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13C Analisi Metabolica Flux

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Ingegneria metabolica Prof. Amit Ghosh School of Energy Science and Engineering Indian Institute of Technology - Kharagpur Lecture - 24 13 C Metabolic Flux Analysis (13 C MFA) Benvenuti al corso di ingegneria metabolica oggi parleremo di analisi del flusso metabolico 13 C. Analisi del flusso metabolico 13 C finora abbiamo imparato sull'analisi del bilanciamento del flux. Così, in questa classe impareremo circa 13 analisi flux metaboliche. Quindi questo è un modo sperimentale per determinare i flussi. Così, in FBA in sostanza non abbiamo fatto alcun esperimento, ma in questo caso noi di 13 C MFA ci occuperemo di fare esperimenti di etichettatura. (Riferimento Slide Time: 01.00) Quindi, discutiamo oggi di questo argomento. E gli argomenti saranno trattati in questa parte della lezione coinvolgerà 13 C MFA. E poi 13 C MFA formulazione, 13 C MFA labeling, 13 C MFA sfida e applicazione 13 C MFA. (Riferimento Slide Time: 01.19) Prevalentemente inizieremo con l'analisi del flusso metabolico. Quindi, l'analisi del flusso metabolico è un ampio soggetto dove si vuole infettare i flussi metabolici accurati della previsione del flusso metabolico. Come ho detto ai flussi metabolici non possono essere misurati direttamente dall'esperimento. Quindi, abbiamo bisogno di una corretta modellazione metabolica e poi possiamo prevedere con precisione i flussi. Quindi, piuttosto che misurare i flussi in realtà prevediamo dei flussi o inferire il vero stato metabolico di un sistema. Quindi, i flussi metabolici sono in realtà il vero fenotipo di una cellula. Quindi, qualunque input tu faccia genomica, trascrittomica, metabolomica. In definitiva, se si conosce il flusso metabolico, cioè il fenotipo finale della cellula, quindi, niente di meglio di flux. Quindi, comporta la modellazione come vi ho detto, sono la modellazione metabolica convenzionale sono limitate in termini di risoluzione non possono catturare determinate caratteristiche come i flussi riciclati, i flussi bidirezionali possono determinare una distribuzione ottimale del flusso ottimale. Così, FBA generalmente dà più distribuzione flux che quelle sono la limitazione nell'analisi del flusso metabolico. Se MFA è lo stato attuale della tecnica dell'arte per quantificare con precisione i flussi intracellulari utilizzando l'analisi del flusso metabolico. Possiamo effettivamente quantificare accuratamente i flussi intracellulari e questo è in grado di catturare la reazione in entrambe le direzioni. Quindi, sia la reazione in avanti che indietro può essere una misura può essere inferta sperimentalmente anche. (Riferimento Slide Time: 03.05) Così, il 13 C MFA prevalentemente comunemente usato in analisi del flusso metabolico MFA 13 C fa uso di 13 C di substrato etichettato. Quindi, qui si permette alla cellula di crescere in un substrato etichettato. Quindi, l'etichettato di substrato è piuttosto costoso e poi il normale glucosio. Ecco, ecco perché questi esperimenti sono esperimenti davvero molto costosi, non solo costosi esperimenti, una volta estratto il metabolita attraverso diversi protocolli. In definitiva, bisogna nutrire l'intracellulare per misurare il modello di etichettatura intracellulare e che viene fatto in massa GC o spettroscopia NMR. I diversi spettrometri di massa sono disponibili oggi, che possono essere efficacemente utilizzati per misurare il modello di etichettatura dei metaboliti intracellulari. Quindi, i metaboliti che si trovano all'interno della cellula qui per misurare o si possono misurare metaboliti intracellulari o aminoacidi proteogenici sono considerati anche per la misurazione dell'etichettatura. E interpretazione diretta dei dati, identificare il percorso attivo in una rete. Così, in questo modo è possibile identificare quale percorso è in realtà attivo attraverso 13 C di flusso metabolico C che si analizzano sarebbe in grado di identificare il pathway attivo in una cella. Anche il modello di etichettatura a volte in grado di darvi percorsi attivi