Consulte O Tempo De Deslizamento: 01:33) Então, como o nome sugere, a eletroforese significa o estudo de ou a separação da molécula quando eles estão correndo para o campo elétrico. Então, você pode imaginar que você tem uma biomolécula que é ou você tem uma molécula carregada contendo carga Q e ela está se escorrendo em um campo elétrico. Por isso, a eletroforese é um processo cinético eletrótico que separa a partícula de carga em um fluido utilizando o campo da carga elétrica. É mais frequentemente usado em ciências da vida para separar as moléculas de proteínas ou a molécula de DNA e pode ser alcanada através dos vários processos diferentes, procedimentos dependendo do tipo e do tamanho das moléculas. Por isso, antes de entrar no detalhe da eletroforese e de como realizar a eletroforese, vamos discutir primeiro qual é o princípio básico da eletroforese. Assim, que você será capaz de entender cada um e cada fator que está influenciando o movimento eletroforético de ou o movimento da molécula dentro do campo elétrico. Então, que você será capaz de utilizar esses fatores para trazer a melhor separação. (Consulte O Slide Time: 02:49) Então, você pode imaginar que uma partícula carregada Q está se movendo em um campo elétrico E e quando uma partícula carregada está se movendo em campo elétrico ela realmente vai experimentar uma força eletroforética que vai estar na direção do campo elétrico. E a quantidade que vai ser a F é igual a Q E que é onde o E é a força do campo elétrico e q é a carga dessa partícula em particular. Mas quando uma molécula está se movendo em um campo elétrico, e se o material através do qual essa molécula se move vai realmente vivenciar as forças friccionais. As forças friccionais vão se opor ao movimento dessa molécula para o campo elétrico. E as forças friccionais passam a ser equivalentes ao f v onde o f é a constante friccional. Por isso, f é o coeficiente friccional e o v é a velocidade da mobilidade eletroforética. Este movimento de um objeto esférico através de uma mídia líquida da viscosidade n, o atrito do coeficiente f é dado pela fórmula 6 pi eta rv. O que significa se uma molécula está se movendo através de uma mídia líquida que é supor o gel. Em seguida, a viscosidade e o atrito vão acontecer. E como resultado as forças friccionais vão ser equivalentes aos 6 pi eta r e v. E agora, imaginemos que esta molécula vai parar de fazer o qualquer tipo de movimento. Assim, o local onde se dá o movimento de uma molécula esférica da viscosidade e do coeficiente de atrito f é dado pela 6 pi eta rv. E o local onde partícula terá tanto as forças equivalentes ou ambas as forças destas forças são equivalentes. Esse é o lugar onde a molécula vai parar o movimento. E que coloque o QE o que significa que as forças eletroforéticas assim como as forças friccionais vão ser equivalentes. Por isso, neste local a mobilidade eletroforética será dada pela fórmula v é equivalente a Q por 6 pi eta r. Considerando que, o Q é equivalente ao ze que significa se a molécula é composta das biomoléculas, você pode calcular a carga simplesmente por ter a valência onde o z é a valência e o E é a carga eletrônica. Então, se você multiplicar os dois a coisa que você vai receber a cobrança, então a mobilidade eletroforética pode ser expressa como o ze pelo 6 pi eta rv. Então, o que se vê é o ze pelo 6 pi eta r. E o que se vê aqui é que este componente é, na verdade, uma constante que significa, não vai ser dependente da molécula o que significa que o v é diretamente proporcional ao z pelo r. (Consulte O Tempo De Deslizamento: 06:28) Então, daí a mobilidade eletroforética é diretamente proporcional à carga que é esta, e a inversamente proporcional à viscosidade da mídia, tamanho e forma da molécula. No caso da mobilidade relativa, ela está diretamente relacionada com a carga por um raio da molécula. É o que nos é dito certo v é equivalente a z por e o que significa v é diretamente proporcional ao z e v é inversamente proporcional aos 1 por r. Então, este é r na verdade, o que significa e r é diretamente proporcional à massa da molécula. Portanto, para uma proteína globular, o raio da molécula está diretamente relacionado com a massa molecular da molécula macro, o que significa que