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Ora, ci concentreremo sull'approccio basato sulla genetica inversa. Così, in approcci basati sulla genetica inversa qui abbiamo prima identifichiamo il gene e il thenwe cerchiamo di capire qual è la funzione specifica un gene particolare o un gruppo di geneshave in una particolare processi.Quindi, se si guarda questa slide, quindi questo processo di genetica inversa può essere studiato a seguire. In primo passo quello che puntiamo?Puntiamo a identificare un gene di interesse e isolare quel gene di stato; gene di interesse per studiare la sua funzione. Poi il secondo passo di questo è che per analizzare il modello di espressione di questo gene.Quindi, qui partiamo da un gene.Quindi, dovremmo sapere dove esattamente questo gene viene espresso in modo particolare rispetto alle fasi di sviluppo, gli organi di tessuti sviluppatori qualunque cosa sia. Poi una volta identificato il gene conosciamo il fattore di espressione, perché vogliamo conoscere il modello di espressione, perché questo ci permetterà di aspettarci qualche fenotipo nel tissuedove si esprime normalmente. Poi ci muoviamo per la caratterizzazione funzionale di questo gene ci sono approcci differenti che si stanno prendendo cura più comunemente stiamo prendendo il guadagno dell'approccio di funzione andwe cerchiamo di esprimere un gene dove normalmente non è espresso e guarda cosa succede. Questo racconta se un gene è sufficiente per avviare qualsiasi programma di sviluppo o no. Secondo approccio che prendiamo noi prendiamo la perdita di funzione approcci, in questo studio whatwe proviamo a mettere a tacere un gene o a bussare a un gene e poi alla ricerca cosa succede in uno sviluppo, questo ci permette di capire se il gene è necessario in particolare funzione. Poi ci muoviamo e cerchiamo di capire qual è il meccanismo dietro a un particolare ruolo di sviluppo che questo viene fatto studiando l'interazione di un gene particolare, può essere interazione genetica interactionfisica con altro regolatore o le sue interazioni normative. Un'altra cosa molto importante, quindi se vogliamo prendere un approccio di genetica inversa a base di genetica ho detto che ci sono qualcosa che dobbiamo sistemare prima prima di identificare un gene firmano quello che vogliamo aggiustare è processi.Quindi, devi definire questo è molto simile quello che abbiamo fatto nella genetica in avanti well.So, in forward genetics per identificare un particolare mutante o particolare fenotipo we fix thisprocess, qui per identificare un gene putativo sistemeremo la process.Quindi, se siete interessati a cercare la funzione meristem o i geni che risponderanno alla determinatezza dell'organogenesi o alla fase di transizione di sviluppo. Allora, fisseremo prima il processo, poi volete specificare che vorreste specifyquale tipo di gene che volete studiare.Quindi, ci sono alcuni geni che sono direttamente coinvolti in qualche processo biologico ad esempio, la divisione cellulare o alcuni enzimi che stanno fondamentalmente controllando un processo fondamentale e la seconda classe di geni sono genes.Quindi, questi geni stanno regolando prevalentemente l'attività di alcuni geni dello sviluppo. E quando si tratta del regolamento ci sono diversi step di regolazione del gene della regolazione e almeno grandi passi in cui vorreste guardare il regolamento è la trascrizionaleregolamentazione, qui perlopiù ci concentriamo sul fattore di trascrizione specializzato fattore di trascrizione. Post normativa trascrizionale ci sono molti regolatore di sviluppo che si è identificato e funzionano dopo la trascrizione come post trascriptional prevalentemente arescim RNAs.Poi ci sono noti regolatori di sviluppo che regolano la sintesi proteica o la traduzione di un particolare RNA messaggero, e poi post post traslazionale dove si controlora l'attività di un determinato regolatore regolando o modificando la proteina throughpost modification.Quindi, prima di iniziare qualsiasi processo dobbiamo definire questo passo dopo passo dobbiamo sistemare il processo orologico, noi devono sistemare tipo di geni poi ci muoviamo e cerchiamo di identificarti di gene.Quindi, possiamo prendere due approcci uno si chiama approccio genico candidato in cui è possibile