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Frazionamento di celle
Salve a tutti questo è il medico Vishal Trivedi da dipartimento di bioscienze e ingegneria bio IIT, Guwahati. E quello che stavamo discutendo nella lezione precedente riguarda la crescita così come la propagazione della cellula procariotica così come la cellula eucariotica. Così, in quella lezione abbiamo discusso anche dei diversi tipi di media e oltre che della componente mediatica, quello che si richiede di crescere con successo oltre a manipolare le cellule. Così, nella lezione di oggi si discuterà della frazionamento delle cellule. Allora, quello che abbiamo discutere nella lezione precedente è quello.(Fare Slide Time: 01.03)Abbiamo discusso dei diversi tipi di cellule.(Fare Slide Time: 01.44)Così, abbiamo discusso della cellula procariotica, abbiamo discusso del lievito e dei funghi che sono in realtà all'interno della cellula eucariotica così come si discute sulla cellula vegetale così come sulle cellule animali. Quindi, quando si hanno i diversi tipi di cellule, queste cellule sono in realtà molto, molto complesse nelle strutture. E potreste essere interessati a esplorare una particolare molecola o sostanza particolare da una particolare località di quella particolare cellula.Ad esempio in alcuni casi potreste essere interessati a vedere la molecola che sono presenti sulla membrana plasmatica di una cellula procariotica o state cercando una molecola presente all'interno del citosol di una cellula procariotica. La situazione è sempre più complicata quando si parla della cellula animale così come della cellula vegetale. perché rispetto alla cellula procariotica che ha in realtà un unico corpo cellulare in cui non si hanno i più organelli tranne la membrana plasmatica e il citosol.A parte che si hanno anche le frazioni periplasmatiche ma oltre alla struttura molto semplice la cellula eucariotica offre davvero molte più complicazioni. Ad esempio hai il nucleo, hai i diversi tipi di organelli come reticolo endoplasmatico, mitocondri, lisosomi, corpi golgi e tutti gli altri tipi di organelli. E oltre a questo quando si parla delle cellule vegetali, le piante sono anche la parete cellulare così come la membrana plasmatica e tutti gli altri tipi di cloroplast organelli, risposta del nucleo.Così, quando si cerca l'isolamento di un determinato fattore dalla particolare regione di una cellula se si appartiene a un mitocondro o al cloroplast o a reticolo endoplasmatico o lisosomi, le cose diventano sempre più complicate. Così, nella lezione di oggi si discuterà di come frazionare la cellula procariotica oltre che una cellula eucariotica per isolare la proteina del vostro interesse da un particolare organelli di cellule o da una parte della cellula. Così, inizieremo con la cellula procariotica.(Fare Slide Time: 04.02)Così, in cella prokaryote, si ha così questa è una tipica cellula batterica in cui si ha la membrana plasmatica e al di fuori della membrana plasmatica si ha una parete cellulare. E questo è un flagello che in realtà permette il movimento di una tipica cellula procariotica. E all'interno della parete cellulare ciò che si ha è il due strato uno è lo strato più esterno e poi si ha lo strato interno e in mezzo tra lo strato interno oltre che lo strato interno si ha uno spazio chiamato come spazio periplasmico.Quindi, quello che vedete qui è la distribuzione dei diversi tipi di proteine ciò che è presente all'interno della cellula batterica. Quindi, quello che si vede è che nelle frazioni periplasmatiche si hanno i 129 diversi tipi di proteine dove alcune proteine sono di alto peso molecolare e alcune proteine sono di basso peso molecolare. Allo stesso modo si ha la membrana esterna dove si hanno i 50 diversi tipi di proteine, 9 proteine sono solo appartenenti ad una proteina ad alto peso molecolare.Poi alcune proteine sono extracellulari in natura, il che significa che saranno secrete dai batteri e saranno presenti nei media di quella particolare cultura. Poi si ha la membrana interna e così come il citoplasmo. Quindi, la porzione maggiore della proteina è sempre