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Così, ultima classe di quello che si è discusso, stavamo discutendo delle varie cellule vegetali della trasformazione genetica, quali sono i diversi modi in cui le cellule vegetali possono essere trasformed.Così, si parlava di quella generalmente in letteratura si troverà che si utilizzano le trasformazioni agrobatteriche. Agrobacterium stessi sono ingegneri naturali a trans, hanno la macchina per trasformare le cellule vegetali attraverso una sezione di DNA presente in essi plasmide DNA che si iscatta come T-DNA che si integrano in modo incontaminato. Come abbiamo sfruttato è che il T-DNA intrinseca al DNA presente nella agrobatterio che si disgrega che viene portato via, e di un altro vettore come questo segmento di T-DNA,a cui l'agrobatterio ha la macchina per integrare questo vettore plasmidi che si è arricchito nell'agrobatterio per integrarsi nelle cellule vegetali. Così, ora quali sono i diversi tipi di vettori di cui si stava discutendo l'ultima volta, i vettori più utilizzati sono vettori binari, i vettori binari per cui si chiamano origine binaria delle repliche, possono replicare E. coli così come in agrobatterio. E poi cos' altro il trasferimento coniugale può avvenire tra E. coli a agrobatterio, e dall'agrobatterio alle piante offics.Ora, stavo parlando anche di altri vettori che possono essere utilizzati per la trasformazione genetica nelle cellule vegetali. Questi sono vettori intermedi che sono questi come ad esempio, pBR3 doppio due, si ascolterà se si lavora in quest' area. Si tratta di vettori di dimensioni più piccole in E. coli a, che contenevano il T-DNA e sono utilizzati per superare i problemi a causa delle grandi dimensioni del til Ti plasmid.Quindi, come dicevo c'è un plasmide presente nel theagrobacterium che è disarmed.Now, questo si chiama plasmid helper, che avrà la virulenza regioni.Ora, questo piccolo plasmide può moltiplicarsi nell'E. coli I e poi attraverso il transfersit coniugale possono essere portati nell'agrobatterum.Ora, questi plasmidi in agrobatterio, non possono essere moltiplicati, ma poi possono essere trasformediti possono essere utilizzati per trasformare le cellule vegetali. Ora, co - integrative, a volte ciò accade che a causa di presenza c'è la ricombinazione omologa. Ora, in theagrobacterium, alcune regioni T - DNA disarmate, ma le altre regioni se c'è una somiglianza tra quel componentissimo DNA che è presente in questi vettori, poi la trasformazione avrebbe luogo, la ricombinazione avrebbe luogo, e ci sarà un materiale genetico di scambio, scambio di materiale genetico. E questo T-DNA dove c'è la tua regione MCS, dove questo si integra nell'entireone singolo plasmide che può poi agire come un plasmide completo per la trasformazioneche avviene nelle cellule vegetali, quindi si chiama come plasmidi cointegrativo. Poi si è chiamato il plasmiointegrativo. Poi il capositore Ti ha plasmato il tuo intrinseco Ti plasmide che è stato disarmato, disarmato significa che le regioni oncogeniche sono state il T-DNA da asporto. Così, o si hanno plasmidi separati che aiutano nell'evento di trasformazione che isessi avranno regioni che trasferiscono regioni che aiuteranno nel trasporto di questo T-DNA delle vostre piccole vectors.Now, si tratta di piccoli plasmidi mantenuti in E. coli, questi sono plasmidi di tipo helper per l'agrobatterio trasformano transfer. Contiene regioni di trasferimento e regioni di mobilitazione, che consentono il trasferimento dei vettori intermedi di coniugazione in agro. Sostenere se vi è la coniugazione che è assente, non tutti i vettori sono vettori coniugali. Quindi, se la coniugazione è assente, allora hai bisogno di un helper plasmid che possa aiutare nel trasferimento di questi vettori nell'agrobatterum.Così, questo è quello che