e quei tipi di analisi è noto come impronte digitali da 13 C. E la tecnica utilizzata ampiamente per identificare quali sono le reazioni attive, combinando i dati con il modello metabolico ti aiuta sempre ad elucidare tutti i flussi intracellulari. Quindi, bisogna combinare il modello metabolico insieme ai dati di etichettatura. Quindi, i dati di etichettatura 13 C etichettano i dati da combinare con il modello metabolico al fine di ottenere i flussi intracellulari in 13 C MFA. Così, in questo modo si possono misurare davvero dei flussi molto più accurati. (Riferimento Slide Time: 05.00) Così, questa è la formulazione 30 C MFA come si fa. Quindi, devi come ti ho detto come nutrire la cella con un isotopo stabile di isotopo. Così, potete vedere il glucosio etichettato o il glucosio è completamente etichettato o no etichettato. Quindi, questo è il glucosio completamente etichettato e questo non è etichettato glucosio qualsiasi cerchio scuro significa che il glucosio è etichettato e che viene mostrato qui sopra. Il cerchio bianco dà il normale glucosio questo e il cerchio riempito con colore nero ti dà il carbonio etichettato da 13 C. Quindi, il glucosio ha 6 che è il motivo per cui abbiamo 6 cerchio e 6 cerchio può essere riempito o sriempito il cerchio riempito è sostanzialmente di 13 C di carbonio. E il glucosio può essere completamente etichettato e il glucosio può essere non etichettato che è il secondo e l'ultimo sostanzialmente, abbiamo 1 di carbonio etichettato. Quindi, il carbonio che in realtà è il primo non solo 1 di carbonio etichettato che è il primo etichettato in carbonio che dobbiamo posizare è materia anche in 13 C MFA in 13 C MFA. Abbiamo usato 3 tipi di glucosio completamente etichettato glucosio e glucosio non etichettato e primo glucosio etichettato. Quindi, se la cellula va su questi tipi di fonti di carbonio, allora cosa accadrà allora anche il vostro metabolita sarà etichettato. Quindi, l'aminoacido è generalmente preso di mira per la misurazione si può vedere l'aminoacido che ha 3 di carbonio. Ad esempio, l'alanina ha 3 di carbonio questi 3 carboni possono avere questo molti isotopomeri possibili. Cosa sono gli isotopomeri? Isotopomer è sostanzialmente l'atomo di carbonio che sono etichettati come quanti atomi di carbonio sono etichettati k = 1 significa che nessuno dei carboni è etichettato.
Quindi, è praticamente normale alanina e k = 2 è praticamente 1 di carbonio etichettato e poi k = 3 hai di nuovo 1 carbonio etichettato ma la posizione è diversa k = 4, 2 carbonio etichettato k = 5, 1 carbonio etichettato. Ma il primo carbonio è etichettato e poi k = 6, 2 carbonio etichettato ma le posizioni sono diverse da k = 4 e poi k = 7 abbiamo i primi 2 carboni etichettati e k = 8 tutti i carboni sono etichettati. Quindi, abbiamo per una molecola di 3 di carbonio abbiamo 2 alla potenza 3 isotopomeri, 8 isotopomeri sono presenti per una determinata alanina aminoacidica alanina ha 3 di carbonio. E questi 3 carboni possono dare. Quindi, se lo metti in uno spettrometro di massa che è GCMS. Poi cosa accadrà? Un picco unico da quando è etichettato, se non fosse etichettato, si otterrebbe un picco unico, ma a causa dell'etichettatura, e poi si otterranno 4 picchi. Quindi 4 picchi conosci la proprietà del GCMS. GCMS è in realtà misurata la molecola in base al rapporto di massa m per z. Così il rapporto m per z si assume la carica per essere costante. E poi per una determinata alanina la carica è costante, ma la massa, c'è una differenza c'è una differenza di massa. Perché 13 C e 12 carboni normali sono presenti una differenza nella 1 unità di massa. Ecco perché m 0 significa che abbiamo un picco diverso, perché la massa di m 0 è diversa da m 1, m 2, m 3. Quindi l'isotopomero e poi c'è una distribuzione di massa vettoriale di distribuzione di massa che è possibile ottenere dal GCMS è mostrato qui sopra. Qui potete vedere la m 0 significa una normale alanina che ha 3 di carbonio e m 1 significa il 1 di carbonio etichettato, ecco perché è m 1. Quindi, tutte le 3 molecole mostrate qui sopra stanno sostanzialmente avendo 1 di carbonio