Loading

Alison's New App is now available on iOS and Android! Download Now

Study Reminders
Support
Text Version

Set your study reminders

We will email you at these times to remind you to study.
  • Monday

    -

    7am

    +

    Tuesday

    -

    7am

    +

    Wednesday

    -

    7am

    +

    Thursday

    -

    7am

    +

    Friday

    -

    7am

    +

    Saturday

    -

    7am

    +

    Sunday

    -

    7am

    +

questa slide è qui se ho avuto modo di bloccarlo, posso immediatamente chiedere un quiz e vedere se vi ricordate, quindi dove troverete il cap 5 '? All'inizio dell'UTR. Quindi quale sarà il rapporto di inizio della trascrizione con la relazione con gli esoni e gli introni? Così il 5 ' UTR può benissimo partire dal sito di inizio della trascrizione in modo che possa essere anche in exon. D'accordo, faremo più quiz dopo su questo. Così in questo momento continueremo su questo, quindi oggi ci concentreremo prevalentemente sulle tecniche di biologia molecolare, alcune delle quali avrete forse imparato in altri corsi, e alcune di esse potrebbero essere nuove. Perché alcuni di loro sono tecniche a base di organismi interi e che forse non avete sentito altrove. Quindi essenzialmente, l'attenzione principale sono le tecniche con cui cerchiamo di capire l'espressione del gene differenziale. Ecco allora che sarà il fulcro di questa lezione così come quella successiva. (Riferimento Slide Time: 01.43) Così si continua a aggiornare la nostra memoria della struttura del gene eucariotico. Così il precedente era un cartone animato; si tratta di una sequenza effettiva del gene beta - globina. Quindi si hanno gli elementi promoter a monte come la casella TATA e questa è la sequenza -70. Quindi questi sono lì nella maggior parte dei promotori; ecco perché fanno parte della struttura principale qui. Quindi questa è la sequenza che segnala l'aggiunta di cappuccio. E quelli colorati sono esche i grigi sono gli introni. Così si vede che l'UTR è un eson e lì si ha il tappo, inizia il codon ATG, poi il nucleotide effettivo e la sequenza aminoacidica tradotta. Poi hai l'inizio di un intron e fine di un intron e poi così via. In seguito, alla fine, si ha il codone di stop, e poi si ha 3 ' UTR. Così poi si ha l'AATAAA, questo è un segnale di poli - A canonico, ma altre varianti di questo funzionano anche come segnale di poliadenilazione. Quindi aiutano a identificare anche il sito di cleavage. Quindi in realtà, la macchina che fa la cleavage, qui il mezzo cleavage, la trascrizione pre mRNA o nascente può essere più lunga al 3 ' rispetto a quella maturata nel citoplasmo avendo la coda di poly-A. Così alla fine della cleavage da 3 capita, quindi, viene rimossa una certa quantità di mRNA trascritto, e al resto viene aggiunta la coda di poly-A. Quindi questo è un grande complesso e altamente regolamentato; è grande quanto un riboso. Un altro complesso così importante sono gli spliceoalcuni, i macchinari splicanti. Si tratta quindi di grandi complessi proteici che operano. (Riferirsi Slide Time: 03.45) Così, il prossimo, stiamo guardando la trascrizione stessa, quindi questo è il primo passo qui, quindi si ha la trascrizione. Così non appena esce il nascente mRNA o l'RNA nucleare, si ha il tappo aggiunto, Trimetil G cap. In quella fase, la splicing deve ancora accadere; è quello che voglio sottolineare, queste aggiunte aiutano a proteggere l'RNA. Ma non sono sicuro perché quel passo sia veloce, ma queste aggiunte succedono a entrambe le estremità prima di sprigionare. Così poi si ha l'elaborazione, che è essenzialmente sprigionare. (Riferimento Slide Time: 04.28) Poi si ha l'RNA messaggero o l'mRNA maturo, quindi questo entra nel citoplasmo dove viene tradotto, poi si ha la catena proteica. E poi questo deve sottoporsi a due cose; una corretta piegatura alla conformazione nativa e anche la modifica post - traslazionale. Così qui, ad esempio, si aggiunge il gruppo protesico, si tratta di una proteina a quattro sottounità, si tratta di un eterodimer. Quindi beta - globina, alfa - globina, ognuno si riunisce per rendere la molecola funzionale. Quindi tutti questi passi messi insieme è quello che si chiama come espressione genica. Quindi non supponete che solo la trascrizione sia espressione genica, e questo è qualcosa come il livello delle proteine, il tutto è espressione genica. Quando si parla di gene, la definizione di un gene è una funzione biologica che è il fenotipo, quindi la proteina ne è responsabile. Quindi non distinguiamo questi passaggi, a partire dalle modifiche della struttura cromatica; come da heterochromatina alla trasformazione eucromatina che avviene a causa della rimozione dei gruppi metilici e dell'aggiunta di gruppi di acetile e specifici gruppi di metile a H3 di coda; a partire da lì alla proteina attiva o inattiva modificata post - traslazionale. Quindi fino a questo, i passi interi sono chiamati espressione genica; ognuno è un passo nell'espressione genica. Così ora sappiamo cosa è un gene e qual è la sua forma funzionale finale. (Riferimento Slide Time: 06.13) Così ora guardiamo di nuovo stiamo aggiornando altri passi, non stiamo ancora entrando nell'espressione del gene differenziale. Per questo vogliamo familiarizzare con ciò che accade, in modo da sapere dove possono accadere le normative. Quindi la prima cosa è che analizzeremo l'iniziazione della trascrizione stessa, quindi l'iniziazione trascrizione in questo cartone animato va con alcuni dettagli. Ancora, il riassunto è che una serie di proteine devono legarsi in una sequenza specifica per consentire alla RNA polimerasi di avviare la trascrizione. Quindi l'assemblaggio iniziale e il reclutamento della RNA polimerasi al promoter è quello che si chiama come iniziazione di trascrizione. Quindi qui hai TF2D, fattore di trascrizione 2D, quindi che ha prima a legarsi, lega la scatola TATA poi recluta 2A, poi hai B e H, queste strutture simili a incastri. (Riferirsi Slide Time: 07.14) Si aggiungono, e poi solo tu hai la pol II reclutata, e alla pol II hai la E e F già vincolante per esso, e quando lega questo dominio carbossi - terminale, CTD gioca un ruolo significativo nella regolazione. Così che è legato alla struttura 2D, la molecola principale. (Riferirsi Slide Time: 07.39) E così è così che è, quindi questo è già impostato, ma è un non andare. Quindi che richiede la fosforilazione del CTD. Quindi, al fosforo o no al fosforiato è un passo lì. Se la fosforilazione non avviene, allora la trascrizione non sarà avviata, sebbene tutto abbia legato. Quindi questo è un passo in cui spesso accade la regolamentazione. Quindi certi residui di serina sono critici per la fosforilazione. Così spesso, i biologi dello sviluppo utilizzano quegli anticorpi specifici della serina fosforilata o gli anticorpi specifici del CTD fosforilati per misurare se la trascrizione avviene in un determinato nucleo oppure no. Quindi con quegli anticorpi specifici di fosfuro o CTD specifici anticorpi fosforilati, se non si rileva probabilmente un segnale, non è presente alcuna trascrizione mRNA. Allora ricordati che stiamo parlando solo mRNA perché si tratta di anticorpi specifici di pol II, ma potrebbe accadere altra trascrizione. Quindi una volta pol II fosforilati, poi viene rilasciato da TF2D, ed è pronto ad allungare. Quindi iniziate allora allungamento, quindi questo è il passo di iniziazione, e questo è allungamento. E anche in allungamento può essere messo in pausa a volte, quindi non stiamo entrando in quei dettagli, ma questo è abbastanza per sapere che si tratta di un potenziale passo per la regolamentazione. (Riferimento Slide Time: 09.17) Ok, quindi ora siamo fatti con quelle basi. Quindi ora analizzeremo una serie di esperimenti che ci aiutano a individuare sequenze nella regione promotrice e come altrove nelle vicinanze del gene che potrebbe contribuire alla trascrizione di uno, e secondo, andiamo anche a guardare come si trovano i fattori di trascrizione? Ovvero, transitare fattori come le proteine. La sequenza di DNA si chiama Cis perché è nella stessa molecola del telaio a lettura aperta e la proteina è codificata altrove, e arriva come una molecola diversa da quel pezzo di DNA dove si ha il gene, quindi, quindi, si chiama Trans. Quindi quando si dice fattori di trasposizione si parla di fattori diversi da una data sequenza di gene che influenza quell' espressione genica. Si tratta quindi di un Assago molto usato; la gente lo usa per più contesti in cui si desidera testare l'interazione acido - proteina nucleico. Quindi in questo momento stiamo esaminando l'interazione DNA - proteina per scoprire gli elementi promoter che possono essere coinvolti nell'interazione con un determinato fattore di trascrizione. Così, questi fattori di trascrizione mostrati nel colore blu sono favoriti nel reclutamento dell'RNA pol II al promotore, e sono fattori di trascrizione, quindi questi fattori sono elencati qui e denominati; questi sono lì per ogni gene. Si tratta di fattori di trascrizione core, e ci sono fattori di trascrizione specifici del gene che impareremo più avanti, e così come facciamo a verificare se un determinato fattore di trasposizione interagisce con un dato elemento di DNA o no? Quindi per testare che siamo noi usiamo questo esperimento chiamato gel shift assay o gel mobility shift assay o gel retardante Assago; ci sono più nomi per esso. Il termine più usato è la mobilità elettroforetica shift Assay o E M S A o EMSA. Quindi alcuni laboratori chiamano EMSA, o alcuni laboratori chiamano E M S A, alcuni laboratori non dicono nemmeno di dire spostamento di mobilità o di gel. Si tratta di una tecnica semplice. Quindi quello che state facendo è prendere una versione radiomobita mostrata qui in questo, qualunque colore che arriva su quella schermata qui per me sembra viola. Quindi prendete una versione radiomobilità del frammento di DNA che volete testare se interagisce con una determinata proteina. Poi si deve incubare il DNA con la proteina; può essere una proteina purificata, oppure è una linfa cellulare in cui la proteina può essere presente, quindi si è incubata con esso, e poi si corre su un gel. Se la proteina si lega a quel frammento di DNA, la dimensione complessa è più grande del singolo acido nucleico, quindi la mobilità è ridotta. Dal momento che nel gel lo si vede come un turno, un turno verso l'alto lo chiama come saggio di spostamento in gel di mobilità o dal momento che ritarda la mobilità dell'acido nucleico la chiami come assaggio di ritardamento di gel, quindi tutti quei nomi sono validi. Così è così che si vede. Quindi qui in questo caso particolare, Pax 6 è un fattore di trascrizione su cui ne vedremo altri. E senza che l'acido nucleico libero lo chiamiamo sonda libera, quindi sonda gratuita per un dato momento in una determinata condizione di gel, per esempio, gel pore dimensioni, ecc. Si muove una certa distanza, e quando si aggiunge il fattore di trascrizione che lega questo particolare frammento di DNA, la sua mobilità viene spostata; dato che è radiomobile, è possibile rilevarla tramite autoradiografia così si tratta di un esperimento molto versatile e molto utile. Nel nostro laboratorio lo usiamo principalmente per trovare proteine di legame RNA che interagiscono con 3 ' UTR e regolate la traduzione. Ecco allora il contesto in cui abbiamo usato, quindi è utile per l'interazione acido nucleico - proteina in diverse impostazioni. Così nella lane 3 si ha Pax6 aggiunto, quindi si sposta, e nella lane 4 si aggiunge anche Pax6; è un esperimento di controllo. Quindi l'interpretazione qui ha due spiegazioni alternative una forse è una proteina che vincolerebbe qualsiasi acido nucleico, non specificamente. Può non essere sequenzialmente specifico, per testare che quello che fai è aggiungere un eccesso molare significativo dello stesso frammento di acido nucleico ma senza radiolabeling. Quindi ora quello che accadrà dipende da quello che è l'eccesso molare; diciamo che ho un eccesso molare di 10 piega o un eccesso di molare di 100 piega, poi questa intensità scenderà qui