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Passiamo qui e parliamo di un'altra tecnica rivoluzionaria, ovvero reazione a catena polimerasica o PCR, qualcosa di molto simile alla clonazione di geni ma qui si sta usando alcune sostanze chimiche per fare più copie di un dato scienziato gene.A che è; abbiamo, chi ha realizzato, ha un miglio di contributo in questo campo, Kary Mulis nel 1984, lui per la prima volta scopri questa reazione a catena di polimerasi e alcune di queste scoperte accadono qualche volta accidentalmente, se ricordate che vi ho fatto mentioningete in voi conoscete vecchio ambiente quando avevamo questi batteri RK e alcuni sapori, l'organismo che vive nel condizioni estreme soprattutto, si conoscono gli halophilesand alcuni termofili. Quelli che stanno vivendo in condizioni molto estreme, se osservi quei particolarorganismo potreste ricavarne alcune proprietà e quindi, Kary Mulisè in grado di isolare alcuni batteri da una sorgente molto calda delle sorgenti termali di zolfo che era in grado di ottenere alcuni batteri, termo aquaticus che può resistere e ancora riprodurre a 95 gradi, temperatura di 100 gradi, quindi ora questi enzimi danno a quel batteri quella proprietà, che può effettivamente farla vivere ancora in quelle hot temperature.Così, lui usato isolato quell' enzima, taq polimerasi e che in realtà era meglio strumentalin che sviluppava questa particolare tecnica nota come catena polimerasi reazione.Quindi, sostanzialmente nella reazione a catena della polimerasi, si hanno 3 processi; uno è il DNA strandanico separato, il tuo DNA a doppio strato, li riscaldarli, così che il DNA a doppio filato diventi unico standard, si uniscono dei primer o un breve tratto di nucleotidi, che unirà l'estremità opposta della coppia da 5 ° grado; 5 primes a 3 primes e poi si desidera toavere una sintesi del DNA usando taq polimerasi, tutti i nucleotidi, che sono richiesti magnesiumcloruro etc. tutto ciò che aggiungi nella reazione mix.Quindi, il successo della reazione a catena della polimerasi è arrivato dalla scoperta chiave di conoscere abouttaq polimerasi che è stato isolato dal thermus aquaticus, vivendo nel caldo; le sorgenti termali. La stabilità di questa polimerasi di DNA ad altissima temperatura è stata molto utile per deridere questo processo di reazione a catena della polimerasi perché questi batteri sono stati in grado di vivere andriprodurre anche a 95 gradi. E quindi, l'enzima taq polimerasi che ne è stato isolato è diventato molto utile process.Così, sostanzialmente questi sono i 3 passi che accadono in una reazione a catena di polimerasi, prima si ha il DNA a doppio strato che si sta denotando ad altissima temperatura 95 gradi e ora, questo diventa 2 single standard DNA.Poi si sta aggiungendo un breve tratto di nucleotidi, che può essere ibridato alla regola del pairing in omaggio nello stesso modo. E ora, da entrambi i lati, si sta dando sapere che la situazione in cui ora il distacco del DNA può essere sintetizzato, per fare questa parte si sta aggiungendo la polimerasi taq. Si sta anche fornendo la giusta temperatura qui che è annealing temperatura e youare aggiungono tutti i dNTP, o i nucleotidi che sono necessari per la sintesi. Questa cosa sta accadendo come parte di estensione, quando ormai si sta formando un nuovo strand, il DNA a strascico è diventato doppio bloccato e una copia di DNA è diventata 2 copie di DNAhere.In tutta questa cosa più importante per capire è; primer, quali sono i primer; si ha un'idea o una comprensione per quali sono i primer?D'accordo, questi sono se si è una grande sequenza genica, all'interno della grande sequenza genica, non si amplificano il gene completo, si potrebbe voler amplificare un, si conosce una grande regionazione.Così, si sta trovando qualche regione che può essere utilizzata per amplificare che il gene e lei aresinizzano alcuni nucleotidi che stanno avendo delle coppie di basi opposte opposte. E si sta usando quei brevi tratti di nucleotidi che potrebbero arrivare da 18 a 28 nucleotidi un punto di partenza per la sintesi del Dna per accadere, ora questi si sa, in qualche modo, si sta solo aggiungendo ATGC e mettendo quella in base alla sequenza complementare ofDNA, quindi si vuole garantire che si stia raccogliendo la sequenza da una regione che sta notando troppi contenuti GC o non si sta avendo la stessa coppia di base in multiples che si sa, non A è continuo o G è continuo presente. Quindi e non dovrebbero essere auto - complimentarsi anche qui, una cosa più importante qui è la Tm o la temperatura di fusione perché se si torna indietro, questo processo whichis annealing, si sta dando una temperatura specifica per questo primer per legarsi alla filatura del DNA questo accade a una temperatura specifica che è nota una temperatura di annealing, a saper fare calcolