Loading
Note di Apprendimento
Study Reminders
Support
Text Version

Caratterizzazione Funzionale del Gene

Set your study reminders

We will email you at these times to remind you to study.
  • Monday

    -

    7am

    +

    Tuesday

    -

    7am

    +

    Wednesday

    -

    7am

    +

    Thursday

    -

    7am

    +

    Friday

    -

    7am

    +

    Saturday

    -

    7am

    +

    Sunday

    -

    7am

    +

Benvenuti nel corso di Biologia Sviluppatia.Così, in classe precedente, stavamo discutendo degli approcci basati sulla genetica inversa, andammo già finito come analizzare o come monitorare lo schema di espressione genica. E poi ora in questa classe, andiamo a discutere di come caratterizzare funzionalmente il gene.Quindi, per caratterizzare funzionalmente un gene che significa che si vuole sapere qual è una funzione specifica di un gene in un particolare processo.Quindi, come lo saprete?Quindi, un approccio è sempre quello di sapere alcune funzioni è perdita - di - funzion.Quindi, se in qualche modo si interrompe il gene, e poi vedere che tipo di difetto di sviluppo si vede quando si fa una perdita di funzione di un gene. E questo dirà che per quale funzione è necessario il tuo gene.E poi un altro approccio complimentoso per validare o capire la funzionaria di un gene è il guadagno - di - funzion.Quindi, normalmente, supponiamo che un gene di sviluppo si esprima in un particolare tessuto, ma non è espresso in qualche altro tessuto. Poi se prendete questo gene ed ectopicamente esprimete nel tessuto dove non era presente normalmente, e poi potete guardare che il tessuto può riavviare qualche programma di sviluppo. E se è vero, allora possiamo dire che un gene particolare è sufficiente per una particolare funzion.Così, questi sono i due principali approcci che prendiamo per capire la funzione di un particolargene nello sviluppo .Così, ne prenderemo uno per one.Quindi, prima ci prenderemo loss-of-function.E qui ci sono due modi per farlo sia tu che fai da knock-out il gene o fai ko - down quello che in pratica fai di te stesso fai un mutante nullo. In knock-down stai riducendo l'espressione di un gene particolare, ma non è mutante nullo. E in guadagno - di - funzione o ci sono due modi per farlo, uno che ho raccontato è l'ectopic overexpression o ectopic espression.Quindi, si esprime questo gene, si cambia il promoter, si usa qualche promoter più ampio per esprimere questo gene in un tessuto dove normalmente non è espresso, e secondo metodo di isattivazione che vedremo in seguito on.Così, prima prenderemo la perdita - di - funzione di come generare knock - outs.Quindi, se si considerano i primi due approcci, questo abbiamo già e discusso i primi approcci genetici in avanti che è quello di generare inattivazionamenti inattivabili per un particolare gene.Quindi, uno era l'inserzione a T - DNA, secondo è stato l'inserzione mediata da trasposone. Ma la differenza tra la genetica in avanti e la genetica inversa è che nella genetica in avanti non stavamo aggiustando il gene, stavamo fissando il funzione o se stavamo fissando il fenotipo se stavamo fissando il processo biologico, e poi stiamo cercando di cercare le linee di inserzionismo T-DNA o di recepire le linee di inserimento e poi provare a mappare quella che gene it è. Ma per nella genetica inversa, quello che facciamo ora conosciamo un gene specifico ora sappiamo che questo è il gene e voglio capire qual è la sua funzione biologica, allora si può andare appositamente per e cercare quel gene è presente alcune linee di inserzione T-DNA disponibili per quel gene o linee di trasposon disponibili per quel gene o no. Un altro e ormai molto diffuso metodo è il genoma editing.Quindi, qui si sono sostanzialmente editing a livello di genoma il gene, e poi si è generatingknock - out o loss - of - function