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Esperimenti di microscopia
  Ciao a tutti, questo è il dottor Vishal Trivedi da dipartimento di bioscienze e bioingegneria IIT Guwahati. E in questo modulo stavamo discutendo della biologia cellulare così come stiamo discutendo sugli strumenti microscopici disponibili per eseguire i diversi tipi di esperimenti. Così, ora, nella lezione di oggi, discuteremo dei diversi esperimenti che cosa si può eseguire con l'ausilio della microscopia. E ho cercato di fare un problema come le situazioni così, che si capirà in base a quale tipo di problema si possa essere in grado di utilizzare la microscopia. Allora, iniziamo la discussione sul diverso esperimento quello che si può eseguire con l'ausilio delle diverse tecniche di microscopia. (Riferirsi Slide Time: 01.48)Così, il nostro problema di ricerca 1 è molto semplice che gli scienziati hanno scoperto una nuova fitochimica bioattiva dall'albero di neem. Così, conosci l'albero di neem e ora, vuole testare il suo effetto sulla propagazione del parassita della malaria. Quindi, quello che vuole chiedere è che abbia effettivamente isolato una nuova fitochimica bioattiva e ora, vuole testare se sta inibendo la propagazione del parassita della malaria o no?Così, si sa che il parassita della malaria ha causato una malattia chiamata malaria. E se si va con il piccolo background, si sa che il parassita della malaria richiede i 2 host, uno è l'ospite invertebrato e l'altro è l'ospite vertebrato. Così, nell'ospite invertebrato, si ha la zanzara che in realtà si lega all'altro ospite vertebrato, per esempio gli umani, ed è così che va in realtà da un corpo a un altro corpo. E all'interno dell'ospite invertebrato hanno un ciclo di vita completo attraverso il quale i gameti si fonde l'uno con l'altro per produrre l'ovulo. E questo è tutto quello che in realtà stanno producendo i merozoo e poi i merozoiti sono così, è così che stanno producendo gli sporozoiti e questi sporozoiti sono stati effettivamente iniettati dalla zanzara all'essere umano, e questi sporozoo in realtà vanno nel fegato. E poi completa il suo ciclo di vita all'interno del fegato per generare i merozoiti e questi merozoites poi infetta i RBC's per formare le diverse fasi e tutte le tappe ciò che è presente nei panni RBC sono chiamati come i cicli di vita degli anopheli. (Riferirsi Slide Time: 03.33)Così, all'interno del ciclo di vita degli anopheli, si hanno le diverse fasi come ho detto, si sa, quando i merozoiti stanno uscendo dal fegato, si stanno ottenendo i merozoiti e questi merozoites stanno effettivamente infettando il RBC e poi sta causando che sta formando la prima fase che viene chiamata come tappa ad anello. Quindi, questo è il tipico stadio di anello che si vede dopo appena i mirozoiti entrano nei panni della RBC.Quindi, perché si chiama come anello d'anello perché sta avendo un anello come apparenza dove il nucleo è all'angolo e poi viene distribuito il citosol. E poi l'anello di scena si sta trasformando in fase di trofozoite e poi il trofozoite è in realtà convertirsi negli schizonetti e gli schizonetti stanno rilasciando in realtà i nuovi merozoiti e questi nuovi merozoiti stanno nuovamente infettando i nuovi RBC. Quindi, se si vede il ciclo di vita, quello che vedrete è che i merozoiti stanno infettando i RBC e questi RBC si trovano poi formando il palco dell'anello e dopo le 10 ore la fase ad anello viene convertita in fase di trofozoite e poi dal trofozoito sta causando in realtà la produzione degli schizonetti. E poi dagli schizonetti sta di nuovo rilasciando di nuovo il così, una volta che i RBC che contengono gli schizonti stanno andando a bucarlo, in realtà rilasceranno questi merozoo. E poi questi merozoo stanno effettivamente per infettare la nuova serie di RBC. Quindi, quello che vogliamo davvero sapere è che se effettivamente trattiamo il parassita o se trattiamo questa particolare cultura con i fitochimici, quindi, se effettivamente completerà il suo ciclo di vita o meno. (Riferirsi Slide Time: 05.19)Così, il design sperimentale è molto semplice il design sperimentale è che si possono davvero prendere i parassiti della fase ad anello, e poi si è incubati che con i fitochimici e si chiede se sta inibendo la propagazione o la trasformazione del parassita della fase ad anello per raggiungere i parassiti della fase di schizonatura. Quindi, tipicamente, quello che devi fare è che devi solo prima produrre l'anello infettati RBC con l'aiuto delle sincronizzazioni.E poi si incuba che con l'aiuto della crescente concentrazione della fitochimica o delle molecole di prova. E poi si incuba che per un po' di tempo e poi dopo che in realtà si va a fare una smeggiante dopo 34 ore per vedere se l'anello è maturo per darvi la fase di schizont, perché in base alle normali circostanze, effettivamente completerà il suo ciclo di vita ed è così che, in realtà, vi darà gli schizonetti entro le 35 ore. Se volete studiare le reinvasioni, allora fate di nuovo smeggiare dopo 72 ore e che in realtà vi dirà se il vostro composto sta avendo anche un effetto sulle reinvasioni; reinvasione significa, gli schizonetti rilasceranno i merozoiti e questi merozoiti sono se infettate i nuovi RBC o meno perché è così che vi darà la nuova tappa ad anello. Si può anche chiedere se il composto è il parassitotologico o il parassicida che significa se il composto sta uccidendo il parassita o se sta semplicemente fermando la crescita dei parassiti che si può fare semplicemente con la rimozione della droga. Quindi, quello che si può fare è trattare il parassita per le molecole di droga o la molecola di prova per qualche tempo, e poi dopo, si può eliminare il parassita e mantenerlo nei supporti freschi e lasciarli propagandare. Quindi, se il parassita è morto, non si propagherà nei media freschi, ma se è solo, si sa, fermando la sua crescita, il che significa che è ancora in diretta allora comincerà a fare la crescita. Ecco, questo è quello che devi fare quando basta togliere il farmaco, lavare la cultura del parassita e poi metterla in un nuovo supporto e poi se prepari lo smear dopo 72 ore. Se si vedono i parassiti vitali, allora effettivamente si va a dire che il composto quello che si sta testando è il parassitotatico in natura significa che sta fermando la crescita del parassita, ma non sta uccidendo il parassita. Ecco, queste sono le 3 domande a cui si può chiedere con l'aiuto di questa analisi a base di microscopia dove quando si può dire se il composto sta uccidendo il parassita o meno, se il composto sta inibendo l'evento di reinvasione o meno e se il composto è parassitotatico o antiparassitario. (Riferimento Slide Time: 08.13)Così, per eseguire questi esperimenti, si richiede ai media come i media della coltura cellulare RPMI 1640, che richiediamo alla cultura il parassita della malaria poi si richiede l'albumax 2 che è in realtà una polvere che effettivamente acquisisce per la propagazione del parassita della malaria, si richiedono i filtri da 0,22 micron, si richiedono le unità di filtrazione per preparare i supporti che richiedono l'autoclave, si acquisisce le pompe per vuoto. E poi hai richiesto il microscopio in verticale così, che puoi essere in grado di visualizzare i parassiti dopo le diverse fasi come se riesci a visualizzare dopo 34, 35 ore o 72 ore o dopo la rimozione del farmaco, puoi essere in grado di visualizzare il microscopio visualize il parassita con l'ausilio dei microscopi upright.  Così, nel passo 5, usando che si può calcolare il IC50 che significa concentrazione inibitoria 50 di quel composto. Così, il numero di schizont contenenti RBC di s sono staticontati contro ciascuna concentrazioni i dati di inibizione della schizont da cui gli assaggi di inibizione degli invitati schizont sono stati alimentati in fogli di excel pre - programmati appositamente. Quindi, è possibile effettivamente essere in grado di calcolare utilizzando questo foglio excel che è stato disponibile da questo particolare sito. Quindi se metti tutto quello schizont contenente le cellule e lo metti in questo particolare foglio excel, lo sai, automaticamente sta per tracciare la curva e ti racconterà il IC50 così come il IC90, e tutti gli altri tipi di parametri. Si può aggiungere il clorochinino come controllo positivo e che in realtà vi darà la fiducia che l'assaggio funzionasse. E non c'è che tu sappia, i difetti o non ci sono problemi con il setup dell'assaggio stesso a determinare la natura dell'azione, ad esempio il parassitotologico o il parassitotologico funzionamento parassitotatico significa che hai conosciuto, il nostro anello contenente parassita. Quindi, quello che farete è che aggiungete il composto. Quindi, se aggiungete il composto quello che accadrà è che in realtà vi coglierà la crescita di quella, particolari parassiti. Quindi, che si stia sequestrando perché il parassita è saper non ricevere abbastanza nutrizione e nel sapere il composto è alquanto interferente con i percorsi biochimici e quindi, si decide che ci si faccia sapere ridurre le attività metaboliche e rimanere come si conosce stadio dormiente. Così, in quel caso il parassita sarà rimandato alla vita, ma non crescerà in realtà, perché per la crescita richiede tutti quei percorsi metabolici per essere in uno stato attivato. L'altra condizione è che in realtà si sta contenendo il saper, convertendo il parassita in un anello contenente parassita, ma questi anelli sono in realtà i morti. Quindi, se sono morti, allora non ti daranno lo schizont qualunque cosa tu faccia in realtà, ma sono in diretta e se rimuovi il composto, che poi è in realtà ti daranno lo schizont, il che significa che possono completare il loro ciclo di vita. Quindi, se sono in grado di conoscere la vita e saranno in grado di completare allora il composto verrà chiamato come il parassitotologico che significa che in realtà inibisce solo la crescita del parassita, ma se sta convertendo il parassita a un parassita morto, lan il parassita mortonon completerà il ciclo di vita ed è così che in realtà si chiamerà come il parassicida che vuol dire che ucciderà il parassita. Quindi, per stabilire che quello che devi fare è in 100 microlitri volume 3% ematocrito con 1% parassitemia sono stati esposti al composto di prova per 48 ore dopo 48 ore il parassita è stato lavato due volte con supporti completi in modo da poter rimuovere i composti e poi incubare per altre 48 ore in un supporto gratuito per la droga. Così, una volta che lo tenete in un media senza droga, in realtà saranno liberi di sapere crescere se sono in diretta, cresceranno se sono morti, non cresceranno. Quindi, allora si preparerà una smear e la parassitemia può essere determinata con il microscopicamente anche come abbiamo discusso come si prepara uno smear, poi si contano le 1000 celle, che significa i 10 campi in realtà e se si contano le 1000 celle, in realtà vi darà la cifra statisticamente significativa di quanti sono presenti RBC infettati e in questo modo si sta effettivamente andando a determinare la parassitemia. Quindi, questo è tutto su un problema in cui abbiamo usato la microscopia leggera e abbiamo effettivamente stabilito l'attività anti malarica di un composto di prova che si può modulare le spine di assaggi e si può essere in grado di usarlo anche per qualche altra applicazione. Ad esempio, anche se vediamo di cosa abbiamo discusso, abbiamo discusso del parassita della malaria, ma se volete cambiare le condizioni. E si desidera utilizzare i microscopi, è possibile modificarlo di conseguenza. Ed è così che si può essere in grado di utilizzarlo anche per lo screening del composto anche per altri assaggi. Ad esempio, è possibile utilizzare la versione anche leggermente derivata e si può essere utilizzati alla microscopia per misurare se, si sa per anche per le cellule tumorali e tutti gli altri tipi di cellule, se le cellule sono in crescita o meno. (Riferirsi Slide Time: 23.29)Ora, discuteremo di problemi di ricerca 2 così, nel problema della ricerca 2, gli scienziati stanno diffondendo abitualmente le cellule dei mammiferi e ora, quello che ha fatto lo scienziato, ha sviluppato un nuovo mezzo, il che significa che ha sviluppato un nuovo supporto per le proliferazioni cellulari. Ora, quello che vuole, vuole progettare un esperimento per contare il numero di cellule vitali e il numero di cellule morte che significa, ha sviluppato un nuovo media. E ora, quello che vuole è lui da quando vuole mettersi alla prova se questo media è abbastanza buono, visto che era già stato stabilito mediamente rispetto ai media afferenti e se il numero di cellule vive o morte sono più o meno nel caso di quando utilizziamo questo particolare nuovo media per le propagazioni. (Riferimento Slide Time: 24:21)Così, il design sperimentale è molto semplice si va a usare un colorante che si chiama come il blu tripla così, il tripan blu è un colorante carica. E le cellule vitali escludo questo colorante alla presenzadel potenziale di membrana mentre la cellula morta sta effettivamente accumulando il colorante nel citosol. Quindi, quello che succede è che prendi le cellule o prendi la cultura in realtà, e poi se aggiungi il blu trypan quello che accadrà è che il blu trypan sarà effettivamente escluso dalla cella perché il blu trypan è un colorante carica. Quindi richiede qualche recettore o qualche altro processo attivo attraverso il quale il blu di trypan può essere ripreso dalla cellula, ma se la cellula è morta, perché la cellula sta mantenendo un, si sa, un potenziale attraverso la membrana e il colorante deve neutralizzare quel potenziale, allora solo il colorante può essere in grado di entrare, ma se la cellula è morta, quella tripla blu verrà effettivamente inserita nella cella e in realtà farà la cellula come il colore blu. Ecco, questo è quello che devi fare, se prendi le intere popolazioni di cellule, e se la macchiate con il blu trypan quello che vedrete è che le alcune cellule che non hanno preso il colorante, e le alcune cellule, che in realtà sono apparse di blu, quindi, queste sono in realtà le cellule vive, perché in realtà si contrappano all'ingresso del colorante nella cellula, perché hanno un potenziale di membrana attivo. E quel potenziale di membrana si oppone all'ingresso del composto rispetto a questo, si tratta di una cellula morta e che la cellula morta non ha l'elettrodo richiesto, il potenziale di membrana ed è così che, in realtà, permetterà l'ingresso del colorante e il colorante sta effettivamente andando ad accumularsi nelle cellule, questo è l'emocytometro che in realtà si può usare per contare queste cellule con l'ausilio della microscopia. (Riferimento Slide Time: 26:19)Così, il materiale ciò che si richiede al materiale quello che si richiede è una vetrina di vetro, si richiede un coprilabbro, si richiede un microscopio invertito con una disposizione a contrasto di fase, come si richiede una lastra di fase e poi si richiede un emocytometro. (Riferimento Slide Time: 26:36)Questi sono i passaggi multipli così, nel passo 1, quello che devi fare è rimuovere la cella dalla piastra di coltura cellulare o dalla tripsinizzazione o dal 0,5% EDTA. Quindi, questo è il passo 1, e poi si placa la piccola quantità di cellule su una vetrina di vetro e le ricopre con un coverslip poi quello che si fa è prendere il mix 50 microlitri di sospensione cellulare con i 50 microlitri di soluzioni blu trypan. Quindi, 0,5, 0,4% soluzione blu di trypan è già disponibile dai diversi venditori che si possono acquistare, e poi si riempono le camere di emocytometer, osservando la cella sotto l'obiettivo 20x utilizzando il microscopio invertito con la piastra di fase. Quindi, le cellule vitali appaiono colorate, mentre la cellula morta appare blu o il colorato scuro, l'emocytometro è posizionato sul palco del microscopio e la sospensione cellulare è contata, c'è una notch a colori V. Così, nell'emocitometro, quello che hai è al centro che hai una notch a colori V. Così, su questo notch di colore V che si può effettivamente conoscere, attraverso con quella di notch color V, si può essere in grado di conoscere, si può essere in grado di caricare l'emocytometro con le cellule, e le cellule sono conteggiate nella camera e che dà il numero di cellule in aggiunta, la cellula colorata blu può essere contata per sapere che il numero delle cellule morte.Così in questa particolare procedura, quello che devi fare è il primo che devi provare a tripsinizzare le cellule. Quindi, quando si aggiunge l'enzima della tripsina, oppure si può usare l'EDTA, in realtà si va a masticare tutti i recettori, quello che le cellule stanno usando per attenersi ai piatti, oppure in realtà distruggerà il calcio. Quindi, qualunque sia il meccanismo, le cellule si spegneranno dal piatto. E poi quello che si può fare è semplicemente miscelare