identificare geni singoli con funzioni di sviluppo putativo. In secondo approccio si può assumere più tipo di geni globali, che si chiama genomicshere non si identifica un singolo gene che si identifica in un particolare processo di sviluppo e poi si muove ahead.Quindi, quali sono i criteri che cerchiamo di identificare o per la selezione di un particolaroma che potrebbe avere qualche funzione nello sviluppo processes.Quindi, ci sono due importanti parametri quello che consideriamo primo è l'analizzatore omologo di casa - Così, prima cosa accade che alcuni organismi modello siano sequenziati; se i genomi sono sequenziati, allora si possono identificare alcuni geni che hanno già subito un po' di funzione di sviluppo. E poi si possono identificare altre specie di piante, specie vegetali correlate o in altre di classe di piante e poi si cerca di identificare se c'è un gene omologo per quel particolaregolators.Così, per esempio, alcuni regolatori fanno una specie di famiglia di geni.Quindi, ci sono più geni che appartengono a quella famiglia e qualche volta ciò che accade l'entirefamiglia è perlopiù regolato, qualche tipo di percorsi di sviluppo o si stanno ampliamente regolando più elaborazioni fisiologiche e di sviluppo. Così, si può guardare la famiglia dei geni e poi si può guardare la somiglianza della sequenza.Quindi, se supponiamo di avere un gene particolare magari in pochi diaposali mostrerò ad esempio come questo sia stato preso, ma si può scegliere un gene che sia noto per avere qualche funzione di sviluppo, poi si possono prendere le sequenze e cercare di trovare outquali sono il gene omologo in un'altra specie correlata. E poi se c'è un comune dominio funzionale si può cercare quello e poi un altro thingè che si vede la relatedenza che si chiama fisiogenetica analysis.So, tipicamente se un gene sta avendo un alto livello di omologia o se è molto correlato con un gene particolare ci si può aspettare che possa avere un funzione simile in altre species.Così, questo è in silico approcci prevalentemente bioinformatici approcci questo vi aiuterà a definire una parte dei geni che potreste assumere per lo studio funzionale.Poi seconda cosa importante è possibile verificare l'espressione schemn.So, questo è molto importante perché se siete interessati a farvi assumere supponiamo che siate interessati a studiare qualche gene responsabile dello sviluppo di organo floreale, allora vorreste verificare il modello di espressione e preferite un gene che potrebbe avere una specificità nel fiore o in alcuni organi del flower.Così, potete verificare l'espressione specifica organo e poi potete verificare l'espressionalità specifica dei tessuti all'interno dell'organo se volete definire una funzione molto specifica. A livello dei tessuti potete cercare l'espressione pattern a livello tissutale, se sei interessante più gentile di nello stadio specifico di espressione genica dello stage è possibile individuare alcuni stagisti diversi e poi è possibile identificare alcuni geni che sono presenti in una particolare fase di assentamento di un'altra fase. E poi si può ad esempio identificare un gene che non è espresso nelle fasi riproduttive, ma è espresso nelle fasi riproduttive che ci si può aspettare che questo gene mighino qualche funzione durante gli stages.Così, questi due principali approcci diamo per definire un gene e si può vedere qualche esempio, come questi approcci sono stati presi. Per esempio, in Arabidopsis thaliana una classe di un fattore di trascrizione MADS box containingtranscription factor è stata ben studiata e si è identificato che giocano un ruolo molto importante nello sviluppo dell'organo floreale e nell'organo floreale. Per esempio, questo approccio è stato utilizzato per identificare questo MADS 5, MADS 1 e sono stati assunti per approcci genetici inversi per mostrare la loro specifica funzione durante lo sviluppo del fiore di riso .Analogamente, così come ho detto che potrebbe essere in alcune delle future classi studieremo come si studia il flowerdevelopment in modello dicot Arabidopsis thaliana e lì quello che abbiamo trovato che abbiamo trovato alcune classi di geni particolarmente A classe, classe B, C class.Quindi, questo è tipicamente un gene di classe, allora si ha gene class