mutants.So, prima prenderemo la lines.inattivazione inserzione.Così, come ho detto che le inizialmente persone hanno fatto a livello molto globale, hanno generateda grandi linee di inserimento di T-DNA o linee di inserimento di trasposon, e quei lineshas sono stati depositati ad esempio già tante banche dati o così tanti laboratori hanno generato un gran numero di linee di inserzione T-DNA o inserzionisti di trasposon. E questo tutti i mutanti sono stati conservata e protetta. E quello che puoi fare è possibile scegliere qualsiasi tipo di mutante, puoi richiedere, puoi ordinare, e riceverai direttamente quei mutanti per il tuo dettagliato analysis.So, ci sono molti numerosi di questo tipo di raccolta di mutanti sono disponibili.Così, per esempio, questo T-DNA express o questo è un Istituto Salk hanno generato largenumber di linea di inserzione T-DNA. Quello che semplicemente devi fare questo sito web è disponibile, basta scegliere il tuo gene, inserire il gene ID, cercare con il gene, cercare con il cromosoma, cercare con le alcune qualsiasi cosa, e poi mostreranno un elenco delle linee di inserimento disponibili per quel gene particolare, e potrete scegliere. Sometime cosa succede che potreste avere più righe di inserimento nel vostro gene. E poi potete cercare di definire dove volete avere l'inserzione, ad esempio, se guardate questo gene potete avere così tanti inserimenti potete scegliere che un inserzionista in exon 1, voglio una riga di inserimento in exon 2.And poi basta prendere questi numeri e richiedere dal database, e questi semi i semi di mutantArabidopsis saranno disponibili per voi, e poi potrete ottenere questo mutante o bussola - dintorni per la tua caratterizzazione funzionale dettagliata. E la prima cosa che si fa, se si ottiene questo tipo di linea di inserimento, si stabilisce che in realtà c'è l'inserzione prima cosa. La seconda cosa è che quello che è lo schema genetico è che l'inserzione è omozigosa, sia gli alleleschi che siano eterozigoti solo un alleli è dirompente. Come si può fare?Questo è molto facile da quando si conosce il sito di inserimento previsto di inserzione, si conosce la sequenza di T-DNA, si conosce il tuo gene id che conosci essenzialmente la sequenzadel tuo gene, puoi progettare un primer in avanti qui, un primer inverso qui e un primerte può progettare nel T-DNA e poi puoi fare un po' di PCR.Se ci si fa con questo DNA genomico in avanti e inverso, se c'è l'inserzione, la riga di inserimento non lo darà perché la dimensione del frammento è molto grande, non otterrete l'amplificazione.Così, se hai una linea omozigote, in linea omozigote è in sostanza la tua locushas genomico l'inserzione. Poi se usate LP e RP insieme non otterrete una banda qui. Ma se è tipo selvaggio o eterozigote, in heterozygous one locus ha l'inserzione. Poi dal locus in cui non si ha l'inserimento otterrete questo band.Quindi, fondamentalmente il vostro tipo selvatico e eterozigote entrambi daranno banda con il LP e RP Poi scegliete il vostro LP con questo o RP con questo a seconda di quale orientamento yourT - DNA avrete, e poi se avete un tipo di eterozigote qui avrete una sorta di banda. E poi se è di tipo selvaggio, non avrete questo tipo di T-DNA specifico band.So, questo è molto importante per te stabilire che cos' è lo stato di inserimento di thisT - DNA nel tuo gene. Poi un'altra cosa importante quello che cerchiamo di fare è che siamo sempre tornati incrociati perché questi è stato generato attraverso un inserzione casuale, c'è una possibilità che nell'interno della tua pianta ci siano più siti di inserzione di T-DNA, potresti avere un inserzione nel tuo gene, ma ci potrebbero essere altre inserzioni in altri geni. E che puoi rimuovere prendendo queste linee che attraversano con il tipo selvaggio e poi gocce alla generazione F2 e di nuovo schermo per homozygous. E poi una