etichettato. Così si raggrupperanno in 1 picchi. Così loro perché lo spettrometro di massa non sarà in grado di differenziare, queste 3 molecole, che stanno avendo isotopomeri diversi perché la massa sono diverse, sono le stesse che si raggruppano in m 1. Analogamente per il m 2 se si vedono questi sono tutti 2 di carbonio etichettati. Ecco perché sono raggruppati in m 2. Così abbiamo 2 molecole di carbonio par molecole. Ecco perché e ci darà un picco unico. E m 3 se vedete ci sono solo 1 e tutti i 3 carboni così questi tutti m 0, m 1, m 2, m 3 sono diversi perché hanno una massa diversa. Ecco perché mostrano picchi diversi nella massa GC. Analogamente, per un frammento di 2 di carbonio avrete 3 picchi in questo modo se ho un frammento di carbonio 4, perché stiamo chiamando frammento nei diversi metaboliti GCMS possono essere trattati come un frammento che può essere misurato nel frammento GCMS 1, frammento 2 e si differenziano in base alla massa della molecola che sta misurando. Quindi, su k = da 1 a 8 isotopomero abbiamo 4 picchi. Così, dato per k isotopomer k = 8 abbiamo 4 picchi m 0, m 1, m 2, m 3. Quindi, se si alimenta la cella con l'isotopo etichettato il glucosio e si otterrà questa suddivisione nel picco e l'isotopo etichettato atomo con distinta distribuzione di etichettatura sono incorporati nella struttura di vari metaboliti. Quindi, gli isotopi etichettati sono in realtà incorporati nella maggior parte dei metaboliti. E poi si può misurare GCMS che abbiamo usato per quantificare l'abbondanza relativa degli isotopi presenti nei metaboliti analizzati analizzati. E questo è GCMS è utilizzato per caratterizzare o ottenere una relativa abbondanza dell'isotopo presente nel campione e l'isomero di differenza di un metaboliti è indicato come isotopomero. Quindi, questi sono sostanzialmente isomeri di metabolita, questo è lo stesso metabolita, ma si differenziano in base all'atomo di carbonio che sono a etichetta o non etichettati e sono conosciuti come isotopomeri. Quindi, questi isotopomeri in realtà possono essere misurati in un GCMS ma non si trova la differenza, se sono di stessa massa. Così, per esempio, questo uno si vede che tutti loro tutte le 3 molecole hanno la stessa massa che è il motivo per cui sono raggruppate nello stesso pic. E analogamente, per questo, vedrete che sono raggruppati in stesso pic. (Riferimento Slide Time: 12.15) Dunque, la connettività di rete metabolita e le informazioni di mappatura dell'atomo vengono utilizzate per infettare la distribuzione del flusso. Quindi, per capire e misurare i flussi o calcolare i flussi di cui è necessario collegare in realtà la necessità di realizzare una matrice di mappatura dell'atomo o informazioni di mappatura dell'atomo è utilizzato per infettare il flusso che può mappare tra isotopomeri. E il vettore di distribuzione di massa che si ottiene da MDV si ottiene dalla massa GC. Ecco, queste sono le 2 informazioni che si compatte teoricamente attraverso la simulazione in realtà si ha un isotopomero e poi MDV che si ottiene dall'esperimento. Quindi, la MDV è molto collegata all'isotopomero. Quindi, c'è una matrice di mappatura che può calcolare queste informazioni. E poi si può confrontare e ottenere la cosa più importante che sono i flussi, quindi, minimizzare la divisione quadrata tra i previsti. Quindi, qui abbiamo il previsto attraverso la simulazione abbiamo una distribuzione prevista di isotopomeri. E poi hai la MDV che l'hai ricavata dagli esperimenti. Quindi, questa differenza, se riesci a misurare la differenza e poi saresti in grado di calcolare i flussi, quindi, come è fatto discuteremo in più dettagli nelle slide successive. (Riferimento Slide Time: 13.47) Così, questo è un esempio di come le classi di equivalenza del frammento possano caratterizzare. Così, ho iniziato con un sistema di carbonio 3 dove sono etichettati i primi 2 carboni. Quindi, questo è etichettato questo è etichettato che è scritto in colore grigio. E l'altra classe che abbiamo a che non è etichettata perché ho una molecola che passo 2 di carbonio sono etichettate e il terzo carbonio non è etichettato.