a mobilidade relativa v é diretamente proporcional à carga e inversamente proporcional à massa. Sendo assim, essa é a relação entre a mobilidade eletroforética e a carga da massa pode ser explorada para separar os diferentes tipos de molécula. Porque as diferentes moléculas vão ter as diferentes cargas e elas também vão ter as massas diferentes. E esta é a forma como as pessoas pensaram que se resolvemos as moléculas no campo elétrico podemos ser capazes de separar a molécula utilizando esta propriedade particular. Por isso, para resolver as moléculas eles projetaram diferentes tipos de operadores eletroforéticos. Porque o que você supõe entender é que você está interessado em fazer a eletroforese mas não está interessado em fazer a eletrólise. A eletrólise é um processo onde a molécula percorrerá o campo elétrico e, em seguida, atingirão seus respectivos eletrodos e lá a molécula vai ser quebrada para os átomos individuais e é assim que a molécula vai ser quebrada com a ajuda do campo elétrico. Então, isso é chamado como a eletrólise enquanto que no caso da eletroforese a molécula é sempre permanecida intacta. E percorre o campo elétrico, para que ele seja separado da outra molécula com base na carga por massa. (Consulte O Tempo De Deslizamento: 08:53) Assim, o primeiro aparelho que as pessoas projetaram é chamado como a eletroforese de limite em movimento. Portanto, neste método a eletroforese é realizada em solução sem suportes de suporte. A amostra é dissolvida em tampão e a molécula move-se para o seu respectivo contador carregado eletrodo. Amostra é carregada no meio do tubo U e, em seguida, o aparelho está conectado à fonte de alimentação externa. A molécula de carga se desloca para o eletrodo oposto ao passar pelo refratômetro, uma mudança pode ser medida. Como a molécula desejável passa amostra pode ser retirada do aparelho junto com o tampão. Por isso, em uma eletroforese de limite em movimento o que eles fizeram é que fizeram um tubo de cor U ok. E neste tubo de cor U eles colocaram o cátodo de um lado e o ânodo do outro lado e este está conectado através de uma câmara de carregamento de amostras. Então, a partir desta câmara você pode realmente carregar as amostras então a amostra vai ser preenchida neste tubo do meio. E então eles vão conectar o cátodo e anode até a fonte de alimentação externa. Então, o que vai acontecer são as moléculas positivamente carregadas vão correr em direção ao cátodo enquanto que as moléculas carregadas negativamente vão se deslocando em direção ao ânodo. E na extremidade terminal dessas tubagens eles colocaram os refratômetros em ambos os lados. Então, o que vai acontecer é o refratômetro é um aparelho que realmente mede a mudança no índice refrativo de uma determinada solução. Então, o que vai acontecer é assim que a molécula passar por esses refratômetros haverá alteração no índice refrativo deste amortecedor específico. E como resultado eles saberão que quando uma molécula particular está saindo mas isso é muito, muito ambíguo, isso não é muito preciso. E por outro lado há múltiplos problemas quando eles estavam passando com a eletroforese de limite em movimento, quais são esses problemas. A resolução da técnica é muito baixa devido à mistura da amostra, bem como a sobreposição do componente amostrais. Por exemplo, se você carregar a amostra no meio porque tudo isso é o que você está fazendo em um buffer que na verdade não está tendo nenhuma mídia de suporte. Por isso, assim que você liga o campo elétrico, os íons estão se movendo em direção aos eletrodos de balcão mas assim que você desligar o poder todos eles começam a se misturar ok. E, por estar acontecendo na mídia livre, haverá uma mistura das amostras, não haverá separações e não haverá como você saber qual molécula está se movendo ou passando por um refrômetro. Então, por causa disso ela sempre tem um problema da ambiguidade porque você tem que padronizar muito bem. Então, que você vai saber quando sua molécula de interesse está passando pelo refratômetro. Então, que você pode realmente colocar a pipeta e poderia ser capaz de tirar uma amostra do aparato de eletroforese de limite em movimento. Por outro lado a técnica de eletroforese não é boa para separar e analisar