volta che hai ha stabilito questa linea, è possibile prendere queste righe per una dettagliata caratterizzazione funzionale o studiare il difetto di sviluppo in questo metodo T-DNA o loss-of-functionalanalysis.Un altro metodo che è il genoma editing.Quindi, nell'editing del genoma, ci sono molte tecniche disponibili che potete usare per modificare il genomeZFN, poi TALEN, ma recentemente CRISPR Cas 9 è stato utilizzato molto ampiamente e molto estensivelytal giorno.Così, vedremo come questo viene utilizzato per modificare il gene.Quindi, sostanzialmente cos' è questo CRISPR Cas 9 based genome editing tool.Quindi, ecco cosa stiamo usando?Siamo dell'endonucleasi batterista che è l'RNA guidato endonucleasi che è Cas 9.So, e poi si fa semplicemente che si produce una guida RNA e si produce Cas 9 proteinina la pianta. Questa guida RNA si può indiriare alla tua sequenza ovunque tu want.Quindi, puoi progettare una guida molto mirata RNA.E poi qui quando esprimi guida RNA insieme alla proteina Cas 9, quindi potrebbe essere che sia chiaro qui di seguito che questo è il tuo gene e vuoi modificare questo gene, tu che vuoi modificare questo gene, quello che puoi fare puoi, puoi scegliere una sequenza bersaglio typicallyqui. E c'è un requisito che è chiamato PAM sequence.Così, puoi puntare la tua regione che è vicina alla sequenza PAM, e puoi generateguide RNA che è specifica per questa sequenza. E poi clonate questa guida RNA in un vettore e lo stesso vettore potete clonare Cas 9 andthe endonucleasing. E poi quando prenderete questo e farne un impianto transgenico entrambi i partner vi supereranno. Poi ciò che accadrà sarà una guida RNA, questa è la proteina Cas 9, quando Cas 9 proteinwill si unirà con la guida RNA, guida RNA raggiungerà questa endonucleasi nel modo sequenziato. E quando questa endonucleasi viene reclutata sul genomico copia, effettuerà una doppia strandedbreak nella copia genomica, e poi che questa rottura è stata considerata come un meccanismo endogeno danneggiato e che si chiama non omologo meccanismo di congiunzione sarà attivatednello stabilimento e riempirà questo gap, si riparerà qui. Ma durante il processo di questo è il meccanismo di congiunzione è possibile che si possa generare una cancellazione, si può generare un inserimento, è possibile interrompere la codifica della regione di codifica, ed è così che si avrà una perturbazione genomica di un particolare gene.So, questo è alcuni dei metodi utilizzati per effettuare il knock-out linee. Un altro meccanismo quello che stiamo usando per studiare la perdita - di - funzione è knock-down o downregolation.Quindi, qui non stiamo dirompendo la copia genomica, ma stiamo regolando il livello di espressione sia a livello proteico che a livello di trascrizione. E ci sono alcune delle tecniche che vengono utilizzate per questa funzione; una è la tecnologia RNA - sense RNA, questa è stata una delle tecniche pionieristiche che sono state usate, ma in questi giorni ci sono molte più techniques.Quindi, il secondo metodo è l'interferenza dell'RNA a doppio strato o la micro RNA.So artificiale in anti - senso RNA cosa succede che se hai un gene e conosci la sequenza genica, basta prendere lo stesso gene o il frammento specifico del gene e clone nell'anti-senseorientation.Poi cosa ti aspetta .Poi, se si tratta di una copia genomica del tuo gene, ti trascriverò in questa direzione, ma ora hai generato un'altra trascrizione che si complimenta con questo endogenoustranscript perché è orientata all'antisenso e poi questa trascrizione andrà e si legherà con la trascrizione endogena, e poi questa trascrizione sarà degradedoria che sarà inibita per la sintesi proteica e avrete il fenotipo. Questo è un esempio che ci sono pochi geni sono stati bersagliati attraverso l'RNA anti - senso, si può vedere, questo è il promotore e i geni sono stati clonati