Poi chiamo questa parte come 1 questa parte come 2 e poi passa attraverso una reazione. E produce 2 molecole che supplisce di avere una molecola che ho avuto quella ha 3 di carbonio e i primi 2 carboni sono etichettati. Così, dopo aver reagito quello che è successo che questi 2, 3 di carbonio si sono rotti in 2 frammento dove abbiamo i primi 2 carboni in realtà sono etichettati che arrivano come molecola 3 e poi questo è non etichettato come molecola 4. Così, possiamo vedere come vengono distribuiti i carboni di etichettatura, quando va ad una rete metabolica o in un metabolismo, come si separano. E quando abbiamo un'altra reazione in cui si può vedere che questi 3 di carbonio rimangono integri non c'è cambiamento. Quindi, stanno andando alla reazione, non c'è che i metaboliti non siano rotti. Quindi, non sono separati in termini di carbonio e poi cosa succede? Hanno un'altra reazione che mantiene solo la stessa e un'altra reazione che potete vedere nella fila 3, potete vedere che questi 2 di carbonio si sono uniti di nuovo insieme per diventare una molecola originale. Così, in questo modo si può vedere come i frammenti, si uniscono e poi si sono rotti e si separano a vicenda. E formano una molecola diversa e che bisogna tenere traccia così, in 13 C MFA etichettato, si traccia questo carbonio etichettato per identificare come scorrono i carboni in rete. Su questo vi dà anche un'idea di quanto carbonio quanto flux la reazione porta, si può identificare. E possono essere raggruppati in questa rete possono essere raggruppati in 2 classi che 1, 3, 5, 7 e 2, 4, 6, 8, 1, 2, 1, 3, 5 e 7. Quindi, tutto questo ha 2 etichettati di carbonio che è il motivo per cui appartengono alla stessa classe e 2, 4, 6, 8 ha un carbonio 2, 6, 2, 4, 6, 8 hanno 1 di carbonio non etichettato. Quindi, questi sono questi appartengono a una classe diversa. Quindi, abbiamo 2 classi in questa rete e una classe dove abbiamo 2, 4, 6, 8, 1 hanno carbonio non etichettato e 1, 3, 5, 7 hanno etichettato carbonio. (Riferirsi Slide Time: 16.38) Dunque, questo è un flusso metabolico flux mentre si inizia con un esperimento, quindi, qui bisogna fare l'esperimento in cui si permette alla cellula di crescere in un glucosio etichettato. Quindi, la cultura la cellula dove nei media hai etichettato il glucosio questo non è un normale glucosio è un etichettato. Perché quello che il primo carbonio è in realtà etichettato il primo atomo di carbonio della molecola di glucosio è etichettato, e permettere alla cellula di crescere in quel supporto etichettato. Quindi, cosa accadrà dopo qualche volta e il glucosio da quando il glucosio è etichettato. Così come la cellula mangia questo glucosio che viene etichettato glucosio e poi lentamente anche il metabolita sarà etichettato. Così, la maggior parte dei metaboliti otterrà qualche incorporazione di etichettatura, a seconda della reazione che sta avendo, come nella slide precedente avrei dovuto dirti come avviene la reazione come 1 metabolita si separano in 2 metabolita e di nuovo 2 metabolita si uniscono a vicenda per formare un metabolita del 1. Quindi, tutti quei tipi di reazioni di dissociazione dell'associazione, che stanno accadendo all'interno della cellula, a seconda del tipo di reazione che ottiene, incorporano l'etichettatura. Quindi, l'incorporazione dell'etichettatura etichettato non è casuale, questo è quello che voglio dire. In sostanza dice che il tipo di reazione che sta vivendo, se il reattante e il prodotto hanno lo stesso numero di carboni, non c'è cambiamento nello schema di etichettatura. Così metabolita A se metabolita A e B, se abbiamo una reazione da A a B, se ha un modello di etichettatura, e B ha un modello di etichettatura A e B il modello di etichettatura rimarrà lo stesso, perché non c'è associazione e dissociazione nella reazione c'è solo quando i reattanti e i prodotti subiranno associazione o dissociazione vedono solo che il modello di etichettatura cambia. E ora vogliamo identificare quali sono i metaboliti che si vogliono misurare per la misurazione dell'etichettatura, questo è molto importante come una volta che qui la cellula attraversi la fase esponenziale. Quindi, durante la fase esponenziale, dove la cellula è in crescita, e dove si assume un'approssimazione dello