a amostra biológica complexa. Em vez disso pode ser usado para estudar o comportamento da molécula em um campo elétrico, o que significa que este aparato foi bom o suficiente para estudar o comportamento da molécula, o que significa, ele dirá se a molécula se deslocará em direção ao cátodo ou molécula se moverá em direção ao ânodo. Mas nunca foi o bom o suficiente para separar a complexa mistura biológica, por exemplo se você carregar o liso de E. Coli ou células de mamíferos liso, ele não será capaz de resolver as amostras. Porque para resolver você não tem nada foram suportes de apoio, de modo que vai realmente experimentar qualquer tipo de fricções ou qualquer tipo de você sabe separação das moléculas. Então, por causa disso a eletroforese de fronteira em movimento não era muito popular e então as pessoas começaram a desenvolver as novas técnicas. (Consulte O Tempo De Deslizamento: 13:15) Em seguida, eles desenvolveram a eletroforese de zona. Por isso, neste método uma mídia de suporte polimérico inerte está sendo usada entre o eletrodo para separar e analisar a amostra. Os suportes de sustentação utilizados na eletroforese de zona são papel absorvente, gel de amido, ágar-ágar e poliacrilamida. A grande vantagem da presença de suportes de sustentação é que ela minimiza a mistura da amostra e imobilização da molécula após a eletroforese. Faz a análise e a purificação da molécula a partir do gel mais fácil do que a eletroforese de limite de movimento. Então, a grande mudança o que as pessoas fizeram quando caminavam em direção à eletroforese da zona é, que eles começaram a colocar o algum tipo de suportes de apoio, o que significa que eles têm colocado algumas substâncias poliméricas ou algum tipo de gel. Assim, que a molécula será imobilizada sobre esses. Então, por causa disso a molécula vai se separando e você pode ser capaz de visualizá-los porque eles estão imobilizados sobre a substância de apoio. E então você pode manchar e desprender aqueles que apoiam substâncias para saber qual será o padrão. E então, assim, você pode otimizar as técnicas de supressão e, assim, você pode ser capaz de alcançar as melhores purificações. As substâncias o que elas usavam para os suportes de apoio são o papel, o amido, o ágar e a poliacrilamida. Assim, a eletroforese de gel de limite em movimento também é chamada de eletroforese de gel. E dentro da eletroforese de gel você tem o modo 2 no qual você pode ser capaz de realizar a eletroforese de gel quando é chamado como eletroforese de gel horizontal, o que significa que você está realizando a eletroforese em gel na direção horizontal. Então, a eletroforese em gel neste sistema realizado de forma contínua, o exemplo clássico disso é a eletroforese de gel de agarose, então você tem a eletroforese de gel vertical. Por isso, em uma eletroforese de gel vertical você está realizando a eletroforese de cima para baixo. A eletroforese neste sistema se apresentou de forma descontínua com o tampão no tanque superior e inferior conectado pela slab de gel. Ele tem a modificação múltipla na condição de execução para responder às múltiplas questões analíticas. Assim, esta eletroforese de zona também é chamada como eletroforese em gel e a eletroforese em gel pode ser realizada em 2 modo diferente. Ou a eletroforese de gel horizontal onde o sistema vai ser contínuo e a segunda é a eletroforese de gel vertical onde você vai ter o sistema descontínuo, onde o gel é colocado entre os tanques superior e inferior. (Consulte O Tempo De Deslizamento: 16:12) Então, estes são os componentes da eletroforese de gel vertical onde você tem as cassetes de gel, câmaras de eletrodo. Aí você tem o tanque onde você vai colocar isso, então você tem que ter o pente, aí você tem esse eletrodos ou o cabo de energia. E aí você tem a unidade de fonte de alimentação que de fato vai suprida o poder desejável entre os eletrodos. Então, estes são os eletrodos o que está sendo presente na câmara de eletrodo. (Consulte O Tempo De Deslizamento: 16:46) Os reagentes o que você está procurando para a eletroforese de gel vertical. Assim, o tampão e o reagente para a eletroforese, os diferentes buffers e reagentes com o seu propósito para eletroforese vertical são os seguintes. A primeira