nell'orientamento anti - senso. E quando si è guidati da questi geni si può sostanzialmente sopprimere il gene endogeno usando questo metodo come si può vedere il fenotipo. Questo è il controllo, quando i geni sono stati soppressi, ci sono molti difetti di sviluppo. E quando si controlla il livello di RNA o il livello di trascrizione, si può vedere chiaramente che come comparati ai controlli in queste linee antisenso, c'è è una riduzione significativa del livello di trascrizione. Ma ci sono qualcosa di importante se si guarda questa linea, qui almostdown regolato, ma queste righe sono parziali regolation.Quindi, questo non è una sorta di regolazione.Così, si può avere qui un gradiente o si possono avere delle linee in cui si è vicini al fenotipo del thenull, ma alcune linee che si potrebbero avere linee deboli, lì la regolazione.it non è così efficiente. Secondo metodo che viene utilizzato per la regolazione in giù è doppia l'interferencetechnologia a doppio strato.Questa tecnologia è stata sviluppata a partire dal meccanisms.Quindi, nelle piante siRNA e micro RNA sono noti come un meccanismo wellnormativo. C'è un gran numero di piccoli RNA, e stanno regolando l'espressione di molti manyimportanti gene.Quindi, se si guarda un meccanismo generale, ci sono due vie che si hanno un doppio strandedRNA o un hairpin RNA, questo si sottoporrà al processo di elaborazione tramite DICER o AGOmediated processing, quindi non andrò nel dettaglio; sono sicuro che avrebbe già studiato. E poi genera un piccolissimo standard da 21 a 24 nucleotide antisenso RNAs.E questi RNA possono andare a coppia con l'RNA messaggero endogeno, e poi saranno targetche RNA messaggero per la degradazione o possono inibire la sintesi proteica o possono fare una regolazione epigenetica qualsiasi tipo di regolazione è possibile. Quindi, per farlo, se vuoi usare questa tecnologia, quindi quello che puoi fare è possibile generare il tuo costrutto di interferenza dell'ownRNA per un gene specificato. Cosa devi fare?Devi semplicemente mimare questa generazione di hairpin, come puoi fare, puoi fare da te puoi fare un frammento specifico del gene takea e clonare in senso orientamento, e poi mettere qui qualche sequenza non - specificità qui o stuffer frammenti qui, frammento di linker e poi prendi lo stesso il sameframmento e il clone a valle, ma in orientamento opposto. Se questo è nell'orientamento di senso, questo ti metti nell'orientamento antisenso e promoter puta qui, guidate questo loop pin. Poi cosa accadrà?Questo RNA messaggero che lo farà realizzerà un questo tipo di structure.Così, questa regione e questa regione abbineranno qui. E genererà una struttura per capelli, e questo sarà dotato di un trattamento endogeno che poi genererà siRNA.E questo siRNA specificherà specificamente l'RNA endogeno o l'RNA messaggero contro il quale è stato progettato, e poi abbasserà la regolazione dell'espressione di quei geni. Ci sono abbondanti esempi di interferenze RNA sono state usate per la regolazione del gene. Alcune di esse mostrerò qui di seguito. Dunque, se guardate qui due dei geni sono stati abbassati regolati dall'interferenza RNA. Potete guardare qui questo è il blot settentrionale nel controllo c'è alto livello di espressione, ma nella linea di interferenza dell'RNA il livello è notevolmente diminuito. E si può vedere il fenotipo panicolare fenope.Analogamente, questo è un molto importante fattore di trascrizione MADS 1.And quando la linea di interferenza dell'RNA è stata generata per MADS1 è possibile vedere questo è il blotagain settentrionale. In tipo selvaggio, si ha un livello di espressione molto alto, ma nella linea di interferenza RNA è quasi nullo. considerando che è possibile rilevare la struttura dei pin per capelli sostanzialmente più grande delle dimensioni. Non solo che se si va e si fa un blot settentrionale