stato costante, è il momento in cui si prende la cella e si limona la cellula e si ottiene tutto l'aminoacido. Quindi, gli aminoacidi sono considerati come il metabolita finale della cellula. Quindi, lisciate la cellula e ricevete i metaboliti. Ora, gli aminoacidi che si ottengono dalla cellula possono essere aminoacidi intracellulari o aminoacidi protesi. Quindi, oggigiorno, a causa della tecnologia in metabolomica siamo in grado di misurare l'aminoacido intracellulare anche che può essere utilizzato anche per la misurazione metabolica. Quindi, scali questa cultura e la nutre in GCMS. Quindi in questo GCMS è possibile misurare il modello di labeleding dell'aminoacido da quando gli aminoacidi sono i metaboliti finali. Quindi, una volta che gli aminoacidi si formano non c'è alcuna dissociazione gli aminoacidi non sono rotti. La maggior parte degli aminoacidi non sono rotti perché vanno per la sintesi proteica. Quindi questi aminoacidi protesi possono essere le proteine che possono essere raccolte dalla cellula e poi si può fare la digestione di tripsina per ottenere tutto l'aminoacido dalla proteina e poi si può alimentarlo in GCMS e si può ottenere un profilo come questo. Quindi, questo è il profilo metabolita così, che cosa è questo? Questo è molto importante e l'asse y si vede la percentuale della molecola che è etichettata così asse è sostanzialmente la percentuale della molecola che viene etichettata. Quindi, e queste sono la molecola queste sono il carbonio come il numero di carbonio etichettato. Quindi, 0 mezzi, la frazione di carbonio che è 0 di carbonio etichettato. Quindi, qui si può vedere non c'è un picco significa che non esiste una molecola che abbia 0 di carbonio etichettato così, molecola di alanina, quindi, abbiamo considerato il pattern di etichettatura o l'alanina, vedere la molecola di alanina non ha più il carbonio la percentuale della molecola dove nessuna delle molecole di carbonio sono etichettate così, cioè 0 e poi ho la frazione 1, 1 significa che è 1carbon solo 1 di carbonio etichettato.
Quindi, quello e questa posizione possono essere ovunque perché si sta misurando attraverso GCMS non può differenziare la posizione. Quindi, solo una frazione della molecola che in realtà è 1 di carbonio etichettato che è con 13 C e poi ne abbiamo 2 che è una frazione della molecola che è in realtà 2 carbonio etichettato e abbiamo 3 etichette di carbonio da quando l'alanina ha 3 di carbonio, quindi, otteniamo un massimo di 3 di carbonio. Ma possiamo misurare solo il GCMS allora c'è una probabilità che si possa ottenere un errore ed è anche per questo che si mostra anche il 4 di carbonio etichettato, ma in realtà è proprio a causa dell'errore. Così, in questo modo è possibile misurare in realtà il profilo metabolico il profilo di etichettatura di diverso aminoacido e poi questo labeling di aminoacidi è necessario per misurare il calcolo dei flussi così, questi esperimenti vengono fatti in un pallone. Quindi, nel pallone si può utilizzare un filo di flusso che fornisci i supporti etichettati e permettere alla cellula di crescere in un supporto etichettato e poi e quando è nella fase esponenziale si esce dalla coltura significativa della nostra coltura è estratte dalla fiaschetta e poi si limona la cellula e si prova a fare la digestione della cellula e si cerca di fare la digestione della tripsina per ottenere tutto l'aminoacido o si può anche usare aminoacido intracellulare anche aminoacido intracellulare sia per la misurazione del flux. (Riferirsi Slide Time: 22.35) Così, questi sono il modello di aminoacido labeleding che potete vedere questo è glutammato, acido aspartico, alanina, fendi alanina, aspartato, serina e l'asse x potete vedere che il numero di carboni etichettati 0 significa 1 carbonio etichettato 2 significa 2 carbonio etichettato e 3 significa 3 carbonio etichettato e che la persona è etichettatrice è mostrata in y asse e l'asse y si può vedere che quanta frazione della molecola è etichettata. Quindi, in sostanza è una probabilità che si prenda 1 secondi di etichettatura massima può essere 1 e poi in base a quella, si può fare un rapporto quanti carboni sono etichettati e una volta che si misura l'etichettato poi si può usare quel modello di etichettatura possibile