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Gene Eredità, Mappatura e Comapplicazione

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Quindi, supponiamo di aver individuato o abbiamo isolato un mutante particolare che ha qualche difetto di sviluppo o qualche fenotipo che è di nostro interesse poi come moveahead.Quindi, il passo successivo quello che facciamo o quello che facciamo è che analizziamo per la prima volta la natura dei mutanti. Che tipo di mutanti è, qual è il suo schema di eredità?Perché stiamo usando l'approssimazione basata sulla genetica .Quindi, è molto importante per noi sapere se la mutazione è ereditabile in natura o non è questa la prima domanda. Ci sono alcune mutazioni che se sono nella linea germinale possono essere ereditate alla generazione successiva, ma se è nei tessuti somatici se sono le mutazioni somatiche scompariranno nella generazione successiva. Ma per noi capire di più nella deTAIL per stabilire i mutanti adatti è importanile avere mutanti ereditabili. La prima cosa e poi seconda cosa facciamo?Cerchiamo di identificare, se è ereditabile qual è il suo modello di eredità, segue la legge Mendeliani?Così, lei avrebbe studiato nel suo corso base di genetica che Gregor Johann Mendel ha emanato tre leggi di eredità come un particolare geni o mutanti genetici si stanno ereditando nella generazione.Così, se i mutanti sono ereditabili in una moda che può essere giustificata o che può essere esplorata dal processo di Mendel o dalla legge Mendeliana o se non seguono poi quel tipo di eredità non è l'eredità Mendeliana. Saremo interessati ad avere Mendelian modo di ereditare che rende la nostra vita facile studiare la biologia dello sviluppo vegetale.Ma se è ereditabile e supponiamo che segua lo schema di Mendel'sheritance, allora guardiamo e analizziamo qual è lo schema di segregazione o quello che è il modello di heritance, è il mutante dominante nella natura semi dominante nella natura o recessiva; prima le cose: se ricordate l'ultima classe o se ricordate l'ultima classe, quello che abbiamo scoperto che in questa tecnica c'è la possibilità di avere mutazioni multisito .Così, ci piace anche sapere se la mutazione o il fenotipo è a causa di una mutazione dell'asingle o è a causa di una mutazione dell'ordine più elevata ipotizziamo il doppio mutazione. La doppia mutazione significa che c'è la possibilità che ci siano due mutanti in due indipendentgeni o e il risultato di questi due mutanti potrebbe dare il fenotipo. E se questo è il caso allora cosa succede, come si segregano, segregano in modo indipendente?Quindi, c'è una prima possibilità dove c'è una due mutazione ma sia il locus mutante o boththe; entrambi i loci si segregano in modo indipendente o si segregano insieme; la cosegregazione.Così, prima cosa vorremmo escludere tutta questa possibilità con il nostro interesse ormutante di interessi. Così, per prima cosa facciamo come ho detto che ereditabile o non ereditabile. I mutanti se mutanti sono ereditabili, poi se raccogliete i semi dai mutanti andateci alla generazione successiva, nella prossima generazione otterrete il fenotipo, ma se i vostri fenotipi stanno scomparendo dalla generazione successiva allora la vostra mutazione è non ereditabile. Un'altra cosa importante se la vostra mutazione è ereditata a Mendeliano, allora cosa vi aspettate?Vi aspettate un risultato a seconda del fatto che cos' è la vostra mutazione iniziale, se la vostra mutazione iniziale è lasciateci assumere eterozigoti. Heterozygous significa per ogni cromosoma che abbiamo un paio di cromosoma coppia di homologouschromosome.Quindi, supponiamo che questo sia un gene in cui c'è una mutazione qui di seguito. Quindi, se la mutazione è in un solo allele o un loci o nell'unico cromosoma omogeneo andmutazione non è presente nel corrispondente locus di un'altra condizione di cromosoma omogenea si chiama eterozigote. In condizione di homozygous cosa succede che ci si possa aspettare che la mutazione sia presente atsia allele, qui oltre che qui, qui non c'è mutazione .Quindi, se la tua mutazione è eterozigote, allora puoi andare alla generazione successiva e cercare il modello di segregazione e dipende da cosa è la natura della tua mutazione, se è una dominante allora ti aspetti un altro rapporto genotipico e fenotipico e se