molto spaziale, si possono rilevare piccoli siRNAsas well.Quindi, questi sono i piccoli siRNAs che non sono presenti nel tipo selvaggio, ma che è presentante l'interferenza dell'RNA, questo è stato molto utilizzato fino a fondo regolano molti dei geni. Poi terzo metodo che viene usato per realizzare mutanti a base di knock-down sono microRNA.So, come ho detto il micro RNA è un piccolo RNA naturale presente nel genoma delle piante, i teysono elaborati attraverso il meccanismo dicer e fa mutato. E poi questo micro RNA, stanno andando e puntando specificatamente alcuni geni, e regolando la sua espressione a diverso livello, trascrizionalmente, post trascriptativamente, tradenzialmente, epigeneticamente.E poi questa tecnica è stata presa e poi utilizzata per generare qualche micro RNA.So artificiale, in sostanza quello che si fa se si prende una struttura naturale per capelli o il loop del micro RNA naturalmente esistente, e se si può sostituire questo core sequenze di microRNA che sta praticamente mostrando la complementarietà con il gene. E se si può sostituire con il proprio gene di interesse. E poi questo può essere facilmente fatto tramite combinazione di più PCR.Quindi, se questo è il vostro costrutto qui potete utilizzare alcune diverse serie di primersi possono amplificare questa regione da qui a qui, quindi potete amplificare questa regione da qui di qui, e potrete amplificare questa regione da qui a qui a qui. In sostanza questo rosso è la vostra sequenza di micro RNA artificiale. Poi se usate questi tre come modello insieme e usate questi due primer, così potrete combinarli in questo modo.E poi questo micro RNA artificiale, si può clonare sotto promoter e poi generare una qualche linea di knockout. E se vedete qui questo è stato abbastanza utilizzato in alcuni dello studio.Ad esempio, se si prende questo esempio di Arabidopsis, in Arabidopsis, si tratta di leafymutanti, quindi questo è fondamentalmente inserzione.Quindi, se si guarda LEAFY12, questo ha un fenotipo significativo rispetto al tipo selvatico. Ma se si ha l'obiettivo di questo LEAFY attraverso il micro RNA artificiale contro il LEAFY, si può mimicare il fenotipo artificiale qui è forte come gli altri mutanti. Similare è il caso se si guarda a ft mutant.Quindi, il ft mutant, se si guarda il tipo selvatico, l'impianto è già flowered ha raggiunto la fase riproduttiva mentre, questo mutante di ft ha molto ritardato. Ma se si generare di nuovo micro RNA artificiale contro il FT, potete vedere che sta ingrandendolo un grave fenotipo come l'altro mutant.Così, questo racconta che il micro RNA artificiale è uno dei modi molto efficienti di down regolategenes in Arabidopsis.E simili cose sono state usate in altre specie vegetali. Ad esempio, ecco che il micro RNA artificiale è stato generato per coppia di genes.Così, questo è SPL11, e questo è il gene PDS. E questo è il controllo e questo è l'RNA o la micro RNAlina artificiale e si può vedere fenotipo chiaro in micro RNA artificiale lines.Quindi, sostanzialmente; così attraverso questo studio si passa attraverso lo studio basato su knock-out attraverso lo studio basato su knock-down.Ciò che si conclude che si può generare un mutante di perdita funzionale e si conclude che questi geni sono necessari per questa particolare funzione. Un altro modo complimentoso come ho detto che è guadagno - di - funzion.Quindi, in primo luogo che possiamo generare ectopic su espressione o espressione di espressione ectop.Qui si usa qualche promoter più ampio o un promoter che si esprime a livello di alto livello. E puoi usare o promotore specifico del tessuto per il tessuto in cui il tuo gene endogenouslynon esprime o puoi usare una sorta di promotore generale 35S o di Ubiquitin promotore del tuo gene nel senso orientamento. E poi puoi avere alto livello di espressione nel tessuto dove non ti