presente all'interno del citoplasmo. E avete le due regioni che sono di vostro interesse a isolare la proteina, una è le frazioni periplasmatiche e la seconda sono le frazioni citoplasmatiche.Così, la prima a discutere delle frazioni periplasmatiche. E ricordate, la frazione periplasmica significa, la frazione che è presente all'interno dello strato esterno così come lo strato interno. Così, la regione che è presente tra lo strato esterno e lo strato interno è chiamata come regione periplasmatica e quella regione viene sempre utilizzata dai batteri per conservare le proteine per o a volte usano anche quella proteina in quella frazioni periplasmatiche. A volte usano anche le proteine per sequestrarle anche i farmaci e i complessi correlati.E la frazione periplasmica è molto importante anche in supplienza si vorrebbe usare i batteri per i fini di espressione perché la frazione periplasmica sta dando un ambiente adatto per il corretto ripiegamento della proteina. Quindi, in alcuni casi ciò che accade è che state effettivamente mettendo una sequenza di segnalazione o state mettendo una sequenza di localizzazione nella vostra proteina del vostro interesse. E di conseguenza la proteina sta entrando nella frazione periplasmica. Vediamo quindi come si può essere in grado di isolare la frazione periplasmatica dai batteri.(Fare Slide Time: 06.50)Così, la frazione periplasmatica prima bisogna raccogliere la cellula batterica mediante la centrifugazione al 3000g per 20 minutes minuti a quattro gradi Celsius. Quindi, ricordate che l'isolamento della frazione periplasmica è una cosa molto, molto sensibile per le proteine che è il motivo per cui la maggior parte di queste procedure deve essere eseguita a 4 gradi. Perché la volta che si isolano i batteri e quando si va a rompere aperto e si desidera isolare le frazioni periplasmatiche, in quel processo si attivano tutte le proteasi e tutti gli altri tipi di macchinari degradanti proteici.Ecco perché l'intera procedura deve essere eseguita su 4 ° grado. Così, al primo passo, si raccoglierà la cellula batterica mediante centrifugazione a 3000g per 20 minutes minuti a 4 ° grado Celsius. Una volta ottenuto il pellet batterico, poi si va a scartare i supporti e poi si va a rimuovere con attenzione l'ultima goccia di liquido, in modo da non risucchiare le cellule batteriche.Poi i pellami batterici si sospendono delicatamente in un ml di tampone TSE usando un loop di filo e poi si incubano questa miscela al ghiaccio per 30 minutes minuti. Così, in questa particolare incubazione quello che accadrà è che i batteri si gonfieranno e in realtà vi darà le frazioni periplasmatiche. Poi quello che devi fare è trasferire le cellule in una micro centrifuga e centrifuga al 16.000g che è la velocità massima nel microfugo per 30 minutes minuti a 4 gradi.Poi si trasferisce il supernatante ad un nuovo tubo di centrifuga, questo supernatante costituisce l'estratto di busta così come le frazioni periplasmatiche. Così, in questo particolare protocollo, quello che abbiamo fatto in realtà è che abbiamo effettivamente dato uno shock termico che abbiamo dato lo shock osmotico alla cellula batterica dopo la rimozione della parete cellulare e in quel processo, la frazione periplasmatica è stata rimossa dai batteri o dalla proteina ciò che è presente nelle frazioni periplasmatiche sono stati estratti.Quindi, ciò che vedete è che prima avete raccolto le cellule, poi avete incubato la cellula in un tampone TSE e che in realtà è abbastanza buono per dare loro uno shock. E poi si sta effettivamente centrifugando che, in modo che il supernatante conterrà le frazioni periplasmatiche e il pellet conterrà l'altra parte della cella.