gene e C class gene e A classgeni è dimostrato che i geni di classe B e di identità petale vengono mostrati toregulati e i geni della classe C sono mostrati per regolamentare stamen e carpelidentità.E poi se si guarda la sequenza somiglianza del dominio funzionale in altre speciesche può identificare il gene omologo. Se prendo esempio per esempio, se si guarda questo PI; PI è un tipico genere di classe B che interagisce con AP3 per specificare sviluppo petale e stamen in Arabidopsis.Now, ci sono omologhi come MADS2 e MADS4 sono stati identificati in base al dominio funzionale di analisi filogenetica nel riso e quando sono stati studiati; sono stati studiati in riso, è stato dimostrato che in realtà sono coinvolti in regolazioni di equivalente petalo che è lodicule nel riso e stamane sviluppo ok. Ma c'è una cosa interessante ci potrebbero essere anche molte variazioni specifiche di specie. Ad esempio, c'è un solo gene PI in Arabidopsis, ma il riso il PI è duplicato abbiamo due PI come i geni MADS2 e MADS4 e quando entrambi sono stati studiati. Funzionalmente è stato scoperto che MADS2 è più importante per lo sviluppo di stampo petale, probabilmente MADS4 è più regolato sullo sviluppo di stamen .Quindi, questo è uno approcci in cui è possibile identificare un gene putativo da studiare.Poi venendo al modello di espressione analysis.So, schema di espressione ci sono modi diversi per studiare lo schema di espressione. Tipicamente le persone abituate a fare analisi del nord nei primi giorni in cui il genoma o il mostarof the genomes non erano sequenced.Quindi, era più tipo la tecnica basata sull'ibridazione forse vedremo qualche tempo later.Ma, cosa succede che se lo vedi stiamo estraendo il totalRNA frazionato attraverso l'elettroforesi in gel che si trasferisce sulla membrana e poi stiamo utilizzando un RNA antisenso o una specifica sonda DNA o RNA che è radioattivamente etichettata andthen probing con it.Quindi, andrà e si ibriderà con l'RNA messaggero specifico per quella sonda e poi si può rilevare attraverso il metodo di rilevamento radioattivo. Per esempio, se si osservano alcuni esempi, questo è uno del gene MADS e ha dimostrato che questa è una foglia può essere setale, petalo, stamen e carpello è possibile vedere che il thisgene è molto espresso nella carpiera, ma non è espresso in tutti gli othertissues.Analogamente, se si guarda questi sono geni diversi e sono molto molto resistenti nel fiore, ma non esprimono o esprimono molto deboli a foglia e othertissues.Così, questo racconta una sorta di; questo è un tipo di espressione differenziale schemn.So, potete usare il modello di espressione, ora possiamo aspettarci che se ho preso questo gene mi aspetto che questo gene possa avere qualche ruolo nello sviluppo del carpello mentre, questo tipo di generale ha un espressiono.Così, possiamo dire che potrebbe avere qualche funzione nel fiore. Poi una volta definito un gene la prossima domanda è come isolare il gene?Per isolare un gene se se il tuo organismo modello o se la tua specie vegetale che ti interessa, se il genoma non è sequenza allora devi prendere qualche approccio all'identifythe gene perché non puoi progettare un primer non puoi fare reazione a catena della polimerasi, butif il tuo genoma è sequenziato poi è relativamente facile puoi progettare un primer specifico fortuo gene tua tutta la sequenza è conosciuta e puoi amplificare la PCR.Ma prendiamo il primo esempio se il genoma non è sequenza, poi un modo di isolare il geneis usando la biblioteca del cDNA o la biblioteca genomica.Cosa sono questa libreria?Quindi, in sostanza ciò che accade che se il genoma non è sequenziato è possibile fare la loro biblioteche e come si può fare; si può prendere una cellula specifica tissutale o un particolare organetto che si è interessati a poter estrarre il totale messaggero RNA o la libreria genomica totale, si estrae il DNA genomico totale, ma se si vuole fare della libreria del DNA genomico è necessario estrarre il total messenger RNA qui questo fornirà le informazioni del gene espresso questo fornirà le informazioni dell'entiregenome a livello del Dna. Per la libreria genomica si prende il DNA la digestione parziale puoi gustarlo, candidare e poi puoi frantumare, puoi scegliere quale dimensione