aspetti il tuo gene endogensamente presente. E se guardi i casi in questo mutante, puoi chiaramente vedere che questo è il tuo basallivello di espressione, ma quando hai più volte espresso sotto 35S promoter, puoi verificare che nella maggior parte delle linee il livello di espressione sia molto alto rispetto al controllo. E puoi vedere qui l'espressione relativa e poi questo è co correlato con il fenotipo. Questo è e poi se puoi andare alla generazione successiva, puoi vedere chiaramente la tisis una della linea è stata sperimentata nella generazione successiva, quindi potrebbe essere qui la linesis segregating. Se si guarda questa pianta, non si sta mostrando fenotipo, ma queste due piante si fanno la vetrina del fenotipo. E se si va a controllare il livello di espressione, è chiaramente co relate.Quindi, questa pianta che non sta avendo fenotipo non mostra anche l'espressione eccessiva. Ma queste due piante che mostrano l'espressione sovrastante, mostrano il fenotipo. È stato fatto un tipo di analisi simile per il fattore di trascrizione MADS1.And è possibile vedere chiaramente quando MADS1 è stato ectopicamente sopra espresso in riso transgenico, si canta un fenotipo molto significativo nell'architettura del panicone e al sviluppo spikelet. E se vedete il livello di espressione, potete chiaramente vedere che nel controllo si fa l'espressione notturna in questo tessuto, ma queste linee hanno un livello di espression.Così, un altro modo per generare un mutante di guadagno è l'attivazione dell'attivazione. In attivazione tagging praticamente quello che si fa per il costrutto T - DNA, e si può prendere solo 4 x copia dell'elemento potenziatore 35S. E poi si butta casualmente nel genoma e si andrà ad integrarsi, ma quello che è successo se si arriva in una vicinanza con alcuni promoter basali o alcuni dei tepromoter che normalmente si esprimono al livello molto basso o normalmente non è espresso. Ma ora il promotore ha preso parte dell'elemento potenziatore nella stretta vicinanza e poi il thepromoter inizierà l'attività che avrà inizio molto forte. E in quel caso, quello che accadrà si vedrà un fenotipo che potrebbe essere becausedel guadagno di funzione fenotipo. Questi sono alcuni degli esample.Quindi, se si guarda qui, c'è un inserimento di elementi miglioratori qui. E se si guarda il risultato di questo è che se si guarda questo gene, questo gene è più espressednelle linee di inserimento delle linee che control.Quindi, se si guarda qui, e poi si può vedere questo ci sono alcuni fenotipo di thisline.Quindi, in sostanza questo si chiama potenziometro tagging, si possono cercare molti più geni e identificano linee di marcatura di attivazione e potete prenderli per lo studio della funzione .Quindi, questo è un modo tipico per studiare il gene in pianta, ma c'è qualche problema.Quindi, supponiamo che se si desidera studiare funzione di alcuni dei geni essenziali, le whathappens, se si fa un knock-down, se gene è essenziale youface è un problema di letalità.Se è letale, se la perdita di funzione è letale o il guadagno - di - funzione è letale, noterete la pianta transgenica o non avrete una pianta da studiare.In quel caso, come risolvere la questione?Alcuni geni sono molto importanti in fase molto precoce durante lo sviluppo embrionale .Così, potrebbero essere letali embrionali alcuni del gene potrebbero non essere letali embrionali, ma potrebbero essere letali allo stadio di seedling o in qualsiasi fase completano la loro vegetativegrocrescita, ma non possono entrare nell'asfalto riproduttivo, ma in sostanza non faranno dei fiori fertili, non faranno semi che meansche non si può andare alla generazione.Così, se si vuole studiare una tale tipologia di geni attraverso l'approssimazione genetica inversa. In quel caso, quello che devi fare devi usare un gene regolato espressione based