(Fare Slide Time: 09.26)A parte che si può anche fare l'isolamento delle frazioni citosoliche. Quindi, non esiste un modo particolare di fare di isolare le frazioni eteroplasmatiche. Quello che devi fare è, devi prendere le cellule batteriche, e poi siccome la cellula batterica non contiene gli organelli, l'isolamento della frazione citosolica è facilissimo. Perché quello che devi fare è che devi prendere le cellule batteriche, poi hai le molteplici opzioni come attraverso le quali puoi davvero spezzare le cellule.Così, devi prima spezzare le cellule con l'aiuto dei diversi tipi di disturbi della cellula. Quindi, ci sono il metodo meccanico, ci sono i metodi enzimatici e ci sono i metodi fisici. Ad esempio, si può usare la lisina termo che si può assumere la fragilità osmotica che si può assumere l'aiuto dei detergenti. Nel caso in cui si cerchi solo di preparare la linfa cellulare non è interessato a isolare la proteina attiva.Ma se siete interessati a isolare la proteina attiva, potete persino utilizzare i metodi meccanici come potete usare l'omogeneizzazione, potete usare gli altri tipi di metodi meccanici. E di conseguenza ciò che accadrà è in realtà vi darà la miscela di cellule come dove in realtà conterrà le cellule di sé e più il supernatante. E poi quello che devi fare è di centrifugare questa miscela al 16.000g per 20 minutes.E di conseguenza avrai intenzione di ottenere 2 frazioni, riceverai le frazioni di pellet, ti arriverai alle frazioni supernatanti. Questa frazione di pallet sta solo per contenere le cellule spezzate e che si può effettivamente scartare. Perché queste cellule spezzate così come queste vanno in realtà ad avere la parete cellulare e tutti quegli altri tipi di materiale mentre nel supernatante in realtà si ottime le frazioni citosoliche.Così, questo è il modo in cui si può in realtà essere in grado di frazionare le cellule batteriche o si può isolare la frazione periplasmatica oppure si può isolare le frazioni citosoliche.(Fare Slide Time: 11.56)Ora rispetto alla cellula procariotica che sono in realtà molto semplici e dove non si hanno i molteplici organelli, l'isolamento delle proteine da tsi differenziano organelli o anche all'interno della presenza di citosol è molto, molto complicato quando si parla della cellula eucariotica, per esempio si parla della cellula animale o delle cellule vegetali.Così, nel caso della cellula vegetale si avrà il problema della parete cellulare che in realtà si spezza. Poi solo tu puoi essere in grado di accedere alla membrana plasmatica, potrai essere in grado di accedere agli organelli. Mentre nel caso della cellula animale che in realtà sarà molto, molto sensibile per qualsiasi tipo di trattamento. Devi essere molto, molto attenta alla fragilità osmica e devi sempre essere molto sensibile al.Non ci dovrebbero essere cambiamenti nell'osmolarità delle soluzioni perché non appena si cambia l'osmolarità di una soluzione e le cellule dei mammiferi sono presenti. Che di per sé spezza le cellule potrebbero anche disturbare la distribuzione complessiva della proteina all'interno anche dell'organella. E di conseguenza non otterrai il buon recupero della tua proteina da un certo organello.Ad esempio, se sei interessato a isolare la proteina dalle frazioni mitocondriali ma per errore se aggiungi la quantità di acqua ok. Quindi, quello che accadrà è che l'acqua spezza la membrana plasmatica che sta per essere la prima barriera e poi in realtà distruggerà anche la membrana mitocondriale. E in definitiva quello che accadrà è che il recupero della vostra particolare proteina sarà molto, molto meno.Così, ecco perché dobbiamo stare molto attenti quando stiamo gestendo le proteine eucariotiche perché sono molto sensibili per diverse tipologie di trattamento quello che si sta per eseguire in occasione di diversi tipi di esperimenti o quando si sta effettivamente andando a isolare le diverse proteine dalle diverse località della cellula.(Fare Slide Time: 14.13)Così, all'interno della cella eucariotica si hanno le molteplici opzioni come le località come plasma membrana, hai i mitocondri, hai il cloroplast, hai il citosol. E a parte questo, anche tu in caso di piante, potresti avere il cloroplast e potresti avere anche la parete cellulare. Così, come frazionarlo perché così da capire prima il frazionamento bisogna capire la sottolineatura degli strumenti e così come il principio.E poi stavamo per discutere della frazionamento della cellula eucariotica e di come si può essere in grado di isolare i diversi organelli e anche come si può essere in grado di isolare la proteina da quegli organelli.(Fare Slide Time: 15.08)Così, per le frazioni, potrebbe essere necessario richiedere i diversi tipi di centrifughe. Quindi, questo è il microfugo che in realtà è una centrifuga a velocità molto bassa poi si ha la centrifuga ad alta velocità ad alto volume. In realtà può anche andare al 4 ° grado oltre che può essere di 37 gradi. E poi questa è la centrifuga ad alta velocità, questa è la centrifuga ciò che si usa per scopi di coltura cellulare.Perché può avere anche la flessibilità di mettere i diversi tipi di rotori come si possono avere i rotori ad angolo fisso oppure si possono avere i rotori di lamiera. E questa è la centrifuga ciò che si è chiamato come la centrifuga ultra perché in realtà può andare fino alle ultra alte velocità e in realtà può andare anche fino a quella lakh g in realtà. Quindi, che in realtà è richiesto di isolare i diversi componenti della cella.Questo è un tipico rotore quello che si usa in una ultracentrifuga quando si usa e questi rotori sono in realtà realizzati con un metallo molto, molto forte. Così, che quando ruotano ad una velocità molto, molto elevata, resiste davvero a quel tipo di alta pressione.(Fare Slide Time: 16.30)Per quanto riguarda la centrifugazione, la centrifugazione può essere effettuata in due modi sia che si possa fare una centrifugazione differenziale o per le centrifughe a gradiente di densità. Il principio di base o il principio di sottolineatura della certificazione rimane lo stesso. E penso che ti ricordi quando parlavamo della manutenzione così come del funzionamento della centrifuga abbiamo discusso del principio di base.Così, il principio di base è che quando si sta ruotando un oggetto intorno all'asse, in realtà si sperimenta le due forze, le forze centripeta che in realtà si dirigono verso l'asse e le forze centrifughe che sono in realtà lontane dall'asse. Quindi, se state effettivamente ruotando un oggetto e intorno ad un asse, quindi, quello che accadrà è che avrete la forza centripeta verso il centro dell'asse, dove come si sperimenterà la forza centrifuga che si allontana dall'asse.Così, potete immaginare che se si tiene questo oggetto in un eppendorf o in un tubo questo oggetto cercherà di muoversi verso questo lato ma questo oggetto è presente in un liquido. Così, questo liquido si opporrà effettivamente al movimento di questo oggetto. Quindi, quello che accadrà è quando l'oggetto cerca di allontanarsi dal centro a causa della forza centrifuga che in realtà sarà F 3, in realtà si va a contrapposizione di 2 forze una si chiama come le forze di galleggiamento.Così, che si possa immaginare che FB e poi si possano avere anche le forze frizionali perché quando la molecola si sta spostando attraverso il materiale viscoso che effettivamente sperimenterà 2 cose, una è la galleggiabilità. A causa della densità della molecola e di altri uno è l'attrito perché la molecola ha delle dimensioni. Così, F 3 sta effettivamente andando ad eguagliare o più grande che in entrambi i casi.Così, F3 può essere uguale a nel caso di F B + F F quando si parla delle centrifughe a gradiente densità, F 3 sarà più grande con la F B più la F F. Perché in quel caso quello che accadrà sarà la F 3 spingerà questo oggetto verso la fine di questo tubo. E in definitiva quello che accadrà è che perché il tubo è chiuso dall'estremità inferiore l'oggetto andrà a formare il pellet.Così, se viaggia e viaggia perché le forze opposte sono molto, molto meno. Poi quello che accadrà è che questo oggetto raggiungerà fino alla fine di questo tubo e in realtà verrà pellettato. Quindi, questo è il principio base della centrifugazione per quanto riguarda la centrifugazione differenziale nonché la centrifugazione a sfumatura di densità. Entrambe queste centrifughe stanno effettivamente utilizzando le forze centrifughe così come stanno sfruttando le dimensioni così come la densità del particolare materiale.