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Modello Espressione Differenziale

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Bentornati al corso di, Plant Developmental Biology.Così, nell'ultima classe che stavamo discutendo, approcci basati sulla genetica inversa, che siamo noi stessi, che stiamo portando avanti, per studiare lo sviluppo.Così, in quella classe abbiamo coperto l'identificazione e l'isolamento dei geni per le funzione.Ora, abbiamo iniziato l'approccio basato su approcci genomici funzionali, quello che abbiamo discusso del primo passo è stato il monitoraggio dell'espressione genica. E ora, così abbiamo visto come verificare il modello di espressione dei singoli genes.Now, ci concentreremo prevalentemente sui geni globali. Come studiare il modello di espressione dei geni globali?E qual è il modo in cui studiare il modello di espressione?La cosa importante qui è che, si può nuovamente aggiustare il problem.Quindi, l'obiettivo principale di un'analisi di espressione genomica o globale di espressione genica è, per identificare i geni differenziali in diverse condizioni. Può essere di diversi organi, può essere di diversi tessuti, può essere diverso, può essere diverso, può essere diverso, tra un tipo selvatico e mutanti qualsiasi combinazione. Qualunque sia possibile scegliere rispetto allo sviluppo e poi identificare tutti i geni che sono differentemente espressi in betweentwo condizioni due organi o qualunque cosa. E ci sono molti modi per studiare un gene differenziale espression.Così, elencherò alcuni di loro qui, ma ci concentreremo solo su few.Quindi, questi erano il modo di studiare.Prima era l'analisi seriale dell'espressione genica, la gente SAGE.Here ha iniziato ottenendo alcuni brevi tag di sequenza da un gran numero di cDNAclones.E loro, poi, lo stavano sequenziando e identificando il gene differenziale espressionpattern. Poi un altro modo era il display differenziale RT PCR, qui quello che le persone usavano, teyused per prendere una due popolazione di RNA totale, si usavano per fare cDNA.Hanno usato un gel per poi cercare di identificare quale banda particolare manca in un condizionatore e presente in un'altra condizione o viceversa. E poi hanno usato per tagliare quella banda, amplificando il frammento, il clone, la sequenza e l'identifycosa sono i geni. Un altro modo di fare era l'ibridazione subtrattiva, questa era l'amplificazione basata su PCR di solo cDNAframmento che differiva tra due condizioni. C'erano due abitanti dell'RNA messaggero, si fa cDNA poi si fa la sottrazione, si identifica o si isolano solo quelle popolazioni che sono differenziati e poi specificatamente si possono amplificarli e poi identificarli. Poi la tecnica, questa tecnica è stata molto ampiamente utilizzata nella maggior parte della genomica basedexpressione, schema di espressione differenziale, analisi che era microarray.Microarray era la tecnica, dove piccoli frammenti o piccoli oligo singoli oligostati sono stati avvistati su un chip e poi l'RNA totale forse è stato, isolato da una particolarieta ' per identificare l'espressione differenziale. Vediamo micro RNA microarray in grande dettaglio, come questo è stato usato. E questa è una delle tecnologie più utilizzate nella biologia dello sviluppo vegetale.E ora di recente il sequenziamento di prossima generazione ha, in realtà, cambiato l'intero scenario. Ora stiamo facendo molto sequenziamento di RNA e questo ha molti benefici sul microarray.Ecco, questi sono i diversi metodi che vengono utilizzati per studiare il modello di espressione differenziata in diverse condizioni o differenti processi.Quindi, prima di andare al micro RNA e al sequenziamento di RNA nel dettaglio, darei alcuni esempi tipici di diverse tecnologie, che è stato usato. Ad esempio, questa ricerca qui la profilazione trascrizione è stata fatta inriso usando SAGE come metod.Quindi questo è stato usato e le persone hanno identificato l'espressione differenziale qui. Poi questo è un esempio, dove il display differenziale RT PCR è stato done.Così, questo è Scatola MADS contenente fattore di trascrizione nel riso. E ciò che era importante qui che, questo gene che è la MADS 1, è stato espresso in sepalequivalente. Che in caso di riso, è lemma e palea, ma non è stato espresso nell'organo interno. Ma quando il gene è stato mutato, quando questo gene è stato silenziato, l'effetto è