dicevo co - integrativi vettori in cui la ricombinazione omologa cointegrativa all'interno dell'agrobatterio può essere obtained.Now, quali sono le diverse tecniche di trasformazione, o ciò che è noto alle diverse tecniche di trasformazione è la tecnica della co - cultura una è quella, e l'altra è la tecnica della trasformazione di planta. Direct l'impianto è trasformato ora co - cultura con gli esploratori tissutali si incontra, inizia entro colture in vitro e dalla rigenerazione delle colture in vitro si fa per ottenere il trasformedplant; in caso contrario direttamente le parti vegetali si possono trasformare da sé stesso il seme stesso o lo zigote [ ot/o] - o al momento della floralpollinazione, solo preditore all'impollinazione quando i fiori la si esce c'è un metodo di dip di fiori o un metodo floraldip attraverso il quale l'agrobatterio può entrare nello stabilimento. E dopo l'impollinazione si potrà trasformare la zigote, quindi nella progenie si vedrà transformationaccadere. Poi il trasferimento genico diretto o il metodo di consegna fisica stiamo usando l'agrobatterio come strumento per trasferire o i metodi di trasferimento indirettgene ad esempio, la pistola gene che è la quale penso che si debba avere attenzione. E ci sono altri metodi che cercheremo. Così, i metodi mediati dell'agrobatterio, quello che è ciò che è fatto sono i prerequisiti per il trasferimento genico agrobatterico, coinvolge gli esploratori, gli esploratori devono produrre acetosiringone. Cos' era l'acetosiringone?. Così, questo è stato usato per indurre i virulencegeni presenti nell'agrobatterum.So, acetosiringone, quindi il tipo di esploratori, l'età dell'esploratore anche a volte mattersper le trasformazioni di successo. Dunque, c'è da produrre queste molecole di segnalazione che possono attirare l'agrobatterio e la riduzione dell'aumento della vicinanza tra l'agrobatterio e la cellula vegetale. Ora, l'esploratore deve produrre acetosiringone o altri composti attivi altri composti fenolici per indurre i geni della virulenza. Poi l'agrobatterio dovrebbe avere accesso a cellule competenti per trasformazioni. A volte si osserva anche se la trasformazione è fatta, ma la rigenerazione non avviene. Per la rigenerazione avviene, servono cellule competenti per la trasformazione, e poi totipotti da mantenere nelle cellule trasformate in modo da raggiungere l'impianto rigenerante, quindi un compito difficile non facile.Quindi, ora per l'agrobatterio la trasformazione di successo nell'accesso delle cellule competenti è necessaria non tutte le cellule saranno competenti in natura. A volte vedrete che metodo simile, ma continuate a ripetere solo alcuni willbe riusciti, gli altri forse non a causa di tutte queste regioni, non tutte le cellule del thecallus saranno della stessa natura biochimica. Poi gli esploratori utilizzati per la trasformazione del thetype di esplorare l'età di esplorants.Now, oramai è generalmente preferito che si dividano attivamente le cellule quando le trasformazioni dovrebbero essere done.Perché, i giovani esploratori sono preferiti, non vecchi, perché si pensa?. Anche per la trasformazione, la rigenerazione è il secondo passo. Per una trasformazione di successo capita che si debba lavorare con giovani gerenti con cellule in rapida divisione se si lavora con le colture cellulari .. Quindi, ma lasciaci .. Facciamo un paragone tra la sospensione della cellina matura e la parete cellulare secondaria arriva quando l'organogenesi ed è in tema presente non è .. Ci può essere la probabilità può essere higherwhat else.Quindi, le cellule maturate sono lì una grande differenza tra le cellule maturate da cellule andistese. Ifte ricorda che stavo dicendo nelle classi precedenti che le cellule più piccole le vacuolite inviate sono piccole, il citoplasmo è più denso, quindi