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Allora, benvenuti a questa lezione, proseguiamo sugli strumenti del DNA e sulle biotecnologie, nelle lezioni precedenti abbiamo discusso dell'unità ereditaria o del DNA, avete anche imparato i concetti teorici di strumenti che potrebbero aiutare a visualizzare e amplifyDNA utilizzando l'elettroforesi in gel di agarosio e la reazione a catena della polimerasi o la PCR processes.Oggi, vi mostreremo in laboratorio come queste tecniche potrebbero essere perforate. Ora, iniziamo la dimostrazione di laboratorio per illustrarvi queste tecniche e mostrarvi come questi esperimenti possano essere effettivamente eseguiti nel laboratorio.Ciao a tutti, sono Srishty, l'TA di questo corso, quindi ora faremo agarosio gelelettroforesi per verificare se il nostro prodotto di procedura è arrivato o meno e quindi per quel wewill ci faremo il gel. Prima di tutto faremo 2% gel di agarosio in polvere anderemo ad aggiungerlo a TA buffer.Così, ora aggiungeremo 2 grammo di agarosio e faremo anche 100ml di TA tampone, quindi ora faranno sciogliere l'agarosio in polvere usando microonde. Così per 2 minutes minuti lo metteremo dentro e dentro, lo mescoleremo, sono...un gel è fatto e lo riperderemo su una unità di casting gel. Ora come nostra gel si è raffreddato, ci aggiungiamo EtBr qui nel rapporto di 0,5 microgrammo perml. Perché stiamo aggiungendo EtBr, stiamo aggiungendo EtBr, in modo che il colorante si intercalco con il campione di ourDNA e dato fluorescenza quando osservato sul transilluminatore, prenda sempre cura dei tubi di EtBr in biohazard e come è un potento.Ora, ci verseremo il nostro gel, così come potete vedere questi sono i tipi di unità di casting che cantiamo, questo è il più grande in cui ho già castonato un gel, è un più piccolo che abbiamo castonato in questo momento, questo è il pettine della sua dimensione in questo prima che il gel si solidifica, questi sono i diversi tipi di pettini e unità di casting disponibili, quindi questa è l'unità elettroforetica in cui stiamo sostituendo il nostro gel dopo che si solidifica per la corsa. E questa è la tensione jointer.Today, vi porterò al processo PCR e cercheremo di imparare come il processo si sia verificato in tempo reale così in sostanza, cos' è il PCR?PCR è come suggerisce il suo nome è la reazione a catena della polimerasi. In questa materia, in questa tecnica ciò che vediamo è; abbiamo una piccolissima quantità di DNAor qualsiasi campione poi, in questo processo il campione viene amplificato a un milione di volte, così che a volte quando si lavora in una ricerca sul campo clinico o c'è una scena del crimine in cui si ha molto meno quantità di qualche campione si vuole fare qualche ricerca con esso o si deve dire dare qualche identificazione allora, non si può fare con una quantità così piccola di cose, quindi per questo facciamo PCR.Così, questa è la macchina chiamata termociclatore che usiamo per PCR come potete vedere il pozzo piastre, dove mettiamo un PCR tubi e eseguiamo un PCR, qui ci metteremo un PCRprodotto che il mio collega ci ha dato e verificeremo il suo result.Così, prima di iniziare la procedura come si sa, i componenti di base di PCR che si nutre, questo il buffer di reazione di cui abbiamo bisogno, questo è il nostro enzima TaqDNA polimerasi. Questi sono i 2 primer per la nostra reazione, questo è inverso primer, questo è primer forward. Si aggiungerà tutti questi contenuti ad un tubo mix master, questo è 2 molare dNTP.E si pone l'acqua gratis. E questa è la quantità di reagenti che aggiungiamo in ogni reazione, questo è per la reazione 1x, questo è per 4x.So ora, come sapete i componenti del PCR e abbiamo aggiunto nel master mixwill be aggiungelo a un PCR. Questo tubo ho già aggiunto 23 microlitri di master mix e 2 microlitri di nostro; sono...cosa che fa un master mix contiene; lo abbiamo già aggiunto ad un sistema di PCR, che ho già aggiunto, abbiamo alreadymade un master mix.Quindi, da questo master mix, ci aggiungiamo 23 micro litri di un master mix a tubi PCR, in questo tubi noi hanno già aggiunto 2 micro litri del nostro DNA che vogliamo; loop ishere, ora metteremo un tubetto nella macchina PCR, prima di mettere la macchina dei tubesina PCR, quindi faremo girare il nostro tubo, così ci faremo girare il nostro tubo, quindi ora come potete vedere una macchina è accesa, questo è un termociclatore, quindi in questo termociclatore ci aggiungiamo un tubo e in questo modo staremo a chiuderla, come potete vedere qui, come potete vedere qui, possiamo vedere manyopzioni; run, new, edit, view, files e tools, ho già impostato il programma che è gapDH perché stiamo andando a controllare qui per Gap DH gene.So, qui il volume di esempio è 25, inserire, visualizzare il programma, questo è il programma che useremo come potete vedere siete in grado di leggere più temperature qui e numero di passi, quindi l'enzima sarà attivato per ulteriori denaturazione, il secondo step è 94degree per il 30 seconds, in questa fase la denaturazione di un DNA si verificherà, nella denaturazione si separerà. Nel terzo passo, è di 58 ° grado per 30 seconds, ora questo è il passo sottostante, dove i primer si annidano, quando i primer verrà anneal, il processo andrà avanti, il prossimo è di 72 gradi per 30 