stato visto anche negli organi interni, organi floreali interni per esempio, lodiculi, stamens. Poi questa era la domanda che, se il gene non è presente in questo tessuto come si sta regolando?Allora, una delle possibilità era che, forse si sta attivando perché in fase molto precoce, è stato espresso in tutta la primordia.Così, è stato ipotizzato che forse, si sta attivando alcuni regolatori precoci in altissima fase, la cui espressione è praticamente lì negli organi floreali interni e la regolano. Per identificare tale tipo di gene è stato ripreso il display RT PCR e poi uno di tali geni è stato identificato che in realtà OsMGH3.And è stato espresso che in realtà OsMGH3 è stato espresso in floreale, interno floreale, questo è di nuovo se si guarda, questo è il blot settentrionale e se si guarda la espressione schematidi OsMGH3, si può vedere che in natura selvatica, la guaina in foglia non è espressa mentre, inparte giovane panicella, è la panicola in caso di riso, ha un'espressività altissima. Ma se si guarda un panicone che è un panicone mutante, dove MADS1 è in calo, anche l'espressione di OsMGH3 scompare. Il che significa che prima cosa c'è un organo specifico o tessuto specifico di questo gene. Il gene è espresso solo nel panicone, non nella guaina della foglia ed è espressiono è l'attivazione dipende dal MADS1.So, questo è un esempio di display differenziale RT PCR.Poi l'ibridazione subtractiva è stata utilizzata in questo studio.Dove hanno fatto un profiling di trascrizione comparativa dell'espressione genica tra seedlessvarietà ed è di tipo selvaggio semilavorato durante l'organo floreale e lo sviluppo e non andrò nel dettaglio. Poi la tecnica che, stavo per parlare di microarray.Così, come ho detto che la microarray è una sorta di chip.So, questo tipo di chip è stato generato e questo è stato molto diffuso nell'era post genomica, prima del sequenziamento dell'RNA. Una volta che il genoma è stato sequenziato, abbiamo identificato i geni, abbiamo identificato la sequenza di tutti i geni. Poi quei geni sono stati progettati e questi probi sono stati spottedin questi chips.Quindi, per ogni gene abbiamo avuto una sorta di sonda. E poi c'erano due modi di identificare l'espressione differenziale, una era la due vie colorate e una a colori.Quindi, in un modo colore quello che devi fare, supponiamo che tu voglia testare un campione di tipo jolly che sia il tuo test o mutante sample.Quindi, vuoi identificare i geni che sono differentemente espressi tra questo tipo jolly e questo mutante. E quello che puoi fare, puoi estrarre l'RNA totale dal tipo selvatico, l'RNA totale dai themutori poi hai etichettato questo RNA.E un modo di etichettare è stato, la biotina etichettatrice di cRNA, entrambi erano sostanzialmente labeled.Quindi, intera popolazione di RNA in queste due condizioni, sono stati etichettati e poi questo cRNA etichettato è stato usato per fare l'ibridazione nei chip. Così ora, questi chip contengono, geni globali tutti i geni rappresentati in una quantità uguale. Ora da allora supponiamo che, c'è un gene A, che è più in caso di tipo selvaggio, la butit si sta abbassando in caso di mutante. Poi ci si aspetta più cRNA in natura selvatica, meno cRNA in mutante. E quando ci si ibrida sul chip, ci si aspetta più segnale per quella sonda in caso di tipo mutante. E poi se si confronta l'intensità del segnale, si fa la scansione dell'acquisizione dati e se si calcola il valore assoluto dell'ibridazione, è possibile identificare la differenza nell'espressionpattern del gene A tra selvaggi tipo oltre che mutante. E poi, un altro modo di analisi è stato quello che ci ha fatto assumere, il caso simile hai un RNA mutante e poi prendi l'RNA totale da entrambi il campione. E poi li etichetti con due diverse colorazioni per esempio, questo è cy5, questo è cy3,cy5 darà colore rosso, cy3 darà colore verde e poi assumerai uguale quantità di totalcRNA e ibridizza sullo stesso chip.So, praticamente la differenza tra questi due metodi era, qui sia i cRNAs, werecRNAs erano etichettati con la stessa etichetta, mentre sono etichettati con le diverse etichette. Qui sono stati analizzati, sono stati ibridizzato su due differenti chip indipendenti, qui bothare è ibridizzato sullo stesso chip.So, supponiamo che ci sia un chip che sia per gene A. Ora normalmente se il livello di espressionalità di A è uguale in tipo selvaggio e