la probabilità è più alta. Nelle cellule mature, i vacuoli diventano grandi il citoplasmo è meno dense.Quindi, il denser è il citoplasmo più alto è la probabilità di trasformazione. Così, e i moreovervacuoli contengono enzimi che possono degradare rapidamente il DNA extracellulare. Così, isprifero che si usano le cellule più giovani rispetto alle cellule maturate. Nella letteratura si finirà le cellule che vengono usate o i tessuti utilizzati variano da fromcallus, tutti i tipi di colture in vitro possono essere trasformati, callus, cellule di sospensione, protoplasti, poi tessuto intero organo intero vegetale così se c'è un ampio range.Ora, dopo che gli esploratori sono stati co - coltivati con l'agrobatterio, come rilevare che le cellule sono correttamente trasformate o meno. Abbiamo già letto ora che in base al marcatore di selezione o al sistema marcatore presente, se si tratta di asili a base istochimicamente utilizzabili o l'antibiotico selectionmedium o il mezzo di selezione herbicida può essere utilizzato per aumentare la probabilità che tu finisca nelle cellule trasformate con successo con successiva sub di coltura. A parte il marcatore o l'agente selettivo, l'agrobatterio inibizionista di inibitori di crescita altri antibiotici come il throughagrobacterium di carbonio è sensibile towardsit.Quindi, viene anche usato. Perché si pensa e quando è questo usato o quando deve essere usato?Per la trasformazione, che cosa stai facendo si sta portando l'agrobatterio in stretto contatto con le cellule, ma in definitiva cosa vuoi trasformare le cellule vegetali trasformate, non si può keepcrescendo l'agrobatterio perché crescerà in modo da crescere successivamente la vitalità delle cellule e il growth.Quindi, dopo una trasformazione di successo, la cultura successiva deve essere portata via dall'agrobatterista da rimodellare .Così, dopo 48 ore, generalmente 48 orticole la timeline per l'esposizione con l'agrobatterio, e poi si conserva sull'alta concentrazione di saline di carbonio o di qualsiasi antibiotico dove agrobatterumis sensibile verso. Quindi, successivamente con ridotta concentrazione dell'antibioticyou keep sub culturing. Anddopo le successive sub culture l'antibiotico viene rimosso dal mezzo, perché l'antibiotico può essere inibitorio della crescita delle cellule vegetali che non vorreste avere fori delle cellule trasformate. In generale le cellule trasformate, perché le loro growthrate sono compromise.Così, i marker di selezione sistemi i livelli tossici, quindi ciò che deve essere ottimizzato il livello di tossicazione dell'agente di selezione è variare species.Quindi, una specie specifica il tempo di esposizione è specie specifico, la concentrazioneantibiotica è specie specifica, quindi deve essere ottimizzato.Così, questo è l'intero protocollo si può passare attraverso di esso. Questo è per il vostro riferimento il protocollo teorico come è done.Quindi, quello che è fatto è che si scelga un apposito esploratore, poi si sterilizza gli esploratori, gli esploratori sono portati inte growil agrobatterio in sospensione per 24 ore. Si cerca la fase di crescita perché poi le colture agrobatteriche sono attive.Quindi, generalmente le colture di fase di log sono preferite. Una volta che l'agrobatterio è cresciuto ci sono diversi ceppi di agrobatterio che sono presenti e che sono virulentto infettano le cellule vegetali, ma è molto altamente specializzato .Così, se uno agrobatterio come ad esempio, l'agrobatterio LBA 4404 o 9402.So, si tratta di ceppi diversi che sono noti per essere altamente virulenti, ma non è necessario che perché ha lavorato con una sola specie vegetale, si lavorerà ugualmente con other.Quindi, è necessario scegliere il ceppo agrobatterico coltivare la fase attiva, le cellule di fase di log sono utilizzate. Poi anche per