sotto. Ce n' è uno solo perché è un cartone animato e ti mostra solo lo schema. Ma in un esperimento effettivo avremo 2-fold, 4-fold, 10-fold, 100 piega come serialmente aumentato lo stesso acido nucleico. Quindi che avrebbe anche una uguale tendenza a legarsi; è più simile ad un inibitore competitivo. Così ora hai la band lì, ma che non sta avendo la radioattività, quindi non la rilevi. Quindi poi un altro controllo che non viene mostrato qui è che si aggiungono simili molari di un numero simile di nucleotidi la stessa lunghezza dell'acido nucleico ma una sequenza non specifica. E che non competerà se si tratta di un legame specifico di sequenza, la stessa sequenza non etichettata metterà in competizione il radiolabel lì, ma una sequenza diversa non competerà. Quindi anche esso è in eccesso, questa proteina lo legerà ancora a quella particolare sequenza. (Riferirsi Slide Time: 15.41) Ok, quindi il prossimo è la DNase protection Assay, quindi questa foto se vedi, non stiamo più facendo il sequenziamento del DNA con questo metodo ma altrimenti supponiamo come quando ero studente questo è un gel di routine, quindi questo tipo di immagine vediamo ogni giorno se stiamo facendo il sequenziamento del DNA. Così in quei giorni non abbiamo fatto molto nella biologia dello sviluppo. Così questi esperimenti di biologia molecolare sono ciò che ha fatto la maggior parte delle persone, quindi è così che si fa il sequenziamento del DNA. Quindi hai oligo radiomobili per iniziare con, e in ogni reazione, hai dideossia di quel nucleotide, quindi avrai quattro corsie che esegui quattro corsie su un gel. E poi si guarda in quale lane si ha il frammento più piccolo, e da lì progressivamente si conta verso l'alto, ed è così che si ottiene la sequenza di DNA. Ecco, questo è un gel di sequenziamento del DNA, ma qui non si sequenziano il DNA stesso. Quindi, invece, il DNA viene incubato con una proteina che si lega ad una qualche regione del DNA, quindi questo è davvero grande frammento rispetto a quello che viene utilizzato nel test di cambio gel. Qui si cerca quindi di trovare quale sequenza nella sequenza più ampia del DNA, si lega alla proteina. Poi una volta che la proteina si lega al DNA, si aggiunge un nuclocazione, viene effettuato un trattamento di nuclocazione controllato. Così ora il frammento che è protetto dalla prima proteina legata al DNA, protegge quella sequenza e il resto si ripulisce. E quando si esegue un gel, dal momento che è controllata la digestione e si ha una digestione parziale per ogni lunghezza nucleotidica. Così, nella corsia di controllo, si vedono band per l'intera lunghezza perché in ogni luogo che potrebbe essere digerito. Ma se si guarda questa porzione in queste due corsie e poi qui, si vedono le fasce mancanti quando si aggiunge Pax6. Quindi, se si confronta le prime due corsie con la corsia di controllo che non ha pax-6, indicare che pax6 si lega a quella regione, principalmente si sta testando quale porzione di DNA è protetta dalla vostra proteina dalla cleavage di nuclocazione. Così, questo è fatto anche con la protezione RNAse per trovare parte dell'RNA dove RNA legante proteina legante. Quindi, si tratta di un assaggio di protezione DNAse, che si chiama anche assaggio di footprint perché è come un'impronta, l'impronta di proteina C. (Riferirsi Slide Time: 18.32) Così prima di entrare nella prossima serie di tecniche, analizzeremo una parte del gene che è un elemento normativo, non appartengono alla parte codificante del gene, e può essere ovunque in realtà non ha bisogno di essere sempre nella regione promoter, può essere a notevole distanza, può essere a valle anche del sito di iniziazione della trascrizione. Ecco allora quello che guarderemo, e si chiamano potenziatori. Allora, cosa sono i potenziatori? Il primo punto ti dice che controllano l'efficienza e la velocità di trascrizione. Quindi, possono aumentare la velocità, o in alcuni punti, specificano molto rigorosamente l'espressione spaziale o temporale di un gene, così che viene