o frammento vuoi per generare libreria.Analogamente, per l'RNA messaggero si estrae l'RNA totale dall'RNA totale si può isolare o si può specificamente frazionare l'RNA messaggero e quindi utilizzare questo RNA messaggero per generatela sintesi del cDNA. Il modo tipico di generare la sintesi del cDNA è così, si sa che un tipico messaggero RNAin caso di eucariotica hanno polpa A coda e si può progettare un primer che è oligodT.Questo oligo dT è un primer inverso che si unirà alla polpa A coda di tutti i messaggeri RNAe poi si può fare processo di trascrizione inversa attraverso il quale si può fare il DNA fromthe RNA.So, ora il tuo template è l'RNA messaggero e tu sei d'uso fare RT e poi ti truccherà DNA.So, questo è il tuo DNA, questo è il tuo DNA, quindi puoi generare il DNA dall'RNA messaggero prendi questo cDNA e puoi scegliere quale dimensione di libreria vuoi preparare orte puoi preparare tutta la libreria, e poi puoi usare un vettore adatto a seconda delle dimensioni del tuo frammento o dimensione di cloni che vuoi generare, e poi digest thisvector e fare la legatura. Attraverso la legatura e la trasformazione è possibile catturare in pratica tutte le cDNAs; tutte le specifiche cDNAs che sono presenti in un particolare tessuto o in un particolare organo o in una particolare fase di sviluppo e poi si possono clonare e mettere in forma di biblioteche diverse. Ora, dal momento che si ha la libreria ora si vuole identificare un gene specifico da quella libreria.Quindi, ci sono due modi di farlo a seconda di che tipo di biblioteca hai made.Così, un modo di fare è l'ibridizzazione delle colonie e poi l'ibridizzazione di placche. Tecnologia entrambe le tecniche sono molto simili ciò che fai in pratica ci fai assumidire che hai libreria qui e cosa puoi fare, puoi far crescere questa colonia su un platee poi puoi fare una replica plating.Quindi puoi realizzare una membrana e puoi praticamente replicare o puoi truccare la piastra di replica di questo particolare piatto e poi usi questa membrana cell lyse e bakeit.Quindi, che il DNA che sta arrivando da questo DNA, RNA tutto ciò che è provenienti da questi batteri si stanno fissando o si attaccano con la membrana, poi takethis membrana e ibridizza con la tua sonda specifica del gene e poi puoi rilevare it.Quindi, supponiamo che tu faccia l'ibridazione e il rilevamento se questa è la colonia della colonia che mostra il segnale con il tuo gene A, allora puoi assumidire che i batteri corrispondenti o la colonia corrispondente potrebbero avere un frammento di A. Tu isolataquesta colonia isola il DNA, isolare la sequenza di cDNA e poi identificare il tuo gene di interesse per il tuo studio funzionale.Come ho detto se il genoma è sequenziato, quindi probabilmente isolare il gene è molto facile, si può fare una semplice amplificazione genica basata su PCR dove si deve progettare il gene specifico primerand è possibile che si possa progettare .Quindi, in sostanza se questo è il tuo gene è possibile progettare un primer corto che wecall avanti primer, uno come primer reverse e poi puoi fare un amplification.Now, è possibile clonare un gene questo si chiama gene clonazione, è possibile clonare un gene e mentre si sta clonando il gene è possibile utilizzare la copia genomica oppure si può fare un cDNA.Copia genomica in sostanza, se si sa e se si ricorda la sua biologia molecolare di base si sa che in caso di geni eucariotici i geni hanno degli esoni oltre che introns.So, se si usa il DNA genomico come modello e se si usa un primer e si amplificano il gene thenyou si amplificano sia come intron; mentre, se si fa del cDNA per makingcDNA si sta utilizzando l'RNA messaggero maturo e nell'RNA messaggero maturo tutti gli introni sono già splicati out.Quindi, se si usa questo metodo per amplificare il proprio gene allora qui si amplificherà una regione codificante già splicata e questa sarà senza la introns.So, a seconda del tuo utilizzo dipende dal bisogno che tu possa scegliere quello che vuoi usare e questo è il modo in cui puoi sostanzialmente identificare o isolare un particolare gene di interesse .Quindi, ora hai definito il tuo gene di interesse dove vuoi, che vuoi studiare attraverso l'approached.Now, passo successivo è stato che hai già isolato il gene e poi