coisa que você precisa é o TEMED ou o N, N, N, N-tetrametiletiletilenediamina. E o TEMED é um catalisador, catalizam as polimerizações de acrilamida. Em seguida, você requer o amônio por sulfato ou APS, é o iniciador da polimerização acrilamida juntamente estes dois componentes são necessários para polimerizar a acrilamida. Então você requer que o Tris HCL, assim Tris HCL é necessário para preparar a correria assim como os buffers de casting de gel. Depois você tem a glicina que é um componente do tampão rodando, então você tem o azul de bromophenol. Sendo assim, o azul de bromophenol é um corante de rastreamento e é necessário monitorar o progresso da eletroforese em gel. Depois você requer o coomassie brilhante azul R250 que é uma tintura colorida que na verdade vai manchar o gel de poliacrilamida. Em seguida, você exige o sulfato de dodecilo de sódio, sulfato de dodecilo de sódio ou o SDS. Ele é usado para desnaturar e fornecer a carga negativa para as proteínas. E então você exige a acrilamida, então acrilamamida é a unidade monomerica usada para preparar o gel. E então você requer o bis-acrilamida que é o linker cruzado para polimerização do monômio acrilamida para formar o gel. (Consulte O Slide Time: 18:24) Agora vamos ver como a acrilamida vai ser polimerize, então o que você faz de fato é você realmente está sempre fazendo uma solução de gel que na verdade é a solução de acrilamida de 30%. Por isso, na solução de acrilamida de 30% o que você faz é, você adiciona os 29 gramas de acrilamida e depois 1 gramas da Bis-acrilamida. E mantendo estes juntos quando você está adicionando o TEMED e APS que realmente está catalisando a ligação cruzada do monômio de acrilamida com o bis-acrilamida. Então, como a acrilamida vai ser polimerizar é, que você tem a acrilamida e depois tem a Bis-acrilamida. E quando você está incubando estes com o TEMED e o APS, o que aconteceu é que a APS que é amônio por sulfato na presença de TEMED forma os radicais livres de oxigênio e induz a polimerização de acrilamida monomer para formar um Polymer linear. Estes polímeros lineares são interligados pela ligação cruzada com o monómero de bis-acrilamamida para formar uma malha de 3 dimensões com o poro. Então, o que aconteceu é que esses monômeros de acrilamida estão sendo polimerizados, então eles formarão as fibras como esta. Então, porque essas 2 moléculas estão formando os radicais e suponhamos que eles formem os radicais em uma molécula. Esses radicais radicais estão, na verdade, interagindo uns com os outros e é assim que eles estão realmente fazendo as fibras poliméricas. E então essas fibras poliméricas também estão conectadas com a ajuda do bis-acrilamida porque o bis-acrilamida tem a cruz que liga grupos do ambos os lados. E é assim que você está realmente fazendo uma malha 3-D que realmente está contendo os poros em entre. E esses poros são sempre usados para a biomolécula até o passe através. Então, por causa dessa malha você pode ser capaz de experimentar ou você pode ser capaz de produzir o atrito para os diferentes tipos de molécula. E é assim que o atrito vai se jogar na separação da molécula. Então, porque essa malha tem os tamanhos de tamanhos diferentes estas mesh vai tocar uma espécie de filtro de separação ou algo assim. Então, que ela vai realmente ajudar na obtenção da separação das biomoléculas. O tamanho do poro é controlado pela concentração da acrilamida e a quantidade de bis-acrilamida que significa. Se você aumentar a concentração de bis-acrilamida ou se aumentar a concentração de acrilamida, você realmente vai diminuir os poros. Porque você será continuar colocando mais e mais fibra e como resultado o tamanho do poro vai ser menor e menor, o que significa que você não pode ser capaz de usar um gel muito, muito altamente crosslinkado com uma grande proteína. Porque se você usar a proteína grande, a proteína grande não poderá entrar nesses poros e como resultado ela será excluída do gel. Em um sistema de eletroforese de gel vertical lançamos 2 tipos diferentes de gel empilhando gel e a solução gel. Primeiro a solução de gel resolvendo é preparada e pousada no cassete de gel, para polimerização uma fina camada de solventes orgânicos, como o butanol ou o isopropanol