ottenere un profilo flux come questo sul lato destro, si vede un profilo flux che si ottiene da 13 C MFA. Quindi, quello che fa, quello che dice che un glucosio sta entrando nell'allargarsi delle frecce sono sostanzialmente la quantità di carbonio che scorre dalla maggior parte del flusso passa attraverso la glicolisi. E qualche parte del flusso passa attraverso il pathway di ppp mostrato qui e poi una parte della classe va in glicolisi e va in ciclo TCA e poi dal ciclo TCA si possono vedere diversi metaboliti sintetizzati come il glutammato dal coenzima acetile A si può vedere l'acetato viene sintetizzato e poi il formaso, lattato che va fuori dalla cellula e dall'etanolo. Quindi, la maggior parte dei metaboliti che si possono caratterizzare utilizzando il modello di etichettatura. Quindi, l'input per questa analisi flux è l'etichettatura di aminoacidi labeling e l'output è sostanzialmente un profilo di flusso che viene mostrato qui sopra. (Riferimento Slide Time: 24:25) Quindi, la soluzione in cui si risolve realmente questo problema è molto interessante come vengono determinati i flussi? Quindi, nel 13 C MFA dove la tecnica è diversa da FBA. Così, FBA, abbiamo visto che si massimizza la biomassa e si ottiene un profilo di flusso. Ma in 13 C MFA non abbiamo un'equazione di biomassa. Quindi la maggior parte del tempo, non includiamo in realtà l'equazione di biomassa nella rete metabolica. E quando quindi cosa ottimizzare?
Quindi non abbiamo una funzione oggettiva. Così, qui in realtà otteniamo il profilo di flusso basato su pattern di etichettatura. Quindi, i dati sperimentali che otteniamo, quindi, questo è il dato sperimentale che abbiamo utilizzato questo dato sperimentale, si vuole ottenere il profilo flux e per questo si prende anche una rete metabolica così come anche il modello metabolico di rete metabolica è necessario per misurare realmente il flusso. Quindi, per misurare il flusso, cosa si fa scegliere una distribuzione del flux. Quindi, viene scelta la distribuzione del flux e poi ci sono algoritmi matematici o equazioni impostate di equazione dove è possibile utilizzare l'etichettato A il profilo flux per prevedere l'etichettatura degli aminoacidi. Quindi, per dato v i così, se ho una distribuzione di flussi si può effettivamente misurare in modo da poter prevedere l'etichettatura degli aminoacidi. Quindi, ci sono un insieme di equazione che si può questo è completamente teorico come se si ha un profilo di flusso poi si può prevedere l'etichettatura degli aminoacidi. Quindi, l'etichettatura degli aminoacidi può essere prevista anche dal profilo flux e questo labeling di aminoacidi che si prevede e che è dalla simulazione è possibile confrontare con l'etichettatura aminoacido che si sta ottenendo dal GCMS che sono i dati sperimentali. Quindi, questo è il motivo per cui 13 C MFA è anche noto in quanto si tratta di una procedura per alimentare i dati computazionali con dati sperimentali è una procedura di adattamento. Quindi, loro cosa si fa in pratica si prevede l'etichettatura degli aminoacidi dal profilo flux e poi confrontato con i dati sperimentali. Quindi, in sostanza l'algoritmo ricorsivo come algoritmo ricorsivo dice che si ha una funzione di errore qualunque sia la funzione oggettiva in sostanza funzione di errore. La funzione di errore è definita in modo tale che il profilo di etichettatura metabolica determinato sperimentalmente che sia un vettore di distribuzione di massa può essere confrontato con l'etichettatura derivata computazionalmente questa è in sostanza sperimentale una che viene mostrata e questo è il vettore di distribuzione di massa simulato. E poi se la differenza è molto, molto piccola, allora la tua funzione oggettiva diventa molto, molto facile, molto vicina a 0 e 10 alla potenza meno 10 di potenza meno 20 così. Ed è per questo che si ferma il calcolo altrimenti, si tratta di una procedura iterativa. Quindi, ecco perché si tratta di un algoritmo ricorsivo. Quindi, per darvi un profilo di flusso edge, si calcola l'amminoacido etichettato e poi si confronta con i dati sperimentali e se il confronto che è la funzione di errore tra l'esperimento e la simulazione o i metodi computazionali sono in realtà molto, molto vicini poi in e poi la sua funzione di abilità