i 50 microlitri della cella con i 50 microlitri di tripla blu. E poi si carica che sull'emocitometro e poi lo si mette sotto il microscopio invertito e poi si possono visionare le cellule all'interno della camera. E si può essere in grado di, insomma, contare il numero di celle blu e il numero di celle colorate ed è così che si può essere in grado di contare il numero di cellule morte e il numero di cellule vitali. Ecco, questo è tutto su una comprensione teorica di questo processo. Lasciate che vi porti al mio laboratorio e vi mostreremo tutte queste procedure e perché l'emocytometro è davvero molto, si sa, se si vede molto chiaramente l'interno della struttura, in realtà ha camere diverse, e poi bisogna fare un conteggio in queste diverse camere. Quindi, che sarete in grado di contare il numero di cellule e il numero di cellule e poi in definitiva potrete essere in grado di calcolare anche la concentrazione della cellula in ogni microlitri o numero di cellule per ml. Perché tali informazioni sono necessarie se si desidera placare un numero specifico di celle per un esperimento. Per esempio, se ricordate quando stavamo facendo il, sapete il quando stavamo discutendo degli esperimenti di fagocitosi, l'ultima volta che abbiamo detto che bisogna placare le 10.000 celle. Quindi, se vorrete placare le 10.000 cellule la prima cosa che dovete fare è che dovete mettere le cellule nell'emocitometro che dovete contare. E poi bisogna convertire quel valore in concentrazione come 10 a potenza 6 per ml o 10 a potenza 8 per ml o così via. E poi di conseguenza bisogna diluire e calcolare che quanti microlitri della sospensione cellulare dovrei assumere in modo che mi dia le 10.000 cellule per pozzo. Quindi, questo vale anche per e tutti gli altri assaggi come l'assaggio MDT e lo sai, tutti gli altri tipi di assaggio quello che fai nel tuo laboratorio dove devi fare un conteggio. Quindi, capiamo come si può fare il conteggio delle cellule e come si può essere in grado di determinare quali sono i numeri di cellule vitali che avete e quali sono le cellule morte che avete. (Video Inizia: 30:43)Ora, passiamo ai prossimi problemi. Quindi, il prossimo problema di ricerca è che il micobacterium tuberculosis H37Rv inibisce l'interazione tra la maturazione faguna e ora bisogna progettare un esperimento adatto per studiare l'interazione dei fagosomi con i lisosomi. Se ricordate, quando stavamo discutendo della fagocitosi nella nostra precedente lezione, abbiamo detto che la fagottata si forma quando una particella viene ripresa dalla cellula attraverso la fagocitosi. Così, una volta che una cellula viene ripresa una particella, come per esempio, un batterio, in questo caso, la micobacterium tuberculosis, questa particella particolare va ad essere fagocittosio con l'aiuto della pseudopodia. E poi in definitiva, sarà internalizzato. Quindi nella cosa interiorizzata quello che hai è che questo è un batteri quello che hai, ed è stato internalizzato da una struttura membranica. E questa struttura è in realtà chiamata come la fagogia. E poi alla fine quello che è successo è che si hanno i lisosomi in cella, quindi tutte le cellule immunitarie hanno i lisosomi. Allora, allora questi lisosomi effettivamente si fonde con questi faguni. E si tratta di un processo molto, molto complicato e complesso attraverso il quale la faguna interagisce effettivamente con i lisosomi e alla fine si è sviluppata e si sa, i lisosomi fusi e poi quando il lisosome è fusa, in realtà provoca il  Così, il materiale ciò che si richiede? Si richiede il metanolo e l'acetone che si richiede per il fissaggio, si richiede il PBS che è solo per il lavaggio poi si richiede il tritone X 100 che è per le permutazioni che si richiede la BSA, si richiedono i microscopi di sapere di epi-fluorescenza, si richiede che i 1 micron latex supportino i filippini e poi si richiede la rhodamina dextran così, la rhodamina dextran è un colorante fluorescente, che effettivamente vi permetterà di formare i lisosomi. (Riferimento Slide Time: 47:47)Così, la procedura ciò che richiediamo la procedura è che nel passo 1 si farà l'identificazione della faguna o la si andrà a preparare i phagosomi che potete come sapete