(Fare Slide Time: 20.04)Così, ecco perché la sedimentazione di un determinato oggetto è dipende dalle diverse dimensioni, dalla forma e dalla densità. Quindi, potete immaginare che se avete una molecole o diverse dimensioni così come la densità. E se iniziate a fare le centrifughe quel che accadrà è che le molecole che sono di grandi dimensioni che per mezzo di un alto peso molecolare andranno a pellet per primo, allora avrete l'oggetto di taglia medio.E poi avrete l'oggetto di piccole dimensioni e in cima avrete il solvente che significa che la centrifugazione differenziale sta effettivamente sfruttando i 2 fenomeni. Una è la dimensione dell'oggetto e la seconda è la densità di quel determinato oggetto perché questi sono il parametro 2 che in realtà stanno andando a decidere a quale velocità di centrifugazione stanno effettivamente andando a superare le forze di galleggiamento così come le forze di frizione, in modo che vengano pellettati.(Fare Slide Time: 21.14)Così, puoi capire che con la cosa semplice che supponiamo di avere i diversi tipi di oggetti. Ad esempio si ha un ferro che è di 100 kg, si può avere questa pietra che è di 30 kg, si può avere un altro blocco di ferro che è di 10 kg e si può avere la pietra che è di 10 kg. E poi alla fine hai anche il cotone che è di 8 kg e hai un altro blocco di ferro, che è di 1 kg.Quindi, ricordati che il ferro è la densità più alta e il tutto questo è ferro, giusto. Quindi, il ferro sta effettivamente avendo la massima densità mentre la pietra avrà la densità media e il cotone avrà la minima densità. Quindi, quando in realtà si prenderà questa miscelae si farà girare quello che accadrà è che indipendentemente dal loro peso significa che siano 100 Kg, 10 kg o 1 kg il ferro va a pellettarsi in fondo.Così, in realtà sarà la particella più pesante e poi la pietra sarà pellettata più avanti e il cotone sarà rimasto al top. Quindi, il che significa che se si fa una centrifugazioni differenziali, quello che accadrà è che il ferro verrà pellettato per primo o il ferro verrà pellettato ad una velocità molto, molto bassa. Perché in realtà sta andando ad aiutare le forze centrifughe e in realtà sta andando verso.Così, anche se si gira ad una velocità molto lenta la forza centrifuga del ferro a causa della densità sarà talmente pesante che in realtà è abbastanza buona per annullare l'effetto delle forze di galleggiamento così come le forze di frizione. Mentre in quel momento particolare la pietra così come il cotone non si avrà pelato. Ma quando si aumenta la velocità poco alta poi la pietra si abbassa ma il cotone rimarrà comunque all'interno del liquido ok.E poi se si aumenta la velocità più in alto perché il cotone avrà la minima densità, richiede più forza o più velocità. Perché poi solo la forza centrifuga sarà abbastanza buona, in modo che si abbinamenti. Perché alla fine la forza centrifuga deve annullare l'effetto delle forze frizionali così come le forze oltre. Ed è così che in realtà si può essere in grado di palazzare le particelle delle diverse densità.(Fare Slide Time: 24:05)Vediamo nel mondo biologico qual è la situazione. Ecco, questo è il grafico quello che viene mostrato e questa è la densità. Quindi, cosa si vede è il tasso di sedimentazione o i coefficienti di sedimentazione delle diverse molecole. E quello che si vede è che le proteine che stanno effettivamente avendo il peso molecolare molto alto stanno effettivamente avendo il minor tasso di sedimentazione. Mentre le molecole che sono di come si va da questo lato a questa parte il tasso di sedimentazione si sta abbassando.E quando il tasso di sedimentazione scenderà il che significa dover percorrere queste molecole ad altissimità. Allo stesso modo quello che potete vedere qui è il suo mostrarsi come il tasso di sedimentazione della proteina, il DNA Come pure le altre biomolecole. E, così in questo grafico, quello che stiamo cercando di mostrare è che come la densità di una molecola andrà in alto, in realtà si avrà la velocità di sedimentazione più elevata.Ed è così che si potrebbe non dover eseguire la centrifuga ad una velocità molto elevata che significa perché la molecola stessa ha la tendenza ai sedimenti è propria. Ecco perché non si deve girare ad una velocità molto alta. Ad esempio i mitocondri saranno in realtà pellettati a una velocità di 15.000g. Mentre la proteina che è presente nella frazione solubile si abbassa in realtà ad una velocità di 1 lakh 30.000g che significa o qualsiasi velocità che sia più di 1 lakh g.Così, che significa e come si può vedere il tasso di sedimentazione o il coefficiente di sedimentazione della proteina solubile si trova su un lato inferiore. Mentre il coefficiente di sedimentazione dei mitocondri così come il nucleo è sul lato superiore che significa che queste molecole non richiedono un'alta velocità da ottenere sedimentate.