approcaches.Così, non si può prendere un gene o si può scendere regolando tutto il tempo o si può scendere regolateconstitutivamente o si può sovraintendere costitutivamente.Se lo fai, non sarai in grado di studiare.Poi quello che puoi fare, puoi generare un costrutto o puoi realizzare una strategia in cui puoi specificatamente regolamentare un gene ogni volta che vuoi o puoi avere una sorta di base di base più temporale e spaziale del tuo gene silenziatore o sovraespression.Così, ci sono tre modi in cui si può regolamentare il gene tipicamente uno è il regolatedcostrut.Quindi, quello che si può fare che invece di esprimere un gene in tutti i tessuti, si intende sovraespressione in un po' di tessuto in cui si sente che potrebbe non essere così dannoso che possa avere la letalità.Per questo tipo di cose è possibile utilizzare alcuni promotori specifici del tessuto o note promoter whichis espresse in un particolare organo, ad esempio si può verificare nella foglia e si può usare un promotore specifico a foglia e esprimere un fiore nella foglia e guardare può startalcune dello specifico programma di sviluppo della foglia. Secondo modo di regolazione quello che si può fare è il costrutto della regolazione temporale. Qui quello che si può fare è il costrutto di esprimere o giù regolato un gene in un particolare stagenot prima di quello. Per esempio, supponiamo che la regolazione di un gene X sia embrionale letale, che mescola se giù regolamentare dal giorno una anche l'embriogenesi non si completerà, poi non si avrà una pianta. In quel caso, quello che si può fare, e se si vuole studiare il ruolo di questo gene maybenello sviluppo vegetativo o magari nello sviluppo riproduttivo, allora non si ha bisogno di abbassare la regolazione o il silenzio o di esprimere questo gene durante il processo di embrione, in quel caso si può fare un qualche promotore specifico per driveil costrutto il costrutto RNAi o qualsiasi costrutto. E poi quello che si può fare è possibile saltare la fase iniziale dell'embrogensis.Così, si verificherà l'embriogenesi normalmente poi in seguito su di te basta regolarsi e vedere whatis la conseguenza. Secondo è che si può addirittura combinare entrambi e si può generare un costrutto dove si fa sia insieme. Così, si può regolamentare un gene o un costrutto sull'espressione, RNAi costruiscono temporalmente bene come spazialmente.Come si può fare?Ci prenderemo solo un esempio di entrambi i casi. Ad esempio, se si sta studiando un fattore di trascrizione, c'è un sistema che viene molto utilizzato è un sistema a base di recettori a base di glucocorticoidi, sappiamo che i fattori di trascrizione, devono entrare all'interno del nucleo per attivarli nell'espressione genica. E se in qualche modo li conservi nel nucleo e se riesci a regolarli nel nucleo e se puoi regolamentare la loro traslocazione tra citoplasmo e nucleo, è possibile regolamentare la loro attività e che si sta facendo fusingendo il tuo fattore di trascrizione con un recettori.Quindi, il glucocorticoide è sostanzialmente uno steroide ormone negli animali e cosa è successo che i recettori dei glucocorticoidi sono normalmente presenti nel citoplasmo, quando ricevono il segnale attraverso gli ormoni, poi quello che è successo che solo allora entrano all'interno del nucleuse vanno ad attivare il loro genes.Quindi, se prendo un gene MADS1; se prendo il gene MADS1 e il sovraespresso sotto qualsiasi ampio promotore non importa qui, 35S promoter. Poi cosa accadrà in condizioni normali, ho un alto livello di MADS1 espresso, proteinis già fatta proteina di fusione, MADS1 delta GR, la proteina di fusione è già fatta pronto, ma è presente solo nel citoplasm.Da, MADS1 è un fattore di trascrizione fino a quando e a meno che non entrerà all'interno del nucleo, non può eseguire la funzione. Poi se prendo questa pianta e indurrà con ormone