é leigo para no topo parar a entrada de oxigênio, por que é assim. Porque o oxigênio neutraliza os radicais livres e retarda a polimerização e mistura a camada superior lisa. Após a polimerização do gel resolvente, um gel de empilhamento é derramado e o pente é encaixado em gel para construção das diferentes faixas para a amostra. (Consulte O Slide Time: 22:33) Então, a correria de uma eletroforese de gel vertical como eu acho que discute o você precisa de um cassete de gel então você precisa de uma câmara de eletrodo, então você precisa de um tanque. E o que você faz de fato é que primeiro despeje o gel resolvendo porque estes são o gel que vai usar para separação da molécula. E então em cima disso você realmente vai colocar o gel de empilhamento a diferença entre a resolução e o gel de empilhamento é em termos de decomposição da acrilamida. Assim como o pH do tampão o que você usa para essas duas gelas também são diferentes. E aí quando você lança o gel resolvendo, você realmente coloca a camada do solvente orgânico. Então, que isso realmente ajuda em termos de polimerização da acrilamida. (Consulte O Tempo De Deslizamento: 23:23) A rodagem do gel, a amostra é preparada na corante de carga que contém o SDS que significa os agentes de desnaturação beta mercaptoetanol que de fato vai quebrar as ligações de dissulfide. E você precisa e todos estes você estará apresentando o glicerol porque o glicerol é necessário para fornecer a densidade na amostra. Então, que facilite o carregamento da amostra no poço. Agora, já que esses poços, então você pode imaginar que este é um poço típico com onde você carregou os diferentes tipos de amostras. Uma vez que todas as amostras são preenchidas uma vez verticalmente há uma deriva à distância entre a molécula em um topo versus a molécula na parte inferior em uma pista. Então, você pode imaginar que você tem isso é uma pista, onde você tem tipos diferentes de moléculas e todas essas moléculas estão tendo. Por exemplo uma molécula número 3 e a molécula número R, todas essas moléculas, imagine se os 3 e R de um mesmo peso molecular mesmo então eles serão uma deriva das distâncias entre os 2. Porque, então se você resolvê-los sem passar pelo empilhamento da amostra ou sem colocá-los no mesmo lugar para correr eles estarão tendo uma deriva, você pode entender que simplesmente olhando para a pista de corrida. Por isso, se você ver uma pista de corrida o que se vê é que os jogadores estão sentados em um local bem diferente. Porque todos esses locais diferentes o diâmetro do círculo é diferente. Mas, neste caso, você não tem tais opções, então o que você tem que fazer é por qualquer meio que você tenha que trazer o 3 e o R juntos. E você pode fazer simplesmente se você fizer um empilhamento das amostras. Agora pergunta é como você pode ser capaz de empilhar a amostra. Então, para empilhar a amostra, você tem que primeiro colocar um gel empilhando. Então, é por isso que o poço tem que ser preparado no gel de empilhamento e você tem que empilhar a amostra. (Consulte O Tempo De Deslizamento: 25:34) E por que o gel de empilhamento na verdade está fazendo o empilhamento porque o pH do gel de empilhamento é de 6,8 e neste pH a glicina está se movendo lentamente na frente enquanto que o Tris HCL está se movendo muito rápido. Então, você pode imaginar que tem esse poço, onde esta é a amostra número 3 e esta é a amostra número R que é muito, muito distante. Mas essas amostras estão presentes em um buffer que na verdade está tendo uma composição de Tris HCL e glicina. Então, e o pH deste gel é 6,8 que é na verdade o pH do gel de empilhamento. Por isso, aos 6,8 anos a glicina está tendo a mobilidade eletroforética muito, muito baixa. Por causa disso haverá um bloqueio de glicina na frente. Então, você tem uma glicina que molécula que está sentada na frente e então você tem a molécula de Tris que na verdade estão presentes no do topo. Então, por causa disso você pode imaginar que está colocando as moléculas as 2 moléculas como a molécula de número 3 e a molécula R entre as como onde o Tris vai ser usado como um êmbolo. Então, o que acontece é que a Tris está empurrando as moléculas enquanto que a glicina não está permitindo que essas moléculas se movem como