puoi procedere per la funzionalcaratterizzazione che porteremo in qualche altra classe. Un altro approccio che si può fare per fare più identificazione genica isthe genomics based approcach.So, in base genomica avvicinarci a quello che facciamo aggiustiamo il nostro processo biologico il nostro organo biologicalorgano o questione e poi identifichiamo all'etichetta globale quello che tutti sono i geni che sono espressi o che sono presenti there.Quindi, genomica praticamente puoi ci sono due classi di genomica strutturale e genomica funzionale. Nella genomica strutturale ciò che facciamo in sostanza genomica facciamo sequenza di tutto il genoma, thè quando si sequenza l'intero genoma è possibile utilizzare l'organizzazione del genoma. Nell'organizzazione del genoma è possibile identificare in sostanza quali sono i geni, quali sono le regione codificante, quali sono la regione non codificante. Poi si può fare annotazione di genoma dove si può prevedere il gene attraverso l'utilizzo di bioinformaticool fare l'analisi basata sull'omologia, utilizzando il modello di altre sequenze conosciute o si può prevedere la funzione putativa o si può prevedere il dominio putativo o classe della proteina tutto questo tipo di cose. Poi un'altra cosa importante cosa facciamo nella genomica strutturale è la sequenziazione EST; EST è sostanzialmente Espresso Sequenza Tag.Quindi, qui quello che si fa in pratica è possibile determinare le sequenze parziali di qualche cDNA e thisyou può fissare in un tessuto diverso, diverse fasi e diverse condizioni. E questo è possibile clonare piccolo frammento della sequenza clone cDNA per identificare quali sono i thegeni che si esprimono in una particolare condition.Quindi, se si guarda questa diagram.Quindi, si può fare che se si ha una sequenza di genoma, si può fare il gene discovery, EST sequenziamento, sequenziamento EST, full length cDNA che si può fare come ho detto sia da PCR.So, ci sono anche altri metodi, allora si può fare un'annotazione funzionale del gene, si può fare analisi di pattern di espressione in previsione silico homology based then mutant analysiswe osserverà in altre classi, nelle lezioni future, poi interaction.Così, questo è un modo per muoversi per il funzionale; per la genetica inversa. Un altro approccio genomico quello che stiamo prendendo è l'approccio genomico funzionale. Qui ci identifichiamo o controlliamo l'espressione genica e poi traccia i meccanismi dietro una particolare process.Ora, ne prenderemo uno per uno, se devi iniziare a monitorare l'espressione genica poi firmiamo ciò che vogliamo guardare che c'è un gene specifico per organo espressione genica espressione o tissuespecific. Organo specifico espressione genica che si può fare; si può verificare in diversi organi questo schema di espressione differenziale iscagliato, che è presente in qualche organo assente in qualche organo. Può essere organo, può essere tessuto qualunque cosa si desidera e poi si può identificare i geni espressi differentemente o si sarà più interessati se l'espressiondi un gene particolare è espresso ovunque probabilmente questo potrebbe non essere molto regolato e poi ci interesserà di più di un gene che è specificamente o presente in un po condizione, ma assentina la maggior parte delle condizioni. Poi si può studiare l'espressione specifica tissutale; nell'espressione specifica dei tessuti è possibile evengo e guardare il modello di espressione nell'organo; nell'organo se si fa anatomia dell'organo si vuole guardare dove si esprime esattamente il gene che è espressedis più importante. Poi come ho detto che se si vuole studiare fasi di sviluppo, quindi uno sviluppo arriva dopo il thenext e poi quello che si può fare qui è possibile identificare l'esordio di un particolare gene.Quindi, supponiamo che un gene sia espresso in una particolare fase di sviluppo, ma è absentina precedente stage.Così, puoi andare a identificare qual è la prima fase di sviluppo in cui questo gene si attiva ad attivare o iniziare a esprimere questo si chiama schema di espressione temporale. Poi facciamo promoter di trapelare come esattamente facciamo discutere in un altro class.Quindi, cosa sono il diverso modo che stiamo usando nell'espressione genica tomonitor di biologia dello sviluppo e