che utilizziamo qui il desametasone, allora ciò che accadrà entrerà nel nucleo e può attivare il gene. E questa è una tecnica molto importante, che si può usare anche per distinguere le direzioni che sono regolate direttamente dal MADS1 o dal gene che sono conseguenza della MADS1 indtion.Quindi, se si combina questo trattamento con desametasone con la sintesi proteica inibitori cicloesimide.Quindi, supponiamo se questo è esempio di OsMGH3; OsMGH3 come ho detto in precedenza che questo è oneof the gene che è regolato da MADS1.And cosa succede, quando si tratta con il desametasone si può vedere in un punto particolarizzato il livello di espressione di OsMGH3 è sufficiente attivare l'espressione di OsMGH3.But quando si tratta con il cicloesimide, quindi sostanzialmente la cicloesimide è una proteina sintetizzopospos.Così, non permetterà di sintetizzare nuove proteine, in quel caso qualunque proteina MADS1 sia la proteina delta GR già fatta, solo che entreranno all'interno del nucleo e attiverà i geni immediati, ma quei geni che si stanno attivando a livello di trascrizione quegli RNA non faranno proteine, perché c'è la proteina del cicloesimide. E se la proteina non verrà attivata, ci sarà l'obiettivo indiretto non sarà attivato, ma l'obiettivo diretto MADS1 sarà attivabile e questo è quanto si può vedere qui, quando tratteremo desametasone e cicloesimide insieme non si può vedere l'attivazione di OsMGH3.This che OsMGH3 non è direttamente regolato da MADS1, ma è indirettamente regolamentato byMADS.E poi se si guarda questo costrutto, questo è un altro costruttore molto importante - Così, questo è un caso quando si scende a regolamentare il gene MADS1 quello che succede è che tutti gli organi floreali sono difettosi, non si farà un seme fertile. Si può vedere qui questo sono gli organi floreali, tutti si stanno trasformandosi in foglia likestructura o tipo di lemma palea come struttura e non avrete organ.Quindi, è molto impegnativo per la prossima generazione è quasi impossibile. In quel caso cosa si può fare?Puoi fare una fusione MADS1 delta GR così come quella artificiale micro RNA.E poi quello che fai, normalmente questo micro RNA artificiale sopprimerà il gene che hai il fenotipo, ma se crescerai in presenza di desametasone questo delta GR andrà ad andit completerà il fenotipo. Questo costrutto ha superato l'espressione come il micro RNA artificiale, ma importantare qui è che questo micro RNA artificiale è progettato per colpire 3 prime untranslatedregion del MADS1 e che 3 prime non tradite non è presente qui. Qui abbiamo preso MADS1, scusate qui abbiamo preso MADS1 solo fino al codone di stop, untranslatedregion non è presente perché, se prendiamo quella regione, allora questo micro RNA artificiale willgo e silenzierà questo gene come well.Quindi, in questo costrutto questo micro RNA metterà specificamente a tacere la copia endogena del gene, ma non mettera ' a tacere la copia transgenica e in questo modo potrai usare un assaggio a base di complemento e fare quello che, analisi fenotipica o puoi andare anche a identificare l'obiettivo downstreamtarget, diretto a valle per studiare.Potete vedere qui, quando si indurrà con la proteina di desametasone si sta localizzando al nucleo, ma quando non si indurrà si vede la proteina all'interno del nucleo. Un altro modo molto importante, tecnica che viene utilizzato per regolamentare sia l'espressione temporale come espressione spaziale, sia il sistema delle basi XVE o il recettore estrogeno - basedsystem.Quindi, qui praticamente quello che è stato done.Quindi, questo XVE è un fattore chimerictrascrizionale, qui ci sono tre componenti uno è X, V ed E. X è un dominio - vincolante del DNA della proteina LexA, LexA è di i batteri. E poi V è dominio di attivazione della proteina VP16 che viene dal virus. E poi E è il recettore degli estrogeni umani.