por sua mobilidade eletroforética. Por isso, por causa disso toda a molécula chegará até este ponto e eles poderão ficar empilhados. Mas, o que acontece é e isso vai acontecer porque eles vão ficar se escorrendo no gel de empilhamento por algum tempo. E durante este período apenas os 3 e R vão se unir e eles formarão uma única banda que na verdade vai conter 3 e R juntos e isso acontecerá enquanto eles estiverem correndo para dentro do gel de empilhamento. Mas assim que eles entrarão na solução gel, então depois disso eles entrarão na solução gel. Então, resolver gel tem um pH de 8,8 o que significa neste pH a glicina agora é carga e ele move-se rápido e agora amostra corre conforme seu peso molecular porque o SDS vai fornecê-los a carga negativa igual. Após a tintura de rastreamento chegar até o fundo do gel, gel é retirado da placa de vidro com a ajuda de uma espátula e ele é manchado com coomassie brilhante azul R250, a proteína de manchas de tintas presente no gel. Assim, assim que ele entrar na tintura de empilhamento, esse bloqueio da glicina vai ser removido. E como resultado as proteínas ou as moléculas vão ser resolvidas com base no peso molecular, o peso molecular mais elevado vai correr mais lento e o peso molecular menor vai correr menor. E porque você quer saber o quanto as moléculas estão indo ou viajando para o gel resolvendo, você também está usando o corante de rastreamento que é o azul de bromophenol. E para tanto o azul de bromophenol é uma tintura muito, muito pequena, então ela corre na frente e assim que chegar até o final do gel, você vai poder saber que ok a eletroforese agora acabou. E aí eu posso parar o gel e eu posso tirar o gel e eu posso fazer a coloração e dester e ver qual é o padrão do gel. Então, trata-se de tudo sobre as informações teóricas da eletroforese, como a história dos operadores eletroforéticos, como os operadores são evoluídos explorando o ou desenvolvendo os diferentes tipos de operadores eletroforéticos. Então, mas isso é todo o conhecimento teórico. Agora, gostaria de levá-lo ao meu laboratório e gostaria de mostrar para vocês uma pequena demo, como lançar as gelas e como realizar a eletroforese. E nesta demo os alunos dissolvem as amostras e depois também mostraram você como manchado e desprendem. (Início do vídeo: 29:55) Neste vídeo, vamos demonstrá-lo como executar um gel SDS-PAGE como preparar vários reagentes necessários para a rodagem do gel SDS e quais são os diferentes instrumentos que podemos utilizar. Então, aqui este é o selo de vazamento de gel, para onde podemos usar essas placas de vidro para preparar o gel. Em entre há um espaço onde podemos despejar nosso gel, solução de gel. Então vamos manter por algum tempo pelo menos 20 30 minutes minutos, deixe-o solidificar, então vamos preparar gel de empilhamento, então vamos notar a nossa solução de proteína. Por isso, aqui antes de fazer isso precisamos de alguns reagentes, então o que são esses reagentes, o primeiro reagente que precisamos para esse experimento é acrilamida. Por isso, geralmente vamos preparar acrilamida 30%, 30% significa 29 gramas de acrilamida e 1 grama de bis-acrilamida. Estes dois podemos usar 29: 1 de proporção em 100 ml de água para obter 30% de acrilamida. Por isso, ambos são neurotóxicos, por isso temos que usar luvas sempre, depois disso temos que preparar a solução de gel. Para resolver gel, precisamos de 1,5 molar Tris HCL, pH 8,8. Além disso, precisamos também de 10% SDS preparados em água destilada dupla e também 10% de amônio por sulfato e também TEMED. O papel do amônio por sulfato e TEMED podemos ver durante a preparação de gel, eles atuam como catalisadores. Depois de solidificar a gente tem que usar, nós como preparar gel empilhando, então empilhar gel não passa de composição é mesmo. Mas podemos dizer que é um diluído, contém pH 6,8. Tris HCL e componentes restantes iguais mas em quantidades menos elevadas. Por isso, depois de preparar o gel, carregamos o marcador e a proteína que é desnaturada a 100 graus Celsius por 3 minutes. Depois disso nós vamos consertar esse gel para este, nós continuamos recebendo este reservatório então vamos nos conectar ao pacote de energia e executar o gel. Então, esta é a introdução geral de como