diventa molto, molto piccola, molto vicina al 0. Ed è qui che si ferma il calcolo così, non andrà in procedura iterativa e si fermerà. Quindi, in questo modo è per questo che la determinazione del flux usando il 13 C MFA richiede molto tempo, perché si tratta di una procedura iterativa all'iterazione per molti cicli e poi una volta uguale allora il calcolo viene arrestato. (Riferimento Slide Time: 28:30) Quindi, una volta che si adattano i dati con l'etichettatura sperimentale, allora l'allestimento questi sono i valori montati qui mostrati qui gli esperimenti mostrano il colore rosso e il blu è sostanzialmente il calcolo. Quindi, i valori sperimentali e i valori computazionali vengono mostrati qui sopra. Quindi, questi sono valori sono confrontati per l'alanina così, l'alanina, le asparagine di arginina, l'aspartato, la glutammina, il glutammato, la lisina, l'isoleucina, la leucina, la fenilalanina, la threonina, la tirosina, la valina. Quindi tutti questi aminoacidi sono stati confrontati sul modello di etichettatura sono stati confrontati con il valore sperimentale se l'allestimento è buono, allora è lì che la fermata di calcolo e quello che si ottiene si ottiene il flusso. Quindi, allora si può dire bene che questo sono i modelli di etichettatura che corrispondono ai dati sperimentali questa distribuzione flux deve essere sperimentalmente vicina. Quindi, il ceppo che si sta utilizzando è il punto temporale che si sta utilizzando.
Quindi, tutti quelli dicono che durante quel periodo ti indico da quando hai raccolto il campione durante quel momento. E questo è il momento in cui i modelli di labeling player sono molto vicini l'uno all'altro e si dice che questo è molto più vicino al flusso sperimentalmente misurato in questo modo ottenere sperimentalmente un flusso di infra dal pattern di etichettatura. (Riferimento Slide Time: 29:53) Quindi, questo è il profilo di flusso che si ottiene da 13 C MFA. Quindi, generalmente cioè che l'analisi di flusso MFA ha da 50 a 60 o 100 reazione. Così, si considera solo la rete metabolica centrale. Quindi, se includi più reazione cosa è successo? Il tuo calcolo diventa molto tempo intensivo. Inoltre potrebbe accadere che avranno più errori nella stima del flux. Ecco, ecco perché sono calcolati il profilo di flusso di 13 C MFA per non più di 100 reazioni che renderemo la vostra rete molto piccola in modo che il vostro calcolo non sia molto tempo intensivo. (Riferimento Slide Time: 30:38) Quindi, le sfide in 13 C MFA ci sono varie sfide in 13 C MFA analisi metabolica assistita. (Riferimento Slide Time: 30:45) La prima è sostanzialmente questa cultura dello stato stazionario. Quindi, ipotizziamo l'approssimazione dello stato stazionario S dot v = 0 che abbiamo visto nell'analisi di bilanciamento del flusso FBA, l'approssimazione dello stato costante viene applicata anche in 13 C MFA. Ma raggiungere uno stato costante è anche tempo di consumare, ci vuole molto tempo per raggiungere lo stato stazionario. Quindi, cioè quelli sono il collo di bottiglia in 13 C MFA e i 13 C MFA sono fatti in un esperimento di frullato in seconda classe, il flusso di frullato è più conveniente, ma la buona condizione non è stabile. Quindi, questo rende l'esperimento un po' erroneo. E poi si può avere la fermentazione bioreattore molto più importante se si può acquistare bioreattore per fare questo tipo di cultura dello stato stazionario, ma sono costosi, poi il controllo è migliore perché in un bioreattore abbiamo un controllo migliore rispetto a questo pallone da frullato. Ecco quindi che sono disponibili anche i mini bioreattori, dove possiamo generare dati ad alto throughput low cost per l'etichettatura dei supporti. Perché i media questo è un mini bioreattore mostrato qui, se il volume della cultura è molto meno simile supporre 10 mL, poi si risparmia un sacco di soldi, perché 13 C MFA richiedono supporti di glucosio etichettati e il volume dei media è molto piccolo come se si inizi una coltura con 30 mL, allora serve più glucosio etichettato. Ma se hai un volume più piccolo, come 10 mL, allora hai meno volume. Quindi il tuo costo di sperimentazione riduce e dicono che se usi un mini bioreattore, in modo che queste siano le sfide che affrontiamo, affronteremo quando farai 13 C MFA.