mutante, allora ci si aspetta la stessa quantità di cRNA 5label e cy 3 livello cRNA per andare e ibridare con questo particolare probe.Quindi, ci si aspetta la stessa quantità di segnale rosso, stessa quantità di segnale verde qui. Ma se uno qualsiasi di essi è differenzialmente presente per esempio, se l'espressione è morein il tipo selvaggio allora ci si aspetta un segnale più rosso che il verde e allora il colorato di queste macchie cambierà, sarà più verso il rosso. Se il gene è giù regolato allora sarà più verso il green.Quindi, basandosi su questo colore e poi la quantificazione si può effettivamente calcolare la piega tra tipo selvaggio e mutante per tutti questi gene. Queste tecniche si possono usare anche per le diverse fasi, non è solo in natura dattilografica selvatica. Ad esempio se si assume questo particolare case.Quindi, dove cosa hanno studiato le persone?Le persone hanno studiato i geni che sono differenzialmente espressi, a diversi stadi di sviluppo del riso panicolare o sviluppo fiorento.Così, per esempio, se si prendono queste tappe, questo è il palco 0 che è praticamente vegetativefase e questo è il vostro spartiacque apicale. Estrarre l'RNA totale dalla fase vegetativa e poi si tratta di una transizione dalla vegetazione alla fase riproduttiva. Poi dopo la transizione, questa infiorescenza è sottoposta a una diversa fase di sviluppo. Qui il ramo primario meristem e poi il ramo secondario meristem, la meristemma secondaria di spikelet queste stage di sviluppo che sta andando acrosso.Così, quello che le persone hanno fatto, hanno preso RNA da qui da tutte queste diverse stagesche hanno eseguito l'analisi microarray in grande dettaglio. E questo come potevano identificare in realtà diverse cose, prima cosa potevano identificare il gene che è presente in uno stadio di sviluppo particolare, ma assente nella fase dello sviluppo evoluti.O un particolare geni, come è lo schema di espressione dinamica è attraverso lo sviluppo. Ad esempio, alcuni geni potrebbero essere 0 qui e poi vengono improvvisamente attivati andarli attraverso lo sviluppo. O sono attivati in questo dominio di sviluppo e poi stanno andando down.Quindi, questo è un modello di espressione fondamentalmente dinamico che si può analizzare, usando questa tecnologia.E questo tutto, stiamo facendo a livello globale e possiamo identificarci.Ad esempio se, i geni, sono stati testati qui di seguito, potete verificare questa analisi RT PCR. Se vedete il gene LAX, il gene LAX è molto basso a 0 ° stadio ma attraverso le tappe 2.1.2034 5 il livello di espressione è in aumento, mentre se si prende questo FZP che è FRIZZY PANICLE, questa è l'espressione inizia o si attiva solo dalla fase 4 in avanti e continuein the stage 5.It non è presente nella fase iniziale, mentre questo MADS3 si sta attivando in stage5.So, ecco come quel microarray fosse estremamente utile, nello studiare questo tipo di analisi di espressione differenziale genoma. Questo è un altro esempio di microarray che è stato usato e qui potete guardare qui che, hanno concentrato il loro studio sulla scatola MADS contenente i geni. Perché mi sto concentrando di più sul gene della scatola MADS contenente gene?Perché questa era la classe, che è ben consolidata per regolamentare un sacco di processi di sviluppo, sono molto importanti rispetto allo sviluppo delle piante. E qui hanno preso grande quantità di foglie mature di tessuti, radici, 7 giorno di seedling e poi questo panicone, diverse dimensioni di panicca o di infiorescenza significano diversi stadi di sviluppo incaso di questo. E poi hanno controllato il modello di espressione, attraverso l'analisi microarray. E cosa possono identificare, ci sono molti genes.Quindi, se si guarda l'espressione è qui di seguito, se il verde è meno espressione, rosso è alta espressione. E poi si può guardare che un gene particolare, se si passa attraverso i diversi organi è possibile vedere la loro espressione. Come i modelli di espressione stanno cambiando da uno stadio di sviluppo ad un altro stadio di sviluppo o un tessuto a un altro tessuto. Così questo, questo era importante studio.Oggigiorno è il sequenziamento di RNA, questo è il sequenziamento di prossima generazione è molto economico e facilmente disponibili.Così, ora, le persone stanno facendo sequenziamento di RNA e il sequenziamento di RNA presenta alcuni vantaggi rispetto al themicroarray.Primo