è recessivo allora ti aspetti un diverso schema di rapporto, quale sarebbe quel rapporto che vedremo alla prossima slide. Ma un'altra possibilità è che se non segue il modello Mendelian dell'eredità, qual è lo schema di eredità?Ci sono molti casi che si sono trovati naturalmente oltre che indotti che arenati seguendo lo schema di eredità di Mendel. Ad esempio, se la dominanza non è completa o incompleta di dominanza o se c'è un'epigenetica che non si trasmette; che non viene ereditata alla successiva generazionio i loci che fanno sesso linkato perché il sesso legato c'è una differenza dell'homozygosityis non completamente mantenuto perché un cromosoma è x e altro cromosoma è y ok.Quindi, supponiamo che il mutante o saremo più interessati o saremo più felici di avere un mutante che sia seguendo il modello Mendeliano di eredità. Se segue il modello Mendeliano di eredità, allora quale potrebbe essere la naturetra mutanti?Quindi, per prima cosa è che se il tuo mutante è dominante e se hai un locide eterozigote i mutanti puoi aspettarti che ti aspetti un fenotipo anche nella natura eterozigote, ma se la tua mutazione è recessiva in natura allora il solo fastidio di oneloci non è sufficiente a dare il fenotipo. In questo caso devi avere una mutazione sia nei loci genetici che se questo è il casethen vedrai il fenotipo - Così, il tuo fenotipo sarà solo se hai mutazione sia nel cromosoma omologo che questa è la condizione chiamata condition.homozygous condition.Quindi, cosa succede?Allora, come studiare questo?Quindi, prendi questa pianta mutante vegetale e vai alla generazione successiva. Nella prossima generazione supponiamo che la tua pianta mutante sia eterozigote. E se è eterozigosa se la tua muta se la mutazione è dominante avrà già il fenotipo, ma se è recessiva allora il tuo impianto mutante non avrà fenotipo, butif che vai alla generazione successiva che hai intenzione di diventare eterozigote e homozygouspopolazioni nel rapporto di 1 è a 1 e se come ho detto se è dominante ti aspetti che questi 3 siano il mutant.Quindi, il tuo rapporto fenotipico sarà di 3 mutanti e 1 wild type, ma se la tua mutazione è recessiva in natura poi solo questo homozygous che è come il 25% della popolazione totale sta per avere il fenotipo mutante e se si quantifica il numero di mutanti nella generazione thenext si può dire se il vostro mutante è dominante o recessivo in natura. Un'altra condizione ciò che accade è il semidominant.Quindi, in condizione di mutante semidominante ciò che accade di avere tipo selvatico, eterozigote e homozygous.Now, l'eterozigote e l'omozigote in caso di mutante mutante dominante hanno uno stesso fenotipo. In caso di mutanti recessivi solo l'omozigote hanno un fenotipo, ma in caso di mutanti semidominanti l'eterozigosa e l'homozygous entrambi avranno un fenotipo, ma la severitàdel fenotipo sarà più nel caso un omozigo.Così, si ha una gamma di fenotipo in questo caso. Un altro caso come escludere: supponiamo che la vostra pianta originaria o quella mutante sia omozigosa. Se entrambi i loci sono mutati. Se entrambi i loci sono mutati, poi la prossima generazione se vai alla generazione successiva tutti i plantari daranno il fenotipo; tutti i mutanti. Qui è molto difficile raccontare qual è la natura del vostro mutanti, che sia isdominante o recessivo non importa perché questo entrambi i loci sono mutati, quindi non voleranno segregate.Così, per escludere la possibilità che dovrete fare una croce dorata per generare heterozygous.Così, prenderete questa pianta di mutante omozigote e generatea F 1 che avrà un solo locus mutare un altro locus come tipo selvatico. Questa è una pianta eterozigosa per la prossima generazione.Se è dominante, se la vostra mutazione è dominante vi aspettate che il 3 sia a 1, 3 mutanti 1 tipo selvatico, se è recessivo allora si si aspetta che lo stesso rapporto 3 sia a 1, ma qui mutante sarà 1 e dominantmutante sarà il 3, ma se si tratta di un caso semi - dominante che ti aspetta il 1 è a 1.So, il 1 sarà puro tipo selvaggio assolutamente normale, il 2 avrà un qualche fenotipo, ma essenzialmente questo sarà il fenotipo, ma la gravità sarà different.Così, guarda qui questo è un caso di mutanta.Quindi questo è un caso di tipo selvaggio e questo è omozigote. Se si confronta il tipo selvatico e l'omozygous look la gravità fenotipica questa pianta è molto piccola, le foglie sono molto piccole, sono molto difetti, ma se si guarda la popolazione F1 che è sostanzialmente eterozigo; l'eterozigosa è la gravità del fenotipo è l'intermediate.Quindi, è meno che il tipo selvatico, la crescita è inferiore al tipo selvaggio, ma più grazie mutant.Così, si tratta di una sorta di fenotipo mutante semidominante. Per questo, ciò che analizzeremmo con questo mutante è se la mutazione sia mutazione singlesite o mutazione multipla. Come possiamo fare?Possiamo farlo per semplice fare il cross.Quindi Mendelian cross.Quindi, supponiamo di avere una due mutazioni; una è un e un altro mutante è b in geneb e avrai un tipo selvatico e poi hai mutante. Presupponiamo che il fenotipo sia a causa del doppio fenotipo mutante e tu se fai questo tipo di croce vai alla generazione F1 e guarda il fenotipo questo è un tipo selvatico questo è un mutante e vai a guardare le piante F1, questo ti dirà se il tuo mutante è dominante o recessivo. Se le tue piante F1 hanno già il fenotipo che significa che i tuoi mutanti sono dominanti, se la tua pianta F1 non visualizza nessuna fenotipo che significa che i tuoi mutanti sono recessivi. E poi vai a fare una croce vai alla generazione F2 e ora dipende da quale sia il modello di segregazione di entrambi i loci. Se la segregazione di entrambi i loci è totalmente indipendente e se la mutazione è a causa della mutazione sia del loci che del loci, allora si aspetta un rapporto tipico 3; il 9 è a 3 è a 1, il rapporto fenotipico che scegliamo sempre quando si fa una croce diibrida; Mendelian diibrido cross. E in questo caso questa popolazione il 1 questa è la popolazione che sarà la popolazione che sarà homo doublehomozygous; il doppio homozygous per il mutant.Così, questo sarà un piccolo piccolo; un piccolo b; piccolo b.Quindi, se arriviamo 1 su 16 come mutante in F2 generazione, questo racconta che il tuo è un arredamento di doppio mutante sia che i mutanti siano recessivi in natura e non sono co segregatinghe sono fondamentalmente segreganti per questo motivo abbiamo questo particolare rapporto. Ma se sono geneticamente collegati, se sono co - segreganti il rapporto sarà totalmente cambiato a seconda della forza di linkage ok.Quindi, questa è l'analisi genetica preliminare che si può fare appena dopo identificare i mutanti. Poi il passo successivo sarà che si ha ha identificato il mutante, sai qual è lo schema della sua segregazione, ora la cosa più importante è identificare quali sono i loci genetici associati a questi mutanti che significa mappare le mutazioni mappando il gene. Come fare?Quindi, ci sono due approcci a seconda di quello che è che che tipo di mutanti hai generato, se hai generato mutazione puntiforme per esempio, da EMS allora noi normalmente prendiamo approcci clonali basati su mappe e se hai generato mutazione tramite la mutazione inserzionale usando T-DNA o trasposon, allora puoi fare la mappatura del gene tramite il gene tagging.Quindi, questo è fatto da qualche marker.Quindi questo è fatto da qualche marker.Quindi questo è molto importante per capire e cosa succede qui facciamo per chromosomewalking.Quindi ci sono certe cose, quindi ci sono marcatori molecolari già segnalato o peopleha identificato marcatori molecolari, ciò che sono marcatori molecolari potremmo essere noi vedremo alla slide thenext, ma questo può essere o marker basato su PCR oppure marker di restrizione della digestione. Per un'analisi veloce preferiamo il marker basato su PCR perché questo è molto veloce e poi cosa wedo, cerchiamo di analizzare il pattern di linkage e segregazione tra questi marcatori, marcatori molecolari il fenotipo ok. Un marcatore molto importante che viene preferibilmente usato sono i marcatori INDEL. Questi marcatori sono prodotti nel sito di inserzione e deletion.Quindi, sostanzialmente nei marker si possono avere due tipi di marcatori; uno si chiama nuovamente dominantmarkers e un altro è co - dominante markers.Così, marker co - dominante; quindi in caso di marker dominante ciò che accade che questo marcatore darà uno schema in un particolare background genetico e non darà una banda in un altro background genetico. Ad esempio, se si sta utilizzando PCR based, ma in co dominante sia in background che in boththe