(Riferimento Slide Time: 32:29) Poi la seconda sfida è una semplice rete metabolica. Quindi generalmente si ha da 60 a 80 reazioni. Come ho detto alla rete metabolica centrale è considerato per il calcolo di 13 C MFA. Quindi magari vuoi rendere più semplice il tuo calcolo. Ecco perché prendi da 60 a 80 reazioni, non è solo più semplice, se hai molte reazioni, allora il tasso di errore sarà di più in questo sistema. Perché 13 C MFA si occupa di equazione nonlineare. Quindi FBA è semplice perché l'equazione lineare, quindi i tuoi calcoli sono molto, molto semplici. Posso fare calcolo in FBA in una frazione di minuto. Ma in 13 C MFA le equazioni sono nonlineari. Ed è per questo che ci vuole molto tempo. Così, per ridurre il costo di calcolo, si riduce la rete. Quindi questo è il modo più semplice così, hai una semplice rete metabolica, in modo che i tuoi calcoli siano più facili. (Riferimento Slide Time: 33:26) Quindi, l'analisi del flusso e oltre il metabolismo centrale si può andare oltre il metabolismo centrale per il fatto che si deve misurare diversi metaboliti che i tempi di conservazione sono indicati per diversi metaboliti, che si possono misurare in GC. E poi si può ottenere un'analisi del flusso metabolico in scala del genoma. Quindi questo se si può fare analisi metabolica su scala del genoma, i benefici sono più di quanto si possa fare il bilanciamento del cofattore o il consumo e la produzione di metaboliti diversi possono essere effettuati a una scala di genoma etichettata. Quindi ci sono un sacco di benefici se si può passare dalla rete metabolica centrale alla scala di genoma etichettata. Perché FBA si fa in una scala di genoma etichettata ma 13 C MFA non vengono fatte a una scala di genoma etichettata. Quindi c'è un collo di bottiglia quindi ci sono queste sono le sfide che le persone stanno provando dove possono effettivamente fare analisi del flusso metabolico in scala di genere utilizzando 13 C MFA. E mentre, la rete di scala del genoma del centro può essere considerata. Per quanto si può misurare diverse alanine metaboliche, arginina, asparatato tutto diverso aminoacido può essere misurato, si può misurare anche il piruvato. In modo che ci siano 120 metaboliti che si possono misurare oggi usando la massa LC. Si tratta di una massa GC disponibile, dove si possono misurare molti metaboliti, ma in massa LC abbiamo molto più grado di libertà o si possono misurare molti metaboliti. (Riferimento Slide Time: 34:54) Così allora abbiamo le sfide con la cultura mista. Quindi la cultura mista è fondamentalmente abbiamo 2 microbi, microbe 1 e microbe 2 e 13 C MFA si può fare solo in una cultura pura. Quindi, come può essere esteso il 13 C MFA per includere la cultura mista è anche un'altra sfida. Quindi, quella sfida che si può fare misurando il flusso usando peptide piuttosto che metabolita. Quindi, di gran lunga ho discusso che, i metaboliti possono essere utilizzati per misurare i flussi. Ma quando si considerano i consorzi o una cultura mista allora il metabolita non può essere utilizzato per la stima del flux per cui generalmente si utilizza proteine la proteina totale di biomassa può essere utilizzata per calcolare effettivamente i flussi. Così, si idrolizza la proteina e poi si ottiene l'aminoacido e dopo l'idrolisi è possibile utilizzare un peptide come aminoacido per la misurazione dei flussi. Ecco, queste sono le sfide che ci troveremo ad essere consorzi misti o di cultura mista possono anche essere utilizzati per misurare realmente i flussi. Quindi, qui si ha l'evento di fluxes specifico dell'organismo, si avvia una coltura con consorzi misti e poi si identifica la proteina do idrolisi e l'organismo specifico peptidi può essere scelto dove si può avere un profilo di etichettatura per peptide e il peptide è unico per un determinato organismo così, che si possa ottenere un metabolico specifico dell'organismo