vantaggio è che, per microarray per generare i chip devi avere la sequenceinformation, il che significa che i genomi dell'organismo devono essere sequenziali, poi andsolo poi, si possono definire probes per il chip. Ma in sequenziamento RNA, il genoma anche il genoma non è sequenziato, può essere studiatoattraverso l'RNA sequenziamento. Un processo molto importante nell'organismo eucariotico è l'alternativeRNA splicing. Alternative RNA splicing è come, se un gene ha più introns.Quindi, supponiamo che questo sia intronico 1, intron 2, intron 3.So, ci sono un gran numero di regolazione genica si verifica a livello di splicing.Quindi, la splicing alternativa fornisce essenzialmente, un'opportunità per generare più di una proteina dattilografica da un singolo gene, solo alternativamente splicando i diversi introni, si può generare da qui se si divide tutti gli introni. Poi si può generare un RNA messaggero, dove non si divide intron 1 o non si divide intron 3 o si divide l'individuo, si possono addirittura saltare i theintrons, è possibile suddividere questo exon insieme all'intron.So, questo fornisce un gran numero di trascrizioni diverse dallo stesso gene. E è molto difficile o è molto impegnativo tenere le probes per tutte le varianti di splice nel techip, nel microarray speriment.Quindi, è stato molto impegnativo perché se non si sa, quante varianti di varianti per un gene particolare, è molto difficile. Perché normalmente quando si progetta il chip si è abituati a tenere uno o forse due orforse tre chip per un particolare gene. Ma se c'è qualche intruso qui, non avrete a disposizione intron o splice variant. Ma in caso di sequenziamento di RNA, in sostanza può catturare tutte le varianti di splice - Quindi, se si guarda la tecnica come funzioni di sequenziamento dell'RNA?Quindi, praticamente quello che facciamo nel sequenziamento dell'RNA, si estrae l'RNA messaggero totale e poi è possibile rimuovere specificamente l'RNA messaggero dal totale RNA.Come si può fare?Tutti voi sapete che l'RNA messaggero che hanno poly Una coda ai tre primi e thenyou può usare oligo dT taggato con qualche tipo di pernottamento. E usando questo sistema è possibile rimuovere specificamente l'RNA messaggero dalla popolazione totale di RNA. E poi si usa questo RNA e si può fare il frazionamento è possibile realizzare un piccolo frammento di RNA e poi usare alcuni primer casuali. I primer di Random sono fondamentalmente piccoli primer nucleotidici con differentsequences.So, può andare casualmente e legare luoghi diversi e poi si può fare primo strandcDNA, sintesi secondo strand cDNA sintetsis.Così, sostanzialmente si stanno generando un diverso cDNA di piccoli frammenti diversi ed è raddoppio cDNA.E poi una cosa importante, quello che si può fare, si può mettere il fosfato, normalmente i primer non hanno il fosfato al loro end.Quindi, allora si può mettere a fornire il fosfato perché se si deve usare questo per ulteriori processi di legatura, se non hanno fosfato al loro fine, allora si può fare la riparazione fine mettere il fosfato. E un'altra cosa che si può fare, è possibile aggiungere il flanking A, questo è possibile fare usando poliA polimerasi e poi se si aggiunge questa coda A, questo vi fornirà questo frammentatore e aggiungete qualche adattatore così, potete legare l'adattatore. Questo adattatore può avere un tratto di T. Così, T e A, andranno e si annegaranno a vicenda e poi potrete eseguire una reazione.Così, essenzialmente quello che state generando, state generando doppie frammentazioni di DNA con adattatore sia alla fine. E poi si conosce la sequenza di questo adattatore è possibile utilizzare questa sequenza di adattatore e si può scattare e sequenziare questa intera popolazione cDNA. Questo è molto diffuso in questi giorni e questo può essere usato per identificarsi.Quindi, se si assumono due diverse popolazioni di RNA, due diverse persone di allora si possono generare due diverse popolazioni di cDNA frammentate.E se li metti in sequenza e li confronta, puoi identificare levelof differenziali di espressione diversa RNA.So, di nuovo darò alcuni degli esempi, in cui il sequenziamento di RNA è stato usato per identificare il pattern di espressione differenziale. Ad esempio, qui sono stati estratti diversi frutti di scena e sono stati estratti RNAs totali. E si possono vedere chiaramente i diversi geni e il loro schema di