seconds minuti che è il passo di estensione, quindi in extensiononce la sintesi, quindi in questo passo di estensione è per il 30 seconds. In fase di estensione, quello che si verificherà sarà che la sintesi andrà avanti e una volta che un prodotto sarà formato un altro prodotto sarà formato mentre si ripeterà questo ciclo per 35 volte come potete vedere qui, 35 volte vanno to2, quindi questi 3 passaggi verranno ripetiti, avremo più copie. Prossimo sarà di nuovo 72 gradi per 10 minutes minuti, quindi per estensione finale se qualsiasi prodotto è di sinistra estensione, si verificherà di nuovo. E ultimo è hold; hold a 4 ° grado, perché sarà trattenere la temperatura tonormale per il raffreddamento della camera, così ora come sappiamo in programma saremo runninga PCR program.Così, come potete vedere ora è iniziata e qui possiamo vedere un PCR è iniziato e ci vorrà questo tanto di tempo per completare un programma; ora come potete vedere un gel si è solidificato e lo metteremo su un'unità di corsa, come potete vedere è adeguatamente solidificato, quindi ora ci prenderemo out a combs e puttinga gel nell'unità, questo è 1x TAE e dobbiamo aggiungerlo in modo che tutto il nostro gelato ci immerga, quindi, (FL) così ora aggiungeremo un DNA alla colorazione di carico che qui si è macchiata. Questa è la colorazione di carico 1x, ad essa ci aggiungeremo un prodotto PCR che è, che sarà takingas 8 micro litri e dopo averlo aggiunto tramite pipetting, lo mescoleranno correttamente.E lo cariceremo su un gel, quindi ora per verificare se i prodotti; i prodotti PCR sono di uno desiderato o non lo controlleremo caricando la scala del DNA in esso, la dimensione di GapDH qui è di 595 coppia base, quindi abbiamo caricato 100 coppie di basi e la colorazione di carico indossata è questa, quindi la scala che abbiamo usato qui è 100 coppia base di DNA perché la dimensione del prodotto è di 595 base pair.Ora, noi eseguiremo un gel assicurati che tu effettui le connessioni correttamente e ora, così ora ci troveremo la nostra tensione; ci terremo 100 volt, come puoi verificare per 1 ora e premere su corsa, così come potete vedere qui le bolle inizieranno a uscire così, thegel ha iniziato a correre. Guardiamoci la seguente animazione per capire meglio questo concetto. La trascrizione inversa PCR è utilizzata per generare più copie di DNA con RNA come materiale startingmaterial. La molecola di RNA modello è prima inversa nel corrispondente cDNA bymezzo della trascrittasi inversa enzimatica, questo enzima che si trova comunemente in virusesi in grado di sintetizzare il DNA da un modello di RNA. Il modello di modello a 72.Traditional PCR viene poi eseguito sul cDNA ottenuto con aggiunta di primer che sono ammessi ad annezionare a 54 gradi centigradi. Questo è seguito da aggiunta di nucleotidi e taq polimerasi che esegue allungamento del filone di modello a 72 gradi centigradi. Secondo e successivo round di PCR risultato di ulteriore amplificazione del cDNA di separazione degli interessi viene eseguita a 95 gradi centigradi seguito rispettivamente da primer annealing andelongation in questo modo, la nuova trascrizione di mRNA originariamente utilizzata è amplificata nella forma del suo corrispondente cDNA, che può poi essere studiata ulteriormente. Il doppio DNA strampalato che deve essere amplificato è riscaldato a 95 gradi centigradi per brindare alla separazione degli strati, una volta che i filoni sono i primer separati sono aggiunti lungo le molecole di DNA della sonda che hanno la molecola di quencher e reporter legata alle sue estremità. Una volta che questi hanno annesso al template DNA si aggiungono i filamenti del DNA a 54 gradi centigradi e la temperatura è di nuovo aumentata a 72 gradi centigradeto effettua strand allungamento. La polimerasi taq continua ad allungare il filato di DNA, quando raggiunge la molecola della sonda legata, la 5 prime a 3 prime exonucleasing attivitàdi taq polimerasi degrada la sonda nei suoi frammenti nucleotidici e continua toelungare il filone del DNA. Il colorante reporter rilasciato così viene separato dalla molecola del quencher durante questa processione e la fluorescenza emessa può quindi essere rilevata usando un rivelatore adatto. L'aumento della fluorescenza in tempo reale PCR è direttamente indicativo della quantità di nucleotide che si sintetizza ed è quindi, uno strumento utile per misurare l'espressione.I speranza conoscono i tuoi concetti per gli strumenti che vengono utilizzati per l'amplificazione e la visualizzazione del DNA è chiaro ora. Nella sessione odierna abbiamo appena intravisto un occhiello su come eseguire l'agarosio gel elettrophoresisand polymerase chain reazione. E in realtà, l'intero esperimento richiede molto tempo ma per darvi una demo abbiamo fatto le cose in pochissimo tempo ma potete sicuramente, pensate di sapere in che modo potrete utilizzare questi strumenti semplici per progettare i vostri esperimenti e come potrete fare la biologia molecolare per capire alcuni concetti biologici specifici quando si tratta di aree di ricerca, ora potete iniziare a pianificare quegli esperimenti. E questi strumenti sono in realtà molto più semplici che potrete implementare facilmente nei laboratori, spero abbiate goduto della sessione di laboratorio, grazie.