mostrato qui in questo. Nel cartone animato Pax6, queste barre o bande color arancione, sono gli esoni. Questo rosso è il promotore stesso, poi questo verde è il potenziatore e si vede potenziatore presente qui quattro frammenti o quattro parti, e uno di essi è in realtà in un introne. Quindi, 1, 2, 3, 4, 5, 5a, 6, 7, sono eson e tra quelli sono introni, quindi anche uno dei potenziatori fa parte di un introne. Quindi, tutti questi potenziatori, come ho accennato, controllano efficienza e velocità e a volte stringenti normative temporali e spaziali. E qui vediamo queste informazioni di regolazione spaziale, ad esempio, questo potenziometro tra eson 4 e 5 conferisce espressione di Pax6 nella retina e questo particolare eson qui poco prima dell'inizio della trascrizione è un potenziometro a tubo neurale che fa in modo che questa proteina sia espressa in tubi neurali. E l'altra lente e cornea, se non ce l'avete, non si esprimerà lì e l'altra il più a monte è il pancreas specifico. Così, ognuno di questi quattro ha quattro diverse espressioni specifiche di questo gene. Quindi, potresti avere il core promoter, il codice di trascrizione core tutto, ma non hai intenzione di avere una trascrizione, se non hai questi potenziatori e quei fattori di trascrizione specifici. Così, li vedremo uno per uno. Quindi, questa sequenza effettiva ti racconta in una parte di questa sequenza di potenziamento del pancreas dove si vedono siti di collegamento per due diversi fattori di trascrizione. (Riferimento Slide Time: 21.28) Così, un po' più di dettaglio su che vedremo in due slide più tardi. Ci sono molti modi con cui uno identifica i potenziatori, e una tecnica facile da capire e molto potente è la trappola del potenziamento. Quindi, implica avere un promotore di core che guida un gene reporter, tutto incorporato in un elemento traspirante. Quindi, questa tecnica è utile in un organismo in cui esistono elementi trasposabili endogeni naturali. Questi elementi salgono e saltano fuori a seconda del contesto, dove sono attivi o meno; a seconda di ciò si muoveranno intorno al genoma. E di solito, per gli elementi trasposati da inserire, hanno bisogno di sequenze ripetitive, e ovunque sia lì andranno. Quindi se si utilizzano gli elementi trasformabili come veicolo per portare questo reporter con il principale promoter, senza elementi normativi come nessun potenziatore o altro e se si fornisce il contesto in cui sono attivi elementi trasposati, per un determinato periodo e se lo si guarda troverete inserzioni diverse. Si tratta di una sorta di mutagenesia che utilizza elementi trasformabili, invece di qualche altro mutageno. Così, in un determinato organismo, l'elemento traspirante sarà presente in diverse parti del genoma. Se questo reporter trascrizionale viene inserito nelle vicinanze di un potenziatore come si vede in questa foto qui. Se questo potenziatore influenza l'espressione di questo reporter, questo viene espresso in cui un gene viene di solito espresso, e poi è possibile rilevarlo in questo modo nella foto. Questo è un embrione di drosophila nella foto, quindi dove si vede il modello di espressione. Così essenzialmente si sta intrappolando un potenziatore con l'aiuto di un gene reporter. Così, il gene reporter ha un debole promotore; ha solo il core di base, e non si esprimera da solo senza arrivare sotto l'influenza di potenziatore. Quindi, quando si fa l'inserzione casuale, se il reporter viene inserito nei pressi di un potenziatore, e se il reporter esprime dove quel potenziatore attiva la trascrizione di un gene, tipicamente, dimostra che questo potenziatore funziona in questo particolare tessuto. Così in seguito che può essere verificato anche con altri metodi, il gene reporter qui è LacZ. Così, questo è fatto in un'epoca molto prima che GFP fosse scoperto. Così che scoprirete per sequenziare la regione di flanking, non sarà difficile, ma il punto è che avete intrappolato un potenziatore. Dunque, l'obiettivo primario di nuovo sono questi processi di pensiero che