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Microscopio Ciao a tutti, questo è il dottor Vishal Trivedi da Dipartimento di bioscienze e bioingegneria da IIT Guwahati. E così, di gran lunga quello che abbiamo discusso abbiamo discusso della cultura delle cellule dei mammiferi. E nella lezione precedente abbiamo anche discusso di come si possa essere in grado di frazionare le cellule dei mammiferi così come la cellula procariotica con l'aiuto dei diversi tipi di centrifughe.O si utilizzano le certificazioni differenziali o le certificazioni di gradiente di densità, a prescindere dall'utilizzo delle centrifughe o per separare le cellule in diverse frazioni, possiamo anche localizzare o localizzare una particolare cellula all'interno della particolare proteina all'interno della cella con l'ausilio della microscopia. Così, le cellule ciò che si sta colando con l'aiuto dei diversi tipi di supporti possono essere visionate con l'aiuto dei diversi tipi di microscopi.Così, nella lezione di oggi, ci si sofferma sui microscopi e su come si può essere in grado di utilizzare questi microscopi per localizzare una particolare proteina all'interno della cellula o come si può essere in grado di utilizzare questi microscopi per eseguire diversi tipi di esperimenti cellulari.(Fare Slide Time: 02.18)Quindi, penso che abbiamo discusso dei diversi tipi di cellule, avevamo discusso delle cellule procariotiche così come delle cellule eucariotiche all'interno delle cellule eucariotiche, si discute sulle cellule animali di lievito così come sulle cellule vegetali e per visualizzare queste cellule possiamo utilizzare i diversi tipi di strumenti microscopici. Quindi, il microscopio è uno strumento che in realtà può essere utilizzato per visionare le cellule che sono molto, molto piccole e ci sono diversi tipi di microscopi. Quindi, passiamo con quelli.(Fare Slide Time: 02.50)Così, il microscopio è uno strumento che viene utilizzato per osservare il piccolo organismo o oggetto anche le macromolecole in un microscopio tipico, quello che si ha è una fonte di produzione leggera ad esempio, in questo caso si ha una sorgente luminosa. Quindi, in questo posto si ha una lampadina, che in realtà è stata fatta di tungeston. Così, in un semplice microscopio, che in realtà è questo è un microscopioleggero, la luce è prodotta da una lampada con l'ausilio della lampada tungeston come sorgente e i raggi luminosi sono focalizzati sulla provetta dal condensatore.Così, la luce arriva da qui e poi si è focalizzata con l'ausilio del condensatore e l'esemplare è conservato sul palco e formato dalle clip presenti sul lato. Quindi, qui si può essere in grado di mantenere l'esemplare e poi si possono tenere i moduli di provetta con l'ausilio della luce le clip, la luce diffusa dal campione viene poi raccolta dalla lente oggettiva lente obiettivo in realtà nella gamma da 10 a 100x che significa, una volta che la luce viene riflessa dagli oggetti che si sta effettivamente raccogliendo dalla lente oggettiva.Questa lente oggettiva potrebbe essere da 10x a 100x, il che significa, in realtà sta per ingrandire l'oggetto da un fattore di 10. Ma c'è un ingrandimento supplementare è ottenuto dal bulbo oculare che di solito è del 10x. Quindi, nel caso in cui si stia guardando un campione con l'obiettivo di 10x si stia effettivamente dando un ingrandimento di 100x. Allo stesso modo, se si sta guardando l'oggetto con 100x così si sta effettivamente andando a darvi l'ingrandimento totale che è 1000x.Così, questo è un semplice microscopio un microscopio leggero dove si ha una sorgente luminosa, questa sorgente luminosa va focalizzata dal condensatore e poi questo condensatore in realtà illude gli oggetti che sono stati o il campione che viene conservato sul palco. E una volta che la luce si diffonde dal campione viene raccolta dalla lente oggettiva e queste lenti oggettive possono essere spente da 10 a 100x e poi l'ingrandimento totale quello che si sta per ottenere è grazie all'ingrandimento da parte della lente oggettiva così come l'ingrandimento da parte della oculata. Perlopiù la palpebra è 10x quindi, si va a ottenere un ingrandimento dei 10 in qualunque sia l'ingrandimento della lente oggettiva.(Fare Slide Time: 05.43)Questa strumentazione potrebbe essere di 2 tipi diversi o si può avere il microscopio ad upright oppure si può avere il microscopio invertito. Nel microscopio upright lo schema complessivo rimane lo stesso, salvo che l'obiettivo la torretta dove si hanno gli obiettivi sono fissati abitualmente e l'immagine è stata focalizzata dallo spostamento della fase di campionamento su e verso il basso, che significa in un microscopio upright, gli obiettivi sono rimasti fissi.considerando che il campione che terrai sul palco e il palco andrà su e giù con l'aiuto dei pomelli di regolazione. Quindi, hai un pomello qui che in realtà può ruotare in senso orario o in senso antiorario e con l'aiuto di questo, questo palco può andare nelle direzioni in alto e in basso e cioè come si sta andando a focalizzare i campioni, il che significa che il campo di profondità sarà meno in caso di microscopio upright e non si avrà abbastanza spazio per mantenere un obiettivo di grande dimensione.Ad esempio, nel microscopio upright non si avrà una flessibilità per tenere le piastre nella maggior parte dei microscopi upright, in realtà mantieni solo le diaposache solo per poter visualizzare le slide perché lo spazio tra l'obiettivo fisso e la fase di spostamento sarà molto stretto. Quindi, non si può essere in grado di tenere le piastre in confronto a quella che si ha un microscopio invertito, il microscopio invertito il percorso di luce complessivo e tutto rimane lo stesso tranne che in un microscopio invertito la fase di campionamento è fissa.Così, si va a tenere il campione su una fase fissa e si avrà l'obiettivo di spostamento. Quindi, potete immaginare che il tutto il design che avete, sia esattamente il contrario in caso di microscopio invertito, e la torretta oggettiva si muove su e giù per focalizzare la fase finale perché l'obiettivo si muove e si ha la fase fissa non c'è problema di tenere qualsiasi oggetto tra cui le diaposite o le piastre sulla parte superiore del palco perché la distanza tra questo e questo rimane il fisso.Ma sulla parte superiore del palco si ha lo spazio sufficiente per mantenere l'obiettivo di qualsiasi spessore che significa tenere le piastre potete tenere le piastre potete tenere qualsiasi cosa ed è per questo che l'invertita microscopio è effettivamente utile per osservare le cellule sotto all'interno dei laboratori di coltura cellulare, il che significa che è possibile utilizzare il microscopio invertito per osservare il file delle cellule che si stanno colando in quei piatti di coltura o si possono effettivamente osservare le cellule.Sostenere le cellule con qualche sostanza fluorogenica o qualche colorante fluorogenico poi si può essere in grado di osservare direttamente quelle cellule al microscopio invertita mentre in caso di microscopio erudito si potrebbe dover togliere quelle cellule, poi si monta sullo scivolo e poi si può essere in grado di osservare perché la distanza tra l'obiettivo e il palco è molto ristretta. Quindi, questo è il confronto di un microscopio erudito versus microscopio invertito sia il microscopio abbia il proprio vantaggio sia gli svantaggi.(Fare Slide Time: 09.15)A parte questo, si hanno anche i microscopi a fluorescenza. Così come per la sorgente luminosa, si può avere il microscopio leggero o il microscopio a fluorescenza in un microscopio a fluorescenza o in un microscopio a epifluorescenza, l'eliminazione dell'esemplare così come la raccolta di una luce fluorogenica è ottenuta con la sola lente. Così si vede che si tratta di un tipico microscopio a fluorescenza. Si tratta quindi di un microscopio a fluorescenza eretta.Dove si ha la fase che in realtà può così questa è la fase che in realtà non è fissa che in realtà può andare su e giù con l'aiuto dei pomelli di regolazione presenti qui. E queste sono in realtà la torretta su cui si trova l'oggetto. Così puoi tenere una slide o puoi tenere l'esemplare qui e poi hai le clip con l'aiuto delle clip, puoi essere in grado di fissare qui il tuo campione. E poi quello che si vede è che se si ha una sorgente luminosa e attraverso la sorgente luminosa.Da questa sorgente luminosa, la luce viene da qui, e poi elimina in realtà i campioni. E perché l'utente sarà su questo sito, ecco perché se ci sarà una luce diffrattata che arriva dal campione, per proteggere l'utente, hanno anche uno scudo in modo che non vada direttamente all'interno dell'utente. Quindi in un tipico schema di luce, quello che hai è che hai una sorgente luminosa, che in realtà ti darà luce della lunghezza d'onda più ampia, e poi avrai il filtro di eccitazione.Così come sai che la fluorescenza in un fenomeno di fluorescenza quello che devi fare è devi escogitare i campioni con una lunghezza d'onda di eccitazione, e poi il campione accelera una lunghezza d'onda che sta per emettere una luce, che sarà di una lunghezza d'onda superiore. E poi quella lunghezza d'onda deve essere raccolta con un filtro di emissione, e poi che si può essere in grado di visualizzare con l'aiuto dei diversi tipi di obiettivi oltre che della palpebra.Quindi quello che accadrà è che si ha una sorgente luminosa, che effettivamente vi darà una luce della lunghezza d'onda più ampia, allora si può davvero focalizzarsi con l'aiuto del filtro di eccitazione. E poi dal filtro di eccitazione, la luce andrà da quando la luce è andata, e poi andrà a colpire da uno specchio dicroico, perché la luce sarà di alta lunghezza d'onda, in realtà andrà a riflettere e ad eliminare il campione ora dal campione, la luce sarà prodotta.Così questa luce, quello che vedete è una luce di colore rosso in realtà avrà l'emissione lambda. Quindi l'emissione di lambda si stacca da una lunghezza d'onda superiore. Così una volta che la lunghezza d'onda più alta va, in realtà sarà di nuovo colpita dallo specchio dicroico. E in questo momento, invece di andare a riflettere, in realtà va dritto. E poi in realtà si avrà il filtro delle emissioni. E quel filtro di emissione sta di nuovo andando a filtrare, qualunque sia le lunghezze d'onda che arrivano dal campione, e poi in realtà vi mostrerà la luce della vostra lunghezza d'onda desiderata.Ed ecco come andrà effettivamente all'utente a osservatore. Quindi questo è in realtà andare alla fotocamera che in realtà è stata inserita qui. Ma se si usa questo pomello e si cambia il campo visivo, in realtà può andare sul palo, ed è così che si può essere in grado di osservare queste slide di fluorescenza. Quindi, questa deviazione della luce con l'ausilio di uno specchio dicroico è possibile solo perché lo specchio dicroico è in gran parte riflettente per la luce sotto una lunghezza d'onda di soglia e una trasmissiva per una luce superiore a quella particolare lunghezza d'onda per lo specchio dicroico è uno specchio speciale.Che in realtà riflette una luce quando la lunghezza d'onda è di una vista inferiore. Quindi in realtà riflette quella luce, e poi è così che la luce riflessa va e colpisce al campione, ma quando una lunghezza d'onda più grande esce dal campione, poi per quella particolare lunghezza d'onda, lo specchio dicroico è trasmissivo. Così, in realtà ha permesso la trasmissione di quella particolare luce e che così, in realtà è stato nuovamente concentrato dal filtro delle emissioni o è stato filtrato da un filtro di emissione.Su questo è come va nel mirino o nella fotocamera CCD per la raccolta dell'immagine. L'analisi dei microscopi immunofluorescenza del marker della superficie cellulare è un semplice raddrizzamento mentre le cellule sono trattate con gli anticorpi con etichetta fluorescente e studiate sotto i microscopi. Quindi, poiché si può essere in grado di illuminare il campione con una lunghezza d'onda fissa standard e si può essere in grado di acquisire la luce dal campione con l'ausilio di queste lunghezze d'onda fissa, si può essere in grado di utilizzare il microscopio fluorescente.Se si abbina le cellule con anticorpi fluorescenti. Così, che si può fare semplicemente con la colorazione delle cellule con esso gli anticorpi con etichetta fluorescente o con le sonde dell'etichetta fluorescente.(Fare Slide Time: 14.24)Così, potete immaginare di avere cellule di mammifero e basta darmi un esempio di cellula di mammifero come si può essere in grado di eseguire studi di Immuno - localizzazione, ma che possono essere replicate o che possono essere fatte con poche modifiche anche per la cellula vegetale così come le cellule (()) (14.43) o le cellule batteriche. Così in una cellula vegetale, quello che hai è che hai i diversi tipi di organelli come il nucleo, hai i mitocondri, hai la membrana del plasma poi hai i corpi Golgi e tutto quel genere di cose.Così, e tutte queste molecole sono in realtà sotto l'equilibrio dinamico, il che significa che non c'è posto fisso per un mitocondri per rimanere lì o non c'è posto fisso per l'altro tipo di organelli, perché tutti questi organelli sono sospesi all'interno del citosolo e si mantengono a muoversi all'interno della cellula. Quindi, a se desiderate fare una immuno-localizzazioni la prima cosa, quello che dovete fare è che dovete fermare il movimento del sé.E questo sarà il primo passo, se siete interessati alla dislocalizzazione, questo significa che il primo evento quello che dovete fare è, dovete fermare il movimento delle macromolecole biologiche. E non solo gli organelli, anche le macromolecole si muovono liberamente, ad esempio, all'interno dei mitocondri, si hanno le catene di trasporto degli elettroni, ma le altre molecole come gli enzimi dei cicli e tutto ciò che in realtà si muove liberamente all'interno dei mitocondri. Quindi, se siete interessati a localizzare quel particolare enzima.Può effettivamente muoversi sapere, cambiare la sua posizione o in realtà può cambiare la sua posizione. Così, ad esempio, se sto localizzando un enzima, ed è localizzato qui al tempo x, dopo il 10 minutes potrebbe essere localizzato da qualche parte qui in realtà. Quindi, questo in realtà è molto, molto problematico, perché se si segnala che, la particolare molecola è localizzata alla membrana plasmatica, e poi dopo il 10 minutes, può in realtà perché è sotto l'equilibrio dinamico con il citosol, la molecola può andare nelle prossime località.Così, ecco perché è importante che prima si fermi il movimento degli organelli, così come il movimento della macromolecola ciò che è presente all'interno della cellula. Quindi, che tu stia effettivamente per fare o andare a fare con l'ausilio della procedura o il protocollo chiamato fissaggio. Una volta fissate le celle, poi le cellule cesseranno in realtà la sua attività biologica, in realtà sta per morire e poi tutti questi organelli saranno in realtà incrociati tra i diversi tipi di fibre e cioè tutte le molecole vanno a rimanere come una situazione fissa.Che significa che non si potranno spostare in modo da poter vedere la localizzazione sotto le situazioni fisse, ci sono le condizioni in realtà si possono fare la localizzazione anche sotto le condizioni di vita, ma quelle sono condizioni diverse e ci sono il modo diverso in cui si può essere in grado di farlo, visto che si è fatti che poi si deve fare il modo perché si sa che le cellule non sono permeabili per gli anticorpi, il che significa che gli anticorpi non possono entrare nelle cellule.Perché le cellule dei mammiferi o le cellule vegetali o anche le cellule batteriche sono permeabili solo per le molecole più piccole, ma non sono permeabili per le molecole più grandi come gli anticorpi per fare la parte per gli anticorpi che è il secondo passo quello che si deve fare. Così, nel secondo passo, bisogna fare la strada per l'anticorpo per entrare nella cellula e che si sta facendo con l'aiuto di un passo chiamato permeabilizzazione.Ora, una volta che avrete permealizzato le cellule, in realtà si va a fare i binari all'interno della cellula che significa usare questi binari o usare questi percorsi, usare gli anticorpi può entrare ma una volta che l'anticorpo entrerà nella cellula, non interagiranno solo con l'antigene del vostro interesse anche per interagire con tutte le proteine ciò che è presente nella cellula. Quindi, per evitarlo,devi anche nascondere i siti non antigeni e che hai a che fare con l'aiuto del blocco. Quindi, una volta fatto con la permeabilizzazione e il bloccaggio del fissaggio.Poi in realtà siete stati pronti a colorare le cellule dei mammiferi con le primarie oltre che gli anticorpi secondari. E poi dopo, devi fare le osservazioni significa che devi vedere le cellule. Così, per osservare le celle, si deve fare di nuovo una procedura che viene chiamata come il montaggio che significa dover montare le celle su una coppa di copertura e poi si può tenere le taglie di copertura sotto il microscopio e poi si può essere in grado di visionare vi è una possibilità che si possa effettivamente utilizzare il microscopio invertito e poi non è necessario fare un montaggio.Ma in quel caso potrebbe anche essere necessario mantenere alcune soluzioni. Così che il campione non venga distrutto quando viene illuminato con un fascio alto della luce fluorescente o ad