questo è il vecchio modo in cui le persone che facevano era il blot nordico analysis.So, velocemente se descrivo i blot Northern analysis.So, estraiamo l'RNA totale da due diversi organi, due diversi stadi o due diverse condizioni, eseguirle su gel e poi trasferiamo l'RNA su membrana e poi si desidera ubrare la sonda che è molto specifica per un gene particolare. Ibridizzare la membrana e poi controllare l'espressione e vedere come le espressioni orquantità di RNA variano tra i tessuti attraverso gli organs.Così, questi sono alcuni dell'esempio se si guarda questo è stato fatto per alcune micro RNAs; microRNAs 393 e micro RNA 171 e se si guarda diversi tessuti di radice, foglie, inflorescencee silique è stato use.Quindi, la sonda è stata usata contro questo micro RNA e se si guarda è stato sperimentato un background di tipo selvaggio in cui è stato sperimentato qualcuno dello sfondo mutante. E si può vedere chiaramente che prima cosa il micro RNA è presente in alcuni tessuti, è presente nella foglia, è presente nel tronco, è presente nell'infiorescenze.it, questo racconta l'espressione specifica dell'organo, questo racconta l'espressione specifica organo, quindi è assente nel sistema di root e poi non solo thatif si guarda questi mutanti. In mutanti sfondo l'espressione viene reduced.Così, ad esempio, se si prende il caso della foglia, quindi è molto presente in caso di background di tipo jolly, ma in background mutante l'espressione è ridotta. Similare tipo di cose potete controllare qui per altre micro RNA.So, il blot settentrionale viene usato qui, ma questo è come ho detto che in precedenza veniva usato quando le tecnologie avanzate tecniche non sono state scoperte perché comporta akind di attività radio.Ora anche se abbiamo un altro metodo di attività non radiofonica, ma questo è più tipo di laboriousmetodologie .Così, questo è usato ora in casi molto particolari, ma questo non è una sorta di wayof di routine di controllo delle espressioni di espressione, l'analisi di espressione più veloce e più facile da fare è la trascrizione inversa PCR.Così, nella trascrizione inversa PCR ciò che praticamente si sta doing.Quindi, si sta estraendo RNA totale, poi si sta utilizzando un primer reverse primer che può essere oligo dT o può essere semplicemente primer casuale e poi si sta facendo la trascrizione inversa per fare cDNA e quindi se si ha estratto l'RNA totale da un tessuto particolare, allora si convertirà tutto l'RNA messaggero in cDNA da quel particolare tessuto. E poi si può usare qualche primer specifico di gene per fare l'amplificazione PCR da quella particolarpool e poi si può vedere se un gene questi è il prodotto RT PCR product.So, si può vedere in una determinata condizione se si guarda in tessuti diversi, questi geneslook abbastanza stabili si esprime in quasi tutti i tessuti come la radice come foglie, butif osservate le diverse condizioni. Per esempio, quando si sta inducendo con il sale o inducendo in osmotico, quando si fa notoriamente il livello di espressione è quasi 0.But quando si induce a diverso punto di tempo in root, poi si può vedere che l'espressiondi questi geni sta salendo su questo è possibile monitorare da RT PCR e questo RT PCR si chiama semi quantitativeRT PCR.Quindi, ecco cosa stiamo facendo?Stai facendo cDNA, poi stai facendo un po' di ciclo di PCR e poi stai prendendo il prodotto finale del PCR e stai correndo sul gel controllando qui. Il inconveniente qui è che non sai dopo quanti cicli la RT PCR starnicherà saturated.Quindi, ora il metodo alternativo che è arrivato è RT PCR quantitativa RT che è morekind di colorazione basata qui il verde Siri è abitualmente usato e thiscase cosa esattamente puoi fare, puoi sostanzialmente monitorare lo schema di espressione più quantitativamente.E ad esempio, se si guarda questi sono i diversi tessuti presi, questi geni sono diversi e qui si può progettare un primer specifico di gene e si può monitorare l'espressionpattern in modo più quantitativo per diversi geni in diverse condizioni.Quindi, si tratta di altre tecniche molto importanti che vengono utilizzate per questo one.Quindi, ci fermeremo qui per questa classe e nella prossima classe ci occuperemo ulteriormente degli approcci basati sulla funzionalgenomica. Grazie mille.