espressione. Per esempio se si guarda qui, se si guarda questo gene, o uno qualsiasi di questo gene, questo ha un'espressione molto bassa a questo stadio, ma se si arriva qui entro la fine di questa fase il livello di espressione è riallettante molto high.Così, questo racconta, che ci sono un'espressione differenziale di diversi tipi di geni. E qui si può vedere che, questa è la mappa di calore dei dati di sequenziamento di RNA che coinvolge lo sviluppo di theshoot. Qui hanno preso diversi tipi di germogli secondari, poi ce ne sono alcuni, qualcosa che si chiama madre variant. E hanno estratto l'RNA totale e hanno eseguito sequenziamento RNA, attraverso diversi tipi di germogli e hanno identificato diversi geni specifici dei tessuti che sono presenti qui. Questo è un altro esempio, dove l'RNA comparato l'analisi di sequenziamento è stata fatta per la trascrittomedinamica durante lo sviluppo petale in a Rose.One del membro Rosaceae e dove si può vedere che hanno preso diverse stagne dei petali dal diverso stadio di sviluppo e hanno eseguito l'RNA sequencinganalysis, e potrebbero identificare un diverso schema di espressione genoma. E potete vedere, possono identificare qui tutti questi diversi tipi di fattore di trascrizione. A seconda dei vostri studi, è possibile concentrarsi sulla trascrizione fatto.Così, è possibile identificare tutti i fattori di trascrizione che sono differenzialmente espressivi qualsiasi altro tipo di fattore di trascrizione. Un altro modo se si assume questo tipo di RNA sequenziamento in sequenziamento di RNA si può combinare con una tecnica differenziata. Non è stand alone tecnica e poi si può eseguire una tecnica più indicata o più definibile per generare dati di sequenziamento RNA. Ad esempio, se si ha una qualche fase di sviluppo magari disegnerò qui di seguito. Ad esempio, se si desidera studiare una fase di sviluppo in un particolare, supponiamo che si voglia studiare la fase di sviluppo della radice e si sa che lo sviluppo di radici avviene attraverso diverse fasi dello sviluppo. La prima fase in la radice laterale, il branching è che la specificazione di alcuni, alcune cells.Così, queste sono le cellule mature, ora stanno assumendo la proprietà delle cellule staminali e poi queste cellsiniano la divisione cellulare. Si sottoponono al processo di divisione cellulare e generano una specie di primordia whichis chiamata radice primordia. E poi questa radice, la primordia di radice si sottopone al processo di differenziazione delle cellule. Inizia il programma di differenziazione delle radici e poi infine, la primordia è emergente. Ora, se volete davvero identificare i geni, potete raccogliere questo tessuto molto precisamente.Ci sono molte tecniche disponibili, una della tecnica che si chiama captureicrografia laser. Si può usare e si possono raccogliere tutte queste primordia e poi estrarre l'RNA totale fromquesta primordia e poi si può identificare.Oppure si può prendere un campione di tipo selvaggio e il campione mutante, è stato un particolare trascriptionfactor un particolare gene è mancante. E si vuole identificare quali sono i geni, che sono, le cui espressioni sono influenzate, quando si muta un gene particolare. Poi si può fare l'RNA totale, si può fare estrazione totale di RNA. E poi eseguire il sequenziamento di RNA per identificare i geni differenziali che sono presenti inqueste due particolari condizioni o due particolari mutants.Così, questo è analizzando lo schema di espressione, dove abbiamo cercato di studiare oggi come identificare l'espressione differenziale pattern. Ora per fare analisi del pattern di espressione spaziale e temporale, ci sono diversi metodi, che discuteremo di più nella classe successiva. Ma per presentarli brevemente, un modo di fare è quello di studiare la localizzazione RNA, che poi si può fare l'RNA - RNA in situ ibridizzazione. Poi si può fare una localizzazione proteica specifica e localizeyou può studiare la loro specifica localizzazione in tutti i tessuti. E poi si può fare una sorta di trappole promoter, dove è possibile identificare se un promoter o un promoter fusione, si può dotradurre fusion.Così, forse fermeremo questa classe qui. E nella prossima classe discuteremo in dettaglio, come studiare l'espressionismo spaziale e temporale e la caratterizzazione funzionale del gene attraverso approcci basati sulla genetica inversa. Grazie mille.