esporre le cellule è possibile utilizzare diverse tecniche. Ciò che serve o si è ferita crea una ferita nell'esploratore e poi esporre la suspense l'esploratore che esplora il suspension.Ora, il tempo di esposizione varia anche tu non puoi mantenete formore di 15 o 10 minutes.Così, generalmente da 10 a 15 minutes, tenete presente, allora dovete lavarla, quindi che la crescita in eccesso di agrobatterio non accada quando lo tenete in tefor incubationfor 48 hours.Così, è necessario variare il tempo lì dell'esposizione il tempo di esposizione, canvare l'agrobatterio concentrazione la concentrazione di autosospensione. Si possono avere differenze quando si utilizza la coltura per co coltivare con le cellule vegetali. Poi si può variare il tipo di esploratore che può essere variegato. Poi parlavo del ferimento ora ferendo se stesso può essere creato tramite differenziways.Così, la gente ha scoperto che usando una siringa riempita con la sospensione dell'agrobatterio, si fanno lesioni sulla midria delle foglie che espandono e che ha dato origine ad una maggiore efficienza nella trasformazione. Poi le persone usano il semplice metodo dip, dove espongono l'esploratore ferito da un bladeo scavando buchi nelle foglie o nelle esplorazioni e poi esporta it.Così, ci sono diversi fattori che devono essere ottimizzati. Sembra facile, ma ci sono numero di fattori che devono essere ottimizzati per ottenere una cultura successitrasformata.Poi in planta la trasformazione utilizza generalmente il metodo della dip floreale in cui il flowerè immerso nella sospensione dell'agrobatterio, e poi conservato per l'incubazione per qualche tempo che risiede si dice che o i semi stessi possono essere superficiali sterilizzati e immersi nella sospensione tale che l'agrobatterio possa trasformare i semi. E una volta rigenerati o quando esce il seedling, il teyinfetto thetema, le aree aeriali o le regioni a terra. O quando i semi, quando i fiori sono immersi con l'agrobatterio o portati a contatto con l'agrobatterio poco prima dell'impollinazione, l'impollinazione duraturo o dopo l'impollinazione che hanno l'agrobatterio presente all'interno possono infettare tezygote o possono infettare le cellule germinali che vanno a getelo comportamente.Ora, portando a progenie che sono transformed.Ora, parlando di metodi di trasformizzazione di geni diretti, l'elettroporazione è una tecnica ben nota che viene utilizzata anche per le trasformazioni batteriche. Poi quali sono i due diversi tipi di elettroporazione che sono utilizzati frequentemente. Si tratta di metodi a basso voltaggio a bassa tensione significa durata temporale isaumentata, ma frequenciesà più bassa, in genere si è scoperto che i metodi ad impulsi ad alta tensione si trovano a lavorare meglio rispetto ai metodi a basso voltaggio a bassa tensione becauseil danno al DNA è minore in quel case.Now, ciò che viene fatto la tensione ottimale, quindi ciò che può essere ottimizzato la tensione che utilizza il tempo per cui viene applicata è ottimizzata. Poi le frequenze di trasformazione sono aumentate di diverse pieghe aggiungendo alcune altre tecniche di calore o addingyour peg. Perché secondo te aiuta?Hai sentito parlare di cellule competenti?Come sono resi competenti?Le cellule competenti significa che diventano più suscettibili all'assorbimento dei DNA.Come sono resi suscettibili?Ha, qualsiasi divalente anche il magnesio può essere usato: come lo rende suscettibile?Quindi, aumentando così la vicinanza tra il DNA extracellulare e riducendo la repulsione, perché entrambi sono imputati negativamente in modo che sia così.E che dire di PEG, quindi che cosa fa?. Quindi, cosa sta effettivamente facendo, ogni cosa sta facilitando l'assorbimento facile. Il glicole polietilenico è anche molto frequentemente usato .. DMSO, polietilenglicole