genetico, darà una banda, ma le dimensioni delle band saranno diverse. Quindi, per il nostro utilizzo o per la cosa più importante i marcatori dominanti sono ottimi markersperché in caso di marker dominante quando si vede la band è sicuro che questo sia presente, ma se non si vede la banda che non siete sicuri al 100% sicuro che l'assenza di banda sia attualità perché questo è un marcatore, potrebbe essere semplicemente un problema tecnico del PCR.Così, questo è il motivo per cui nei marcatori dominanti si vedono entrambe le fasce in entrambe le condizioni, ma in base a questa diversa dimensione si può chiaramente raccontare questo è questo background genetico, la tisi che background genetico ok.Quindi, per esempio, nella maggior parte delle piante questi marcatori sono stati ben identificati, ben accerchiati e ora la gente sa se si prende qualche esempio di Arabidopsis thaliana modello plants.So, questo è il cromosoma numero III di Arabidopsis thaliana queste sono varietà diverse di Arabidopsis Columbia, Landsberg tutto questo tipo di C 24.So, varietà diverse e quello che le persone hanno cercato di identificare, quali sono i marcatori?I marcatori fondamentalmente sono gli elementi genetici che sono diversi in due varietà.Così, per esempio, se si guarda questo è Columbia, quindi la Columbia è stata presa come referente referente e se si guarda che la LER, quindi, qui se si guarda questo è, quindi c'è una differenziazione. Così, la Columbia ha una differenza diversa nel loci genetico con il LER e si canta questa regione e se si progetta un primer specifico per questa regione, allora quel primer cantastico sa distinguere se si tratta di sfondo Columbia o è LER background e quel tipo di marcatori si potrebbe usare per identificare se una particolare regione di un cromosoma proviene dallo sfondo della Columbia o dallo sfondo LER. Questi sono alcuni nomi di questi markers. Ad esempio, se si guarda a causa di qualche inserzione alcune cancellazioni c'è una differenza, quindi la tisis NGA59.So, questo è il nome di un marcatore in questo caso hai individuato una regione in cui c'è una differenzience.Così, per esempio, in questa regione se si confronta questo e questo è base pair.Così, questo è 110, questa è 141, quindi differenza è 30 nucleotidi che significa che a Columbiao c'è una cancellazione di 30 nucleotidi in questa particolare regione o in Ws4 c'è questa inserzione di 30 nucleotide.Quindi, se si guarda qui, quindi cosa succede?Se prendete il genoma Columbia così, qui c'è una regione e se prendete il genoma correspondingWs4 qui è una regione, ma c'è un piccolo inserzione.Quindi, se progetta un primer qui, se progetta un primer qui e se dici primer qui andqui, cosa riceverai da sfondo Columbia?Otterete questa dimensione di banda che è di 111 e da questo sfondo si goda per ottenere this.Quindi, questo è il 111 più questo inserto nucleotidico 30 che è 141.So, se prendi questi e se corri il gel, cosa puoi aspettarti?Un'altra cosa importante che ci si può aspettare qui di seguito. Quindi, supponiamo che un loci genetico sia solo Columbia, poi se usa questo marcatore hai intenzione di ottenere 111 coppia di coppia base. Se questo loci è heterozygous one loci è Columbia e un loci è Ws e se usi qui thencosa stai andando a prendere una banda di 111 da thisWs4 loci stai andando a prendere una banda di 41 e se hai un loci genetico che è per questa regione che è omozigote per Ws4 e se usa lo stesso primer fai solo gocce di una banda di 141 nucleotide.Quindi, se si corre sulla gelo si può vedere chiaramente questo tipo di pattern, se è omozygousfor Columbia poi state andando a prendere una banda di queste dimensioni, se è eterozigosa per Columbiaand Ws4 state andando a prendere una banda di queste dimensioni e una banda di questo size.Così, questo viene da un locus, questo viene da un altro locus, ma se è homozygousfor Ws4 allora si va a prendere solo una banda di 141 pair.Quindi, basta guardare questo modello di banding e guardare questo set di primer che si può clearlydistinguere quello che è il loci genetico sul cromosoma numero 3 o da qualche parte qui dove si trova questo marcatore è located.Quindi, questo marcatore ad esempio, si trova sul cromosom.Così, così l'intera mappa genetica è stata preparato per tutti i cromosomi e largenumber di marcatori molecolari è stato identificato. Se dobbiamo mappare un gene, allora cosa si può fare?Puoi semplicemente scegliere questi geni e mostrare associazione e guardare la loro segregazione con il tuo mutant.Quindi, cosa fai praticamente?Supponiamo di avere una pianta mutante che è in background Columbia e ho capito che questa pianta questo mutante è recessiva in natura, segue Mendelian modello di segregazioniche significa che se prendo eterozigote di questo e vai alla generazione successiva in F2 mi aspetto che il 3 sia a 1 rapporto e 1 questo rapporto 25 piante percent mutant.Così, se prendo questa pianta e pianta mutante e croce con tipo selvatico, mutante è Columbiabackground se prendo Ws4 di fondo. E se li incrocio quello che mi aspetterei?Nella generazione F1 sto generando eterozigoti. Heterozygous significa mezzo set di genomi che arrivano da sfondo Columbia un altro halfset di genomi sta arrivando da sfondo Ws4 questo è eterozigo.E poi se li permetto per altruismo e vado alla prossima generazione ci sarà una lottizzazione che attraversa in qualche cromosoma 1, qualche cromosoma 2 e praticamente quello che è doingche c'è la fusione del genome.So, se vai alla generazione successiva e vai alla generazione F2 i genomi di Columbiae Ws4 saranno totalmente uniti e potrai trovare una regione diversa tipo di possibilita ' puoi trovare un cromosoma come questo, potete trovare il cromosoma come this.Quindi, qualsiasi possibilità qualunque possiate immaginare di poter trovare qui nella generazione F2, butta ciò che una cosa stiamo facendo, allora prendiamo questo plant.Quindi, supponiamo di aver preso 100 piante da qui dalla popolazione F2 e anche qui; quindi da questa F2 popolazione.Così, il 25% della pianta che sarà come lasciarci assumere circa 25 plantsesse sarà il mutante, mostreranno i fenotipici, cosa significa che per questo mutante dalla mia mutazione arriva dal backgrounde questa mutazione è totalmente assente nello sfondo Ws4 che significa che in questi 25plants il locus dove questa mutazione sarà omozigote per Columbia.Perché questo sarà omozigote per la Columbia?Perché se sarà omozigote allora e solo allora avrà il fenotipo. Visto che ha un fenotipo significa che si tratta di un omozigo; homozygous per la mutazione. E dato che la mutazione arriva solo dalla Columbia che significa che la regione dove c'è una mutazione sarà solo dalla Columbia e non ci sarà una regione dal Ws indetto one.Ora, se prendete tutti questi 25 piante mutanti con il fenotipo mutante e controllate per il cromosoma teirvico, supponiamo che ci siano 5 cromosomi tipicamente in Arabidopsisand se misuro un cromosoma qui un marcatore qui; un marcatore qui; un marcatore qui; un marcatore qui faccio l'uso di questo Marker molecolare a base di PCR per regione diversa. E supponiamo che il mio sito di mutazione sia da qualche parte qui allora quello che mi aspetta?Se prendo questa pianta da 25, così i miei mutanti sono fissati qui di seguito, questo locus è omozigote per la Columbia in queste 25 piante non sto parlando aboutremaining 75 piante potrebbe esserci qualcosa di diverso, ma in questo 25 piante che clearlymostra il fenotipo questo locus è omozigote per Columbia.Now, se guardo; quindi in queste 25 piante questa sarà questa regione sarà la Columbia, ma altra regione può essere qualsiasi cosa come per il Mendelian schemn.So, se guardo questa regione o se controllo questa regione in questa pianta del 25, cosa mi aspetto?Mi aspetto uno schema di this.Quindi, su queste 25 piante il 25% di questa popolazione sarà wild type per Columbia; 25% di questo potrebbe essere wild type for Ws e 50% di questi possono essere heterozygousper Columbia e Ws, questo è uno schema tipico Mendelian qui di seguito, cosa faccio?Io controllo diverse regioni del cromosoma e se ho trovato sul cromosoma contattaci il cromosoma numero 1 tutti e tre il marcatore mostra un assortimento indipendente rispetto al tefenotipo, se stanno dando 1 è di 2 rapporto per questi marker che significa che la mia mutazione non è presente in questo gene in questo cromosom.Analogamente, si esclude questo cromosoma; si esclude questo cromosoma. Ma una volta che raggiungerete questo cromosoma e se la vostra mutazione è qui, se si guarda qui un marcatore che è presente qui dal momento che questo è lontano dal sito della mutazione c'è ancora la possibilità che ci sia una traversata sopra gli eventi qui. Ma una volta che iniziate a muovervi si chiama chromosome walking, se controllate qui potreste stillare 1 è a 2 è a 1 segregazione per questo marcatore in questa 25 piante, ma una volta che sarete saliti più vicini al sito di mutazione in questa direzione o da questa direzione, ciò che vi aspettate. Il tipo selvatico Ws inizia a diminuire, poi ci sarà una deviazione che non ci si può aspettare 1 è a 2 è a 1 e poi se ci si avvicina; più vicini e supponiamo di ipotizzarlo se si guarda questo marcatore questo potrebbe essere presentatissimo o molto vicino alla vista della mutazione. In tutti questi 25% c'è la possibilità che possa essere solo eterozygousor solo omozigote per la Columbia e poi se scendi; vieni giù ci sarà un punto in cui tutte le piante avranno solo Columbia genome.So, allora potresti avere una condizione in cui il 100 di queste 25 piante avrà homozygousColumbia e non hanno nessun genotipo per Ws questa è chiamata la tua mappatura window.Quindi, ora, noi facciamo da questa direzione continuiamo a mappare e abbiamo scoperto che qui c'è un markerche è il 100 di Columbia, ecco il marcatore che è 100 Columbia, ora questo è il mio window.Now, so che la mutazione è da qualche parte in questa finestra. Se vuoi andare oltre e affinare questa mappatura, allora dovrai aumentare il thenumber di piante mutanti questo non è possibile con 25 piante, puoi percorrere 1000 piante in più, more.E poi puoi fare la raffinata mappatura e puoi fare, ma questi giorni da quando siamo nell'era genomica, la maggior parte delle piante modello vegetali il loro intero genoma è stato sequenziato, ora nelle diverse varietà di quelle piante è stato dato sequenziamento e ora sequenziare non è più molto costoso o molto tempo consumare process.Così, noi può prendere questo mutante e andare a sequenziare tutto il sequenziamento del genoma intero. E allora perché abbiamo fatto questa operazione di mappatura grezza, perché abbiamo fatto questa mappatura grezza perché questa intera pianta è stata esposta con l'EMS.So, c'è la possibilità che ci sia un gran numero di mutazioni puntigliate nel genoma, ma dobbiamo scoprire quale mutazione è in realtà responsabile del fenotipo, l'allmutazione potrebbe non essere responsabile del fenotipo. E poi se abbiamo già definito questa finestra, allora possiamo solo guardare quali sono le mutazioni in questa finestra e poi una per una puoi escluderti a seconda della tua conoscenza se qualcuno si trova nell'inter nella regione intergenica che possiamo escludere. Allo stesso modo si può segnalare e si può trovare può essere una mutazione di punto o due mutazioni punte in questo gene che potrebbe avere il fenotipo rilevante. Poi possiamo prendere nel passo successivo e validare che in realtà questo mutante è responsabile fori fenotip.Così, questo è quello di mappare una mutazione di punto mentre la mappatura del sito di inserimento di T-DNA è relativelenica ed è stato fatto con le diverse vie.Un modo per farlo si chiama TAIL PCR.In TAIL PCR cosa fai?Da quando, questa regione di T-DNA che hai ingegnerizzato, quindi, conosci la sequenza, puoi progettare alcuni primer per questo esempio T-DNA.Ad esempio, SP 1 primer, SP 2 primer, SP 3 primer e lasciaci assumere questo è integratednel genoma e questo potrebbe essere il genoma dell'impianto e quindi, questo primer praticamente questo è più gentile di primers.Così, può legare in una o hai una sorta di pool di primers.So, potresti trovare un primer che potrebbe legare qui e questo primer se si esegue prima primaryPCR con SP 1 è possibile arricchire questa amplificazione, poi si usa un altro primer continua ad arricchire e se fai una combinazione di primer potresti amplificare questa regione, la regione fromqui fino a qui. E poi prendi questo PCR prodotti amplificati, clicca in un vettore come fare la clonazione hai studiato da qualche parte, prendi questo frammento di PCR e clone in un vettore di clonazione questo è il tuo frammento, in frammento hai un po' di DNA vegetale genomico e qualche regione di T-DNA.Now, hai qualche sito di binding di primer qui di seguito da qui e identificare quale nucleotidesequenza proviene dalla pianta e poi puoi fare, puoi controllare questo vai al websiteyou