alto fascio di luce che viene dalla sorgente. Parliamo quindi di tutti questi passaggi in un dettaglio più dettagliato.Così, questa non è una regola fissa che lo si fa per 15 minutes minuti, può essere ottimizzata. In alcuni casi le persone non utilizzano la BSA, utilizzano la qualche soluzione proteica più complessa ad esempio, si può usare il siero anche per usare le altre fonti proteiche, perché la BSA è molto semplice. Quindi, potrebbe effettivamente non essere in grado di sapere darvi l'ottimo blocco rispetto a quello se si usa il siero e altri tipi di campioni biologici complessi.Ed è così che si ottimizza, in modo da ottenere la colorazione specifica per il vostro antigene di interesse, ma allo stesso tempo si blocca il segnale non specifico per ridurre lo sfondo. Poi dopo che, si va a fare una colorazione primaria così incubare il campione con l'anticorpo primario prevalentemente 1 è a 50 diluizioni in una PSA da 2% per la notte in 4 gradi oppure si può fare una 1 ora a 37 gradi, la colorazione primaria a bassa temperatura sta riducendo il segnale di fondo e dà la buona colorazione per il campione.considerando che, la colorazione a temperatura ambiente dà la quantità maggiore di segnale non specifico. Quindi, quando si fa la colorazione primaria, la colorazione primaria deve essere fatta con l'aiuto dell'anticorpo primario ciò che si è sviluppato nel coniglio o nel topo o qualunque sia stato effettivamente acquistato dall'azienda e che si deve fare come una consultazione del 1 è a 50. Quindi, questo ènon fisso che tu faccia una consultazione di 1 minuti è a 50 diluizioni che puoi avere per ottimizzare questo e dipende dal titer anticorpo di quel particolare antigene.Perché se il titer anticorpo è altissimo, allora puoi anche permetterti di andare fino a 1 è a 200 o 1 è a 500 ma se il titer anticorpo è molto basso, allora devi andare con il 1 è a 100 1 è a 50. E l'altro punto è che bisogna fare l'immunostaining ad una temperatura molto bassa in modo da poter fermare le interazioni nonstick perché a bassa temperatura, si è in realtà solo permettendo all'anticorpo di interagire con gli antigeni specifici e in realtà si sa, evitando l'interazione nonspecifica.considerando che, se si è rapidamente desiderati di testare il protocollo, si desidera verificare rapidamente se l'anticorpo sta colorando il mio antigene oppure no, allora si può fare la 1 ora 37 gradi che in realtà vi sta per dire se l'anticorpo ciò che si è sviluppato è abbastanza buono da fare immuno - localizzazione in cella o meno, ma alla fine ti regala uno sfondo molto alto. Quindi, una volta sicuri che in realtà vi darà la buona colorazione.Poi potete effettivamente eseguire lo stesso esperimento sotto la temperatura bassa a 4 gradi. Si può fare allora il lavaggio dell'anticorpo primario per lavarsi per ridurre il segnale di fondo e il campione viene lavato con i 2% BSA preparati in PBS. Quindi anche il passo di lavaggio è un passo in cui in realtà si può fare una certa quantità di ottimizzazioni. In modo da poter essere in grado di ridurre il segnale di fondo mantenendo il tuo interesse dei tuoi segnali.(Fare Slide Time: 34:42)Ora una volta che hai finito con il lavaggio, allora puoi fare una colorazione secondaria. Così incubare il campione con un anticorpo secondario perlopiù in un 1 è a 500 in un 1 è a 500 diluizione in 2% PSA per una notte o a 1 ora per 37 gradi Celsius poi si va a fare un lavaggio. Quindi il passaggio secondario del lavaggio deve lavarsi per ridurre il segnale di fondo e il campione viene lavato con 2% BSA preparato in PBS, poi l'ultimo passo è il montaggio del campione è sensibile alla perdita di acqua e necessita di conservare in un supporto di montaggio contenente glicerolo.Inoltre, il segnale di fluorescenza è sensibile al fascio laser ad alta energia e richiede protezione aggiungendo degli agenti anti fading. Così, quando si fa un montaggio da quando in questo caso stiamo facendo l'immunofluorescenza e la fluorescente l'istanza luminosa è molto brillante in realtà è in grado di placare il vostro segnale che significa, in realtà vi sta andando a sapere illuminare la farina di 4 a un fascio così alto che alla fine invece di darvi la luce che effettivamente la distruggerà e questo fenomeno è chiamato il quindicesimo.Che significa, se state illuminando una