(Fare Slide Time: 26:17)Così, discutiamo dell'isolamento degli organelli cellulari. Così, ho preso un esempio di 2 esempi, nel primo esempio stiamo cercando di elaborare le cellule del fegato. Così, nella cellula del fegato quello che accadrà è che il se desiderate isolare le cellule e poi se vi piacerebbe essere interessati a isolare gli organelli delle cellule, quello che dovete fare è che prima bisogna fare un processo chiamato la perfusione. Quindi, la perfusione è un processo che rimuove in realtà il sangue dal fegato perché si sa che il fegato è un organo vascolarizzato.Così, il fegato sta avendo la piena fornitura di sangue e per questo quando si cerca di isolare le cellule del fegato si avrà anche la contaminazione delle cellule del sangue. Perché il sangue è presente nel fegato, quindi il fegato può essere profumato con soluzioni isotoniche come si può usare la salina o la salina tampone fosfato. E questo in realtà sta andando a rimuovere il sangue quello che è presente all'interno del fegato e che in realtà sta andando a rimuovere le cellule contaminanti.Altrimenti quando si cerca di isolare un organello, ad esempio, se si è interessati a isolare i mitocondri dagli epatociti che stanno sostanzialmente facendo le cellule del fegato non saràin grado di isolare i mitocondri solo dalla cellula del fegato. Perché anche i mitocondri andranno a contribuire dalle cellule (()) (27:54) e dagli altri tipi di cellule immunitarie ma sono presenti nel sangue.Così, nel primo passo si elimina il sangue dal fegato in un processo chiamato perfusione. E poi quello che si deve fare è dissetare questo fegato in piccoli pezzi e si omogeneizza in un tampone che è isotonico o si può usare la PBS significa salina tampone fosfato. Oppure si può usare una salina, una semplice salina come così entrambe saranno isotoniche e poi si fa l'omogeneizzazione. Quindi, l'omogeneizzazione che si può fare in un omogeneizzatore, l'omogeneizzatore è una sorta di distruttore di cellule meccaniche.Poi stiamo parlando della centrifugazione a sfumatura di densità. Così, si possono vedere le densità delle diverse molecole biologiche come le cellule microbiche che vanno in 1,05 a 115. Poi si hanno le cellule dei mammiferi che in realtà sono in questa fascia, poi si hanno le diverse tipologie di organelli che vanno da 1,1 a 1,6. Poi si hanno le proteine che vanno in 1,3 DNA e RNA.Così, la centrifugazione sfumata di densità sfrutta effettivamente la proprietà fisica di una molecola che dove la forza centrifuga è uguale alle forze oltre e alle forze frizionali. Quindi, quello che avete visto nella centrifugazione differenziale che stiamo effettivamente aumentando la forza centrifuga ed è così che siete in realtà sapete che state annullando le forze oltre che le forze frizionali.considerando che in questo caso state semplicemente facendo il contrario che significa che state mantenendo costante la forza centrifuga. Ora quello che state facendo è in realtà aumentare le forze oltre che le forze frizionali, soprattutto le forze oltre le forze. Ed è così che ciò che accadrà è la molecola che può essere pellettata in assenza delle forze oltre. Ora in realtà non verrà pellettato perché si sta aumentando le forze oltre. E di conseguenza la molecola rimarrà nel supernatante e si localizzerà in una determinata regione.