giusto provare qual è la sequenza e dove questo è posizionato nella pianta in modo da poter mappare che cos' è il sito di inserimento. Un altro modo di mappare è il soccorso plasmizzato. Qui cosa si fa?Quando si ingegna il tuo T-DNA hai messo un'origine di replicazione per i batteri. Sai che se l'origine della replicazione è presente, allora questo DNA se è innatura circolare può propagarsi nei batteri. Prendi questo ci fa ipotizzare che questo T-DNA sia integrato nel genoma vegetale uso qualche enzimasite.Quindi, assicuriamoci che questo sito enzimatico non stia tagliando nel T-DNA.So, se usi un sito di restrizione potrebbe arrivare qui; qui; qui; qui; qui ovunque nel genoma della pianta e poi quando digrignerà usare questo frammento e si può rilegare it.Così, la ri - legazione genererà un questo tipo di molecola dove avrete a T - DNA come ad una frazione di pianta genomica DNA.Dalla, avete origine di replicazione questo è una sorta di vostro plasmide che trasformate i batteri E. coli e nei batteri può propagarsi, estrarre il plasmide andsequenza utilizzando primer specifici di T-DNA e poi potete identificare quali sono le sequenze appena affiancate al T-DNA e potrete identificare il locus ofintegration. Terzo modo di fare identificare il sito di inserimento è inverso PCR.In inverse PCR ciò che fate?Praticamente si sceglie un sito di restrizione del sito che taglia almeno una volta nel T-DNA e da qualche parte nella DNA.Quando si digerisce si conosce la sequenza in cui si taglia, hai progettato un primer whichis specifico per il T-DNA un altro primer che è specifico per questa regione e poi si rilegalizza questo will.Quindi, hai un primer posizionato qui; hai un primer posizionato qui fai il PCR.E questo amplificherà questa regione e clonerà questa regione in un particolare vettore di clonazione e identifichi quali sono la sequenza di flanking nella T-DNA.In un'altra tecnica che siamo usando per mappare il sito di un inserzione è adattatore PCR.Adaptor PCR è abbastanza simile, ma quello che facciamo è digitare con l'enzima di restrizione e poi alla fine quello che fai compilare questo fine a seconda di quale tipo di enzima si stia utilizzando l'uso di blunt enzima, enzima adesivo, ma poi anche quello che si fa?Si aggiungono alcune molecole di adattatore a entrambe le estremità di queste molecole. E quando si aggiungono queste molecole di adattatore da quando si conosce la sequenza dell'adattatore è possibile disporre di primer specifico per la sequenza dell'adattatore, si conosce la sequenza T - DNA, è possibile designare un altro set di primer e si può fare l'amplificazione PCR, prendere questo frammento, clone andsequence.Quindi, è possibile identificare quale sequenza è e dipendere da questo si può posizionarlo nel genoma; nel genoma vegetale ok. Come ho detto che questo è stato molto usato e molte linee transgeniche si sono apprese in Arabidopsis è depositata nella database.Ora, semplicemente basato sul tuo fenotipo mutante o se vuoi identificare i geni o se vuoi identificare i geni che vuoi identificare semplicemente quei mutanti e se ordini i mutanti sai che c'è una mutazione e sai che c'è l'inserzione aT - DNA, puoi semplicemente andare e fare il genotipizzazione e validare che attuallyci sia inserzione.Quindi, cosa fai per farlo?Quindi, supponiamo che questo sia il gene di interesse e si conosce il sito di inserimento becausequesto è già stabilito, sequenziato, mappato, tutto è done.Now, si progetta un primer nel gene, primer e primer inversa appena fuori theflanking region of the T-DNA e se si fa la combinationof PCR.Quindi, un PCR si fa usando il gene specifico in avanti e inverso e un altro PCR si dona un primer specifico di T-DNA. O con questo a seconda dell'orientamento o questo con il, dipende da quale orientationquesto T-DNA è stato inserito. Se il T-DNA è inserito in questo orientamento poi vorreste usare questo primer con thisto hanno amplificazione, se è in orientamento opposto in questo orientamento allora la vostra posizione primer cambierà e poi vi piacerebbe verificare con questo, ma cosa è importanlì. Così questa band vi avreste solo se la vostra copia genomica è di tipo selvaggio e non vi è inserzione e questa banda che otterete solo se c'è un inserto T-DNA youwill non arriverà sul genoma del tipo selvatico.