particolare biomolecole o se state eliminando una sonda con un fascio di energia molto alto, quindi, invece di dare conoscere la fluorescenza, si sta effettivamente ossidando con l'aiuto di quell' energia alta ed è così che andrà in realtà distrutta. Quindi, per evitare di dover montare anche il campione con l'ausilio di agenti anti - fettura. Gli agenti anti - fettura sono quindi gli agenti campione o antifrodo sono il composto che ha effettivamente tonificato il segnale.E in realtà assorbe qualunque sia il calore extra presente in quel fascio ad alta energia. Quindi, a causa di ciò, in realtà permette al campione di permettere alla sonda di essere illuminata o la farina ciò che lei ha aggiunto di essere illuminato, ma non permette di acquistare l'energia extra per il pavimento per così che venga placcato. Così uno degli antifoni classici è chiamato come PPD o il para fenilenediammina e il para fenilenediammina sta effettivamente andando a proteggere il campione dall'ottenere la quench.Così, è possibile miscelare il PPD in un supporto di montaggio ed è possibile montare campioni fluorescenti. Quindi, potete immaginare che se avete un campione in un colorante fluorescente in un campione e avete un coverslip così, quello che accadrà è che il PPD sta effettivamente per presentare in tutto questo campione ed è così che in realtà assorbe extra luce quello che state effettivamente usando per illuminare il campione e lo si permette solo di conoscere il filtro. Quindi, in realtà riduce l'intensità e riduce l'energia extra, ma in realtà ha permesso il flusso per darvi la fluorescenza invece di ammalarsi.(Fare Slide Time: 37:46)Ora questa è una tipica osservazione e visualizzazione. Così il campione è fissato sul palco del microscopio e poi si osserva sotto la luce intensa per verificare la morfologia cellulare trasformando il pomello focalizzato. Quindi, questa è l'immagine luminosa brillante e se il campione è morfologico è buono, allora si può osservare sotto i canali di fluorescenza. Quindi, quello che potete vedere è che sto osservando la stessa slide sotto il canale di fluorescenza e così, tutte le cellule mi stanno mostrando un segnale fluorescente e mi sta effettivamente mostrando un segnale di spegnimento dell'antigene.Se vado con le magnifiche più alte e se vado con più numero di fluorescenti per esempio, se uso supporre che mi interessa vedere se la proteina del mio interesse è presente nei corpi mitocondri o lisosomi e Golgi e tutto ciò che posso fare è posso colorare queste cellule con la particolare sonda specifica organelles come ad esempio, posso usare il mitotracker rosso, quindi in quello e posso usare il colorante fluorescente come il verde.Così, quello che accadrà è se lo faccio, e se vedo una co localizzazione del verde in rosso, allora che in realtà sta per dimostrare che la proteina del mio interesse è presente nei mitocondri, se voglio fare altro tipo di esperimento, voglio vedere se la proteina del mio interesse è presente nel nucleo, allora posso solo colorare le cellule con un colorante nucleare ad esempio, posso usare la (()) (39:14) oppure posso usare l'etbr o posso usare il propidio iodio e o l'arancio accreto e che in realtà si macchierà del nucleo.E se vedo un co localizzazione che significa se vedo una sovrapposizione dei 2 segnali, allora dirò che la mia proteina di interesse è presente all'interno del nucleo. Infatti, si può in realtà anche belle sintonia che si può effettivamente andare più in basso e dire, se la mia proteina interagisce con la catena di trasporto degli elettroni di voi conoscono i mitocondri o meno. Quindi, se faccio un'immunostazione la stessa procedura se faccio immunostica per la parte del complesso è ciò che è presente nella catena di trasporto degli elettroni. E se faccio proteine del mio interesse con qualche altro enzima.Così, quello che posso fare è usare un anticorpo con il verde posso usare l'unico anticorpo con il rosso e se vedo una sovrapposizione di segnale, che significa ovunque il verde sia presente lo stesso posto in cui si può vedere un segnale rosso. Quindi, questo è un modo in cui si va a dire che sto mostrando la co localizzazione di questi 2 segnali, il che significa che la mia proteina è effettivamente presente molto vicina alle catene di trasporto degli elettroni, voi se ricordate che questi