arrivano dalla genetica; in genetica non si preoccupa della molecola. In primo luogo, si vede se si colpisce una molecola che si occupa di una funzione, poi si può cercare e trovare la molecola; che è molto più facile che avere una fibbia di molecole come lei può prendere qualsiasi organismo e schiacciarlo e mandarlo in un'azienda. E vi daranno tutte le proteine prodotte lì, tutto l'mRNA prodotto lì, ma che ne farete senza connessione alla funzione? Quindi, di solito chiamiamo così una grande lista lavanderia, ma non si sa cosa fare con esso, molte liste di questo tipo sono appese per gli ultimi 20 anni senza che le persone abbiano fatto progressi, questo non è un po' sminuito l'utilità di questo. Questo solo per evidenziare l'importanza di connettere direttamente il fenotipo perché è semplice fare un PCR inversa e sequenza la sequenza vicina. Dal momento che conosci la sequenza, così puoi digrignare con gli enzimi di restrizione, e alcuni potrebbero tagliare da qualche parte qui e lì. Sotto una condizione molto diluita, se la leggiate, si verificherà una legatura intramolecolare. Quindi, si farà circolare, poi si prende la sequenza che si sa poi si usano i primer andando nella direzione opposta, poi questi primer PCR amplificano la regione di flanking e infine si sequenza, e saprete dove si trova. Ecco come si identifica, ma l'obiettivo primario qui è quello di trovare, otterrò un'attivazione specifica dei tessuti? Quindi questo significa che sono nelle vicinanze di un potenziale potenziatore, quindi questo è l'obiettivo di questo. Così, questi sono stati fatti nella metà degli anni '80s a fine' 80s. (Fare Riferimento Slide Time: 26:25) Così il prossimo è la stessa cosa ma ti aiuta a determinare, come per esempio se conosci un potenziatore, e poi vuoi scoprire cosa sono tutti i diversi luoghi, dove quel potenziatore funziona, quindi puoi fare i giornalisti sotto il controllo del potenziatore e guardarlo. Quindi, questo è un metodo di assaggio più vecchio in cui è LacZ, e poi si vede la sua espressione per primariamente in voi conoscere il sistema nervoso centrale qui e l'espressione specifica muscolare. E qui, quello che state vedendo è il cristallina di cristallina di lenti, e si vede dove si esprime, quindi questa è l'immagine che mi piace particolarmente perché vi mostra chiaramente il controllo specifico dei tessuti. Quindi, ci sono molte cose di questo tipo ieri in laboratorio abbiamo avuto alcune immagini in cui il gene M GFP è espresso solo nei nuclei di una particolare serie di cellule lungo la lunghezza del verme. Così, il verme ha qualcosa chiamato seam, una struttura orizzontale che fornisce un rinforzo strutturale per il corpo. E questo è composto da 16 coppie di cellule, e questo particolare gene viene espresso solo in quelle 16 cellule; il resto delle 959 cellule sono tutte scure e solo queste sono verdi brillanti. Quindi, era troppo tardi, quindi non ho fatto una foto che potrebbe essere mostrata qui oggi. Quindi, ma questo sta facendo lo stesso lavoro quindi lo si vede solo nella lente non anche nel resto dell'occhio. Perché non si vuole cristallina espressa altrove, si vuole solo nella lente. Così ora, si sta ottenendo un'idea di ciò che è l'espressione del gene differenziale. (Riferimento Slide Time: 28:09) Così ora, lasciati vedere le applicazioni di potenziatore. Quindi, sono benefici in due contesti diversi. Andiamo a vedere due vari esempi. Uno di questi è, viene spesso usato nel topo dove si vuole avere un knockout condizionale. Diciamo che un gene ha un ruolo cruciale nella fase di cleavage dell'embrione, e se l'avete appena colpito e creato un allele nullo, allora sarà letale embrionale. Immaginate che il gene avesse una funzione nel fegato, e volete sapere specificamente cosa fa nel fegato; non lo saprete mai. Quindi, quindi, quando le persone vogliono trovare la funzione tessuto - specifica o organo - specifica di un gene, vogliono avere delle knockout condizionali, cioè la cancellazione condizionale. Knockout è un nuovo nome, in