forniti dal vostro materiale. Quindi, quello che si può fare è prendere il J774 queste sono le cellule dei macrofagi, quindi, queste sono le cellule immunitari, che si possono usare per la fagocitosi. Ecco, queste sono le cellule dei macrofagi coltivate in DMEM Media contenenti 10% FBS e 1% cocktail. Poi si rimuovono le cellule dalla piastra cellulare mediante trpsinizzazione o EDTA. Si placa le 10.000 celle su bicchieri di copertura e si incubano in un piatto ben 24 che poi si incubano le cellule nella notte, e permettono alle celle di allegare agli occhiali di copertura. Poi si lavano le cellule con DMEM poi si prepara una sospensione delle perle latex come 10 a potenza 6 perle di lattice per ml in un supporto DMEM. Quindi, quello che devi fare è mantenere un rapporto di 1 è a 10 in termini di numero di cellule ciò che hai preso e il numero di perle che hai preso. Quindi vi fornirete le 10 perle per ogni cellula da sfamare e poi rimuovete i supporti e aggiungete la sospensione alla centrifuga. E così in sostanza quello che state facendo è nel passo 1, si sta praticamente facendo la fagocitosi ed è così che alla fine si formano i phagosomes. (Riferimento Slide Time: 49:15)Così, questi sono i, si sa, il lavaggio delle cellule con questo e quello e poi si fissa il campione con l'acetone e poi si macchia con le filipine. Quindi, questo in realtà vi permetterà di identificare la fonagozza perché ovunque si andrà a vedere l'oggetto circondato da una fluorescenza a colori blu che in realtà è il phagosomes e poi si monta le cellule in sapone e si può essere in grado di identificare i fagosomi. (Riferimento Slide Time: 49:50)Poi al passo 2, si va a fare un'etichettatura dei lisosomi. Quindi, quello che fai è piatto le cellule su un bicchierino di copertura in 24 piastra ben piatto le colta con 100 microgrammo rhodamine destran nella notte in DMEM più 10% FBS più cocktail antibiotico. Quindi, quello che accadrà è quando si farà crescere le cellule in un supporto che contiene la rhodamina dextran così, la rhodamina è un colorante fluorescente ed è accoppiata con un destran. Così, il destran non è altro che un polisaccaride.Così, quello che è successo è che la cellula comincerà a mangiare questi rhodium dextran. Così, quando si mangia alla fine tutti i materiali finiscono nel lisosia perché si sa che la funzione primaria del lisosome è quella di digerare il materiale che si ha ingerito o quello che si sa, il materiale viene ingerito dalle cellule, perché in definitiva, bisogna saper digrignare tutto quel materiale, generare il materiale costituente come supponiamo digerisce la proteina, poi si genera l'aminoacido. E poi questi aminoacidi vanno forniti, alla cellula per le sue propagazioni o per la nutrizione. Quindi, qualunque sia il supporto che si sta utilizzando, si usano gli stessi supporti che si aggiungono la rhodamina dextran e che si lasciano crescere per la notte. Ed è così che la rhodamina va a finire nei lisosomi che si lavano le cellule con PBS, e poi si va a inseguire il campione per 1 ora. Quindi, quello che significa rincorrendo è che si rimuovono la dextrona rhodamina e poi si lascia crescere senza che si sappia senza rhodamine destran. Quindi, quello che è successo è che se lo fai, l'ultima goccia della rhodamine dextran finirà anche nei lisosomi perché alla fine tutto finisce nel lisosomo perché è così che la cellula ha ideato un meccanismo in modo che qualunque cosa beve o qualunque cosa mangia, finisce nel lisosoma in modo che si digerga. E si può essere in grado di utilizzare il nutriente che esce da queste digestione. Poi nel passo 3, si sta per impostare gli assaggi di fusione. Quindi aggiungete i 10 microgrammo 1 ml latex in 0,5 ml di media e spin a 1000 g per 2 minutes minuti, poi si incubano per altri 5 minutes minuti in bagno d'acqua. Quindi, quando si fa quell' incubazione in 5 minutes minuti per il bagno d'acqua, in realtà indurrà la fagocitosi di queste perle. E poi si rimuovono le perle e le lavate due volte con la PBS contenente 37 gradi celsius, i supporti vengono rimossi e fissati con la paraformaldeide poi le diaposali sono visualizzabili nei microscopi. Così, negli assaggi di incubazione, quello che farete