preparar um gel SDS-PAGE. Por isso, vamos começar a preparar gel, vamos aprender mais coisas como preparar o gel. Antes de preparar o gel resolvendo, temos que preparar a configuração do gel de fundição. Então, esta é a placa de vidro, esta é uma bem fina, então esta é a placa de vidro principal, esta é 1,5mm placa de vidro, ela está disponível em 1mm placas de vidro também. Se a sua solução de carregamento for menos como se você quiser carregar apenas 20 microlitros, 30 micro litro então 1mm gel é bom o suficiente. Mas se você tiver volumes estendidos como 70 micro liter, você pode usar 1,5mm, você tem que organizar como este compartilhar placas sobre isso. E os bottoms devem ser iguais, então temos que colocar neste aqui esta bandeja. Aí vamos manter isso, então temos que verificar se configuramos perfeitamente este, então não deve haver nenhum vazamento. Mas se houver alguma vazão você está resolvendo gel pode vazar e você não vai receber nada. Por isso, nesse caso temos que verificar antes de jorrar o gel. Então, se está ok ou não, então eu vou usar a água de milli Q logo depois de verificar o gel se houver algum vazamento ou não. Então, seguimos em frente preparando a resolução de gel, então a concorrência é dada neste slide, por favor, passe por esse slide. Isso é só água, primeiro eu uso água eu vou adicionar sequencialmente 4 ml de água. Agora, como adicionar 3,3 ml de já preparado 30% de acrilamida. Já em introdução, expliquei quanto percentual temos para nos preparar e quanta quantidade de acrilamida e bis-acrilamida precisa tomar. Então, aqui nós temos que adicionar 3,3 ml de solução de acrilamida 30%, então eu tenho que ajustar o micro litro de 300. O componente seguinte é 1,5 molar Tris pH 8,8, temos que adicionar 2,5 ml, o próximo componente é o SDS. Aqui o SDS joga como duplo papel, como uma coisa é que dá carga negativa, crua carga negativa na cadeia de polipeptídeos. O próximo componente que temos que adicionar é o SDS, 10% SDS temos que adicionar 100 micro litro de SDS para reservarmos gel. Ela desempenha um papel muito crucial na eletroforese de gel de poliacrilamida. Como se imistam carga negativa e a cadeia de polipeptídeos, de modo que apesar de sua carga se movem com base no peso molecular. Então, eu vou adicionar SDS, o outro importante é que 10% de amônio por sulfato, amônio por sulfato que é catalisado pela TEMED fornece espécies radicais livres que aceleram a malha de agricultura como forma em gel de acrilamida como ela vai catalisar a formação da malha. Portanto, este é o APS de 10%, eu apenas adiciono 100 micro litros de 10% APS para resolver gel. Na etapa final temos que adicionar TEMED, TEMED depois de adicionar todos os componentes no final do gel, temos que adicionar TEMED. Pois se você adicionar mais cedo ele facilitará rapidamente a polimerização, assim você não pode tirar com a pipeta. Então, ele se solidifica completamente, então é por isso que você tem que adicionar no final da solução gel. Por isso, no I am vou adicionar 5 micro litro desta TEMED que catalisa o amônio por sulfato, amônio por sulfato que ele transforma fornece espécies radicais livres e espécies radicais livres aceleram a polimerização, este é o princípio geral de (()) (40:53). Então, eu acrescentarei, temos que misturar corretamente então adicione lentamente ele um canto, então depois disso temos que sobrepor na camada superior temos que sobrepor algum solvente como 2-butanol ou isopropanol ou com água. Então, por que estamos fazendo isso, porque se o gel for exposto ao ar então o oxigênio do ar vai interferir na polimerização do gel, por isso temos que adicionar água com fio ou 2-butanol para este fim. Agora temos que verificar se ela está solidificada ou não, por isso ela é solidificada, agora temos que remover a camada de overlying como temos usado água. Por isso, não precisa remover, se você estiver usando isopropanol ou butanol você tem que remover isso e lavar com a água milli Q. Então, agora vamos começar a preparar o gel de empilhamento, as composições são dadas no vídeo, você tem que adicionar 3,4 ml de água primeiro. Próximo leito 30 micro litro de acrilamida, 630 micro litro de Tris HCL pH 6,8, 50 micro litro de TEMED e 50 micro litro de SDS que temos a um