(Fare Slide Time: 36:48)Così, quello che farete nella centrifugazione a sfumatura di densità è che supponiamo di aver usato una centrifugazione a densità di saccarosio. E poi ho caricato le molecole delle diverse densità su questo. Così, all'inizio tutte le molecole sono mescolate e si ha una miscela. Poi quello che accadrà è quando si corre questo per il 30 minutes quello che accadrà è che dato che tutte queste molecole stanno avendo il tasso di sedimentazione differenziale perché in realtà sono associate alle forze centrifughe differenziali.Così, quello che accadrà è che la forza centrifuga si opporrà effettivamente alle forze oltre che alle forze di frizione. Quindi, se aumenterò le forze oltre o se manipolate le forze oltre, quello che accadrà è che le molecole saranno localizzate in zona diversa all'interno di quel particolare supernatante invece di farsi pelare. Perché quello che state facendo èin realtà manipolare con le forze oltre e in un luogo in cui effettivamente si fermeranno.Che significa a questo punto per questi pellami di colore blu quello che accadrà è che la forza centrifuga per queste molecole sono in realtà equivalenti o uguali alle forze superiori alle forze di frizione, quindi di conseguenza sarà localizzata a questo. Allo stesso modo se questa è la posizione per questo, così in questa particolare posizione le forze sono ormai equiparate. E quello che accadrà è se continuate a fare questa molecola si localizzerà in una determinata regione.Ed è così che in realtà saranno separati il che significa che le molecole stanno effettivamente sfruttando le loro densità per generare un particolare tipo di forza centrifuga. E quella forza centrifuga in realtà si scontrerà con le forze oltre le forze frizionali. Ma in un punto particolare le forze di frizione più oltre le forze saranno equiparate dalle forze centrifughe e questo è il luogo in cui la molecola rimarrà lì, non verrà pellettata.Perché se si aumenta ulteriormente e se si aumenta ulteriormente la forza centrifuga allora la molecola si abbassa e rimarrà in fondo a quel particolare tubo. Così, rispetto alle centrifughe differenziali la centrifugazione a gradiente di densità sfrutta effettivamente le densità della molecola così come le densità di quella particolare anche il mezzo.(Fare Slide Time: 39:37)Così, questi sono il frazionamento che è il modo in cui si va a fare il frazionamento che significa quando si sta per partire. Quindi, le molecole saranno localizzate e poi se volete potrete spezzare effettivamente questi tubi e potrete raccogliere tutte le singole frazioni.(Fare Slide Time: 40:00)Come raccogliere le frazioni quando si va a fare la centrifugazione a sfumatura di densità. Quindi, potete immaginare di avere una miscela grezza quando lo eseguo per le 3 ore a 1, 50.000g, quello che accadrà è che ha forma i diversi tipi di band. Come la band che in realtà sono state corrispondenti alle frazioni pesanti, frazioni di luce, triadi e così come la membrana di superficie.Poi quello che accadrà è se devo rimuovere questi ciò che posso fare è, ho le 2 opzioni posso solo usare le pipette e posso semplicemente succhiarla. Così, posso mettere la pipetta a fianco a questa particolare frazione e posso semplicemente succhiare questo liquido intero e che effettivamente rimuoverò. Raccoglitore di frazione automatico per sfumature instabili e il secondo, terzo caso è possibile fare il gelo e la tagliata.Quindi, ciò che accade è nel congelamento e affettare ciò che si fa è supporre che queste siano le frazioni che hanno i diversi tipi di frazioni. Quindi, quello che fai è congelare questo e poi in realtà tagliate tutte queste in piccole fette e poi singole taglie che potete rimuovere e scongelare e che in realtà vi darà quel frazioni individuali. Quindi, tutto questo riguarda le frazioni cellulari e come si può essere in grado di sfruttare i diversi tipi di centrifugazioni.O si utilizzano le centrifughe differenziali o le centrifughe a gradiente di densità per isolare i diversi tipi di organelli dalle cellule eucariotiche. Abbiamo anche discusso della cellula procariotica e di come si può essere in grado di frazionare le cellule procariotiche per isolare la frazione periplasmatica così come le frazioni citoplasmatiche. Quindi, con questo vorrei concludere qui la mia lezione, grazie.