è che avete già preparato il lisosomino in cella, poi quello che fate è aggiungere le perle di lattice a queste cellule e permetterle di fagocitare. E una volta che sono fagociti i fagosomi sono già stati formati i lisosomi sono già stati lì perché sono già etichettati fluorescentemente. E ora quello che leipuò fare è solo fare queste incubazioni per conoscere i molteplici punti temporali come si possono fare 5 minutes, 10 minutes e fino a 1 ora. In questo processo, la faguna incontrerà tutti i lisosomi e i lisosomi saranno fusi con i fagosomi. (Riferimento Slide Time: 53:18)Così, quello che accadrà quando visualizzerai queste cellule sotto il microscopio cosa accadrà è che se osservi le cellule in un campo luminoso e cercate le perle sulla cellula, quindi quello che vedrete è solo visualizzare le cellule sotto il microscopio, poi cercate le perle sotto i campi luminosi per osservare le cellule in un microscopio fluorescente con filtro UV. Se il bead ha una fluorescenza blu, come in questo caso, questo è il bead e ha una fluorescenza blu intorno che significa che questa è in realtà una faguna che si è formata già. Ora, una volta che avete visto i phagosomes allora quello che si può fare è allora che le cellule possono essere visualizzate attraverso un canale rosso. Quindi quello che si sta per fare è prima selezionare il bead cosa si desidera visualizzare sotto i campi luminosi, poi si va con il canale blu. Così, nel canale blu, in realtà vi darà una fluorescenza blu intorno e poi si entra nel canale rosso. Così, una volta entrati nel canale rosso, quello che vedrete è che questo segnale colorato blu sta avendo anche un segnale di colore rosso, il che significa, se avete il doppio segnale come se avete l'anello di colore blu, e poi se avete un anello di colore rosso intorno, il che significa che questi sono i fagosomi, che in realtà stanno avendo anche i lisosomi, che qui i phagosomes interagiscono con i lisosomi.Ed ecco come i fagosomi hanno ricevuto il contenuto dai lisosomi. Così, ecco come si può essere in grado di concludere che la fonagozza è ormai maturata, e ha formato i phagolysosomi come si sta andando ad analizzare questa tipica fagocitosi di bead rappresenterà per l'aspetto della bead nei dati di fase che significa questo e lo stesso bead saranno circondati da una fluorescenza blu dai filipiini. Se la bead ha anche un anello di fluorescenza blu e ulteriormente circondata da un anello di colore rosso indicano che i lisosomi di interazione e la faguna si sta verificando si potrebbe vedere che ad esempio si formano delle perle come ad esempio questo bead. E questo beato non ha alcun phagosomes. Per esempio, in questo caso, si vede questo è il bead, che in realtà è stato internalizzato. E si ha una florescenza a colori blu ma per questo particolare bead non si ha alcun segnale nella fluorescenza rossa che significa che questo bead sta formando solo i phagosomes. Ma questi fagosomi non interagiscono con i lisosomi. Ecco così che si può essere in grado di studiare l'interazione della faguna con i lisosomi. E tu quello che hai fatto è che hai semplicemente permesso alle celle caricate con i marcatori lisosomici o i marcatori fluidi. Così, che i lisosomi vengono etichettati con un colore rosso fluorescente e poi si permette alla cellula di fagocitare qualche materiale e una volta che si farà il phagocysio si andrà a formare i fagosomi e poi si interagirà effettivamente con i lisosomi e ovunque la fagogia interagirà con i lisosomi si va a vedere un bead che è circondato da un anello di colore blu e l'anello di colore blu è ulteriormente circondato da colorazioni rosse. Quindi, se hai 2 anelli, rosso e blu, quindi quello è un luogo in cui la faguna si interviene con i lisosomi. Quindi, con questo, vorremmo concludere la nostra lezione qui e in questa lezione abbiamo discusso dei diversi esperimenti ciò che si può essere in grado di eseguire con l'ausilio della microscopia e spero che si possa progettare qualche esperimento in più dopo aver vagliato il potenziale di queste particolari tecniche e potrebbe aiutarvi a progettare il nuovo esperimento per il proprio lavoro. Quindi con questo vorrei concludere qui la mia lezione. Grazie.