sì, riduce il. Poi, quindi quello che è fatto è nelle metodologie chimiche che parlavamo delle cellule sono prima messe in competizione. Quindi, gli ioni divalenti possono essere utilizzati per ridurre la repulsione di carica come aumentare o aumentare la vicinanza tra i due DNA.L' altra cosa è che c'è un utilizzo delle persone manipolare il pH, la gente addpolietilene glicolina il mezzo e la concentrazione del DNA è anche manipolata per potenziare l'efficienza della transformation.Now, alcuni di questi metodi è necessario tornare indietro e controllare quello che fanno, cercheranno di condensare il DNA o concentrare il DNA.E concentrando la riduzione del DNA la vicinanza tra il DNA extracellulare e la membrana plantellulare aumenterebbe la probabilità di successo, quindi ecco quali sono queste cose do.Ora, l'infettivita lipo sono alsol' uptake extra cellulare del DNA può essere improponibile incapsulandoli sotto forma di liposomes.Ora, l'assunzione di liposoma è un fenomeno ben noto in cells.Così, liposoma non solo aumenteranno il DNA dai nucleasi, quindi anche questo modo si aiuta. Ora, cosa sono i liposomi, mi auguro che sappiate cosa sono i liposomi, sono simili che avranno entrambi fine idrofobi idrofobi. avere un doppio strato. Come il bilayer fosfolipidico. E incapsuleranno il DNA within.Now, possono essere indotti a fondersi con le cellule o il protoplast utilizzando PEG e canpertanto, essere utilizzati per il trasferimento genico. Poi ci sono diversi vantaggi quali possono essere migliorati tutti i diversi vantaggi con infezione da lipo, bassa tossicità cellulare, stabilità e conservazione dell'acido nucleico, poi elevato grado di riproducibilità e endocytosis è un fenomeno ben noto già presente nella cellula, in modo che possa essere facilmente ripreso dalla cells.Now, il calcio fosfato precipita un altro metodo cloruro di calcio anyways usdif i fosfati sono presenti, poi condensa il precipitato di DNA, il DNA tale che becauseit è condensato, riduce o permette alla cellula di portare il suo molto più vicino alla membrana cellulare, aumentando così la probabilità di assorbimento del DNA.Microiniezione extracellulare questo è il trasferimento di un micro iniezione. Non è che facile, uh sotto il microscopio si tiene la cellula bene usando o tramite freezingit su uno scivolo, usando la lisina poly. Poly lysinea causa delle accuse presentit cercherà di infilarlo in un unico luogo, e la pressione di aspirazione è creata tale da non muoversi. E poi attraverso quell' assemblaggio di micro iniezione, il DNA viene provato a mettere direttamente dentro la membrana cellulare nel citoplasmo o nel nucleo della cellula vegetale .Ora, ciò che altri metodi diretti possono essere utilizzati è in letteratura, vedrete che la peoplesa ha usato la fibra di DNA mediata in cui vengono usate fibre di nano molto piccole, le siliconfibi sono usate con alta velocità, in modo da poter impregnare la membrana plasmatica nella valvola della cellula e il DNA viene consegnato nel citoplasmo. Poi la consegna del DNA indotto laser è anche reported.Ultrasonication, poi l'iniezione macro è la tua ipodermica siringa di cui parlavamo, dove può essere iniettata direttamente nel citoplasmo o nel nucleo. Poi micro proiettile che è il tuo metodo di pistola gene in qualunque altissima velocità, si canta con le cellule vegetali o il cappuccio degli esploratori sotto un'atmosfera inerte con elioumgas. E il vapore acqueo che utilizza la carica elettrica in alta tensione, si crea l'acqua ad alta velocità, e trasporta il DNA extracellulare rivestito con il tungsteno materiale inerte o nanoparticelle d'oro, che possono essere iniettate sotto alta velocità negli esplorants.I fermati qui. E poi la prossima classe cominceremo con i reattori bio della cellula vegetale che è l'ultima parte del corso.