sono i segnali fluorescenti.Così, hanno questi, non diranno se quanto sono lontani, ma stanno andando nell'interno della gamma da 10 a 50x tempeste che è tutto ciò che sta per dire sono molto vicini e si vuole dire bene, quanto sono vicini, poi si può essere in grado di utilizzare anche la microscopia ad altissima risoluzione. In quel caso, si può effettivamente fareuna localizzazione con l'ausilio della catena di trasporto degli elettroni con l'ausilio della microscopia elettronica.E questo in realtà vi dirà esattamente quanto queste 2 proteine siano presenti all'interno delle catene di trasporto degli elettroni che comunque andiamo a discutere in una successiva lezione. Quindi, vediamo come si può essere in grado di utilizzare la microscopia a fluorescenza per comprendere i fenomeni biologici.(Fare Slide Time: 41:23)Così, uno dei fenomeni biologici di base è chiamato fagocitosi. Quindi, la fagocitosi è sempre stata fatta dalla maggior parte delle cellule immunitari soprattutto come i macrofagi. Quindi, quello che succede è, quando i macrofagi vengono trovati un batterio Così, supponiamo che questo sia un batteri, quindi, se i macrofagi si trovano che questo c'è un batterio e così, la fagocitosi significa questo mangiare dalla cellula, il che significa che la cellula si mangia o Ingles, queste particolari particelle, quindi, cosa supponiamo, questo è un macrofaggio e questo è un batteri.Poi incubare la piastra per 1 ora 37 gradi. Quindi 1 ora è sufficiente per il sé per fagocitare le particelle. Se vuoi fare un corso di tempo poi puoi effettivamente gustare i piatti, puoi togliere le copertine delle copertine a più punti di tempo. Ed è così che si può essere in grado di inserirli semplicemente in soluzioni fissative ed è così che si può fermare il processo di fagocitosi. Quindi se volete fare un corso di tempo, potete farlo anche voi.Lavate il pozzo con 1 ml DMEM senza FBS per rimuovere le cellule non inizializzate e poi si fissa il campione biologico con la miscela di acetone a 20 gradi, si idrata il campione con 1x PBS in modo che acquisirà la morfologia poi si colorano le cellule con Filippina per 1 ora a 37 gradi in buio. Come ho detto che conosci Filipin è un colorante fluorescente quindi in realtà ti darà la fluorescenza ed è così che è effettivamente suscettibile per te che conosci la luce.Quindi, devi fare tutte queste istruzioni sotto il buio oppure puoi davvero coprire il campione con la schiuma di alluminio conservare una goccia di supporto di montaggio nei supporti di montaggio del glicerolo che contiene l'antiscivolo come BPD sulla slide di copertura e tenere gli occhiali coperti su di esso si formano gli occhiali da coppa facendo la spessa rima da parte del lucido per unghie. Quello che vuol dire è che quando si ha una slide di copertura, si tiene il vetro di copertura e poi sopra di questo bisogna tenere una folta schiuma di lucido per unghie in modo che in realtà rimanga forma su quel particolare posto in cui non dovrebbe muoversi. Ora il vostro campione è pronto per le visualizzazioni.(Fare Slide Time: 52:53)E quello che vedrete è una tipica fagocitosi di bead sarà rappresentata dall'aspetto di un bead in una faccia e lo stesso bead con una fluorescenza che significa che state andando a vedere un incantatore della fluorescenza per esempio, in questo caso, quello che vedete è che c'è un bead che è stato presente sulla cellula e lo stesso bead sta avendo la fluorescenza colore blu intorno ad esso che significa che questi bead sono stati internalizzati dai macrofagi.Così, questo è tutto sull'utilizzo di il microscopio fluorescente ci sono molti più esperimenti di ciò che possiamo effettivamente discutere e il modo in cui il microscopio fluorescente può essere utilizzato in uno degli approcci che possiamo anche fare è poter effettivamente studiare l'interazione delle proteine con le altre proteine con l'aiuto di chi conosci il doppio labeling della cellula. Così che in realtà si dirà se queste 2 proteine sono presenti quando sono nello stesso scompartimento se interagiscono tra loro oppure no.Così, ci sono molte applicazioni una cosa che quando si può fare ci sono molti tipi di esperimento che si possono effettivamente progettare con l'ausilio del microscopio fluorescente. Ma così con questo vorrei concludere qui la mia lezione. Grazie.