sostanza, quello che si dice è la cancellazione di un gene, questo è quello che i non genetisti inizialmente chiamavano knockout. Ora anche i genetisti la usano, poi alcune persone chiamano bussola e poi la gente dice knockdown, un impoverimento parziale che chiamano knockdown. Semplicemente non mi piace quella parola perché questo non trasmetta il senso; non dice ciò che depone. E similmente, bussano - nel significato di inserzione transgenica. Così ora stiamo guardando il knockout condizionale, cioè non lo stiamo cancellando al nucleo zigotico, stiamo per bussare a un particolare tessuto somatico. Allora come si fa? Come aiutano i potenziatori? Così ora si ha un solo ceppo di topo, dove si ha una ricombinazione batterica. Quindi, vi racconto un po' del batteriofage. Non sono sicuro quanti di voi abbiano imparato il ciclo di vita dei batteriofagi. Qualcuno ha imparato lambda phage lysogeny e i cicli litici? Cosa fa il batteriofage per il loro vivere? Come sopravvivono? Quindi, si integrano nella cellula ospite, e poi quando arrivano le condizioni favoribili, possono fare più copie e uscire dalla cellula ospite. Lo fanno usando la ricombinazione site-specific, e questo viene sfruttato qui perché se dico ricombinasi e se non sai cosa è ricombinasi allora non ha senso andare avanti. Quindi Cri è uno di questi ricombinasi, quindi si esprime quella proteina in questo particolare esempio sotto il controllo di un potenziatore per l'albumina. Quindi, si ha un ceppo di topo che ha Cre ricombinasi sotto l'albumina potenziatore come transgene. Così, sarà espresso solo nel fegato dove verrà prodotta l'albumina; solo lì verrà prodotta la ricombinazione Cre. Ora hai un altro ceppo di topo dove il tuo gene di interesse, per esempio, in questo caso, il fattore di trascrizione HNF4 alfa, il suo exon 2 è affiancato dalla sequenza riconosciuta dalla Cre ricombinasi. Ecco come funziona la ricombinazione site-specific. Quindi, il sito per la Cri si chiama batteriofage p1, e che si chiama siti di lossp. Così, i fianchi del sito di lossp exon 2, normalmente la gente lo chiama come flosso, affiancato da lox così flossato. Quindi, flox il gene di interesse questo exon 2 non verrà rimosso in quel ceppo ovunque perché non c'è ricombinazione generalmente nel topo che riconoscerà la lossp. Quindi questo sarà salutare, e semplicemente esprimere Cre ricombinasi nel fegato non provocherà alcun problema per quel ceppo perché funzionerà solo se c'è una lossp; altrimenti si sta producendo una proteina che non è tossica né avendo alcuna interferenza funzionale. Ma se incrociate questi due topi e generate un doppio mutante, il mouse che trasporta entrambi nel suo fegato, avrete entrambi gli elementi funzionali messi insieme. Avrete a disposizione Cre ricombinasi prodotta perché tutto il potenziatore di albumina lo fa esprimere solo nel fegato e da nessun' altra parte e anche voi dovete ricordare questo è il floxing germline. Così, in questo ceppo di topo, il genoma di tutte le cellule avrà questa sequenza. Conosciamo già l'equivalenza del genoma e questo non importa. Solo nel fegato in cui si ha la Cre ricombinare il sito di loxp sarà riconosciuto e lo tratterà come genoma batteriofilo e si aspetterà. E poi non avrete eson 2, quindi si tratta di un knockout condizionale. Quindi, ecco come le persone usano i potenziatori. Così ora in un club di riviste o un seminario, se qualcuno dice knockout condizionale e ho floxato questo gene, si capisce subito cos' è, quindi è fondamentale saperlo. (Riferimento Slide Time: 34:04) E il secondo è usato principalmente in Drosophila. Ancora, è avvincente e sono arrivati a questo per molto tempo fa. Solo recentemente la gente lo ha fatto con successo in C. elegans, probabilmente quando le persone non hanno trovato un contesto critico dove avevano bisogno o pigro per sviluppare uno strumento o qualunque cosa. Ma recentemente hanno dimostrato che funziona, ma a Drosophila questo è stato molto ben sfruttato e si sa che questo esempio è abbastanza buono per capire quanto sia potente. Ecco, questo è il sistema GAL4-UAS molto simile in linea di principio al precedente. Avrete due ceppi diversi; qui un ceppo è sotto il potenziatore di un disco immaginario particolare. Non so quanti di voi sanno cosa sia il disco imaginale, quindi il disco imaginale torna alla metamorfosi. Da quando Drosophila è un insetto, ha una fase di caterpillar da questo; la mosca esce, quindi c'è la metamorfosi. Così, in quella fase lombare, ha il primordio per tutte le fasi degli adulti, e queste primordia sono chiamate dischi immaginari. Quindi, l'ala primordia significa il disco imaginale ala, cioè le cellule primordiali che sono presenti nel caterpillar che alla fine si espanderanno nell'ala dell'adulto e quindi questi sono i dischi immaginari. Si utilizza quel potenziatore per controllare l'espressione di un fattore di trascrizione di lievito GAL4. Così GAL4 ha di nuovo una particolare sequenza breve che viene utilizzata per riconoscere e attivare la trascrizione. Quindi, hai quel fattore di trascrizione prodotto in un ceppo di Drosophila sotto questo potenziatore specifico del disco. Ora hai un altro ceppo dove hai il monte del tuo gene di interesse o il gene stesso è un transgene, ad esempio Pax6. Si sta prendendo dal sistema dei mammiferi e mettendolo qui, quindi si cerca di esprimere questo sotto il controllo del promoter dove GAL4 si lega. Così, questa si chiama sequenza di attivazione a monte, quindi UAS. Quindi, l'UAS qui è GAL4-UAS, e cioè per Pax6, e nell'altro, diciamo disco imaginale specifico per occhio. Così ora, quando si incrociano entrambi e si fa doppio mutante, si va a produrre proteina pax6, dove di solito, questo guiderà l'espressione GAL4. Così, in questo caso particolare, non è l'occhio; è un'altra struttura nel torace o nella regione della testa dove guidando pax-6, sono stati in grado di indurre la formazione dell'occhio al posto dell'antenna. Quindi, quello che ti dice qui è pax-6 agisce come un master regolatore dello sviluppo degli occhi. Quindi una volta fornito pax-6, allora sembra che tutto il resto sia già lì in quel particolare tessuto per guidare la formazione dell'occhio. Così, vedremo simile una formazione di organo così completa nel posto sbagliato in più esempi più tardi mentre passiamo. Un buon gruppo di geni chiamati i geni HOX o le mutazioni omeotiche dove si ha un organo sostituito da un altro organo semplicemente perché lì è cambiato il regolatore padronale. Quindi, ti dà versatilità come, ad esempio, posso avere questa linea, e incrociarla con un'altra linea dove è presente l'UAS per un altro gene. Ti dà quella flessibilità, quindi posso avere una libreria come un set di gene driver, e set di UAS, così come quello, posso avere, e poi portandoli insieme, posso attivare, quindi questo è il motivo principale. Nel precedente anche lui è lo stesso, quindi è perché vuoi sapere in quale disco imaginale; se io mi attivo pax-6, vedrò questo fenotipo o invece se esprimo pax-6 in diversi dischi imaginali cosa succede? Allora, volete sapere due cose qui; una è cosa fa questa proteina se si mette in un contesto biologico particolare? Un altro è quello che il disco imaginale può sviluppare che tipo di strutture. Diciamo, per esempio, di solito si forma antenna, ma può anche fare occhio se si fornisce un fattore di trascrizione specifico per gli occhi. Così, questo è stato ampiamente sfruttato dai biologi dello sviluppo di Drosophila che troverete molti documenti, difficilmente troverete un foglio dove non utilizzano questo metodo. (Riferimento Slide Time: 40:15) Ok, quindi questo finisce questo, ma non abbiamo finito. Abbiamo un'altra lezione che possiamo iniziare, che è una continuazione dello stesso, stiamo tornando alla stessa regione promoter pax-6. Quindi, aiuterebbe se te lo ricordassi, sto parlando del promotore pax-6. Quindi, dove l'espressione pax-6 e come è regolata è il focus. Quindi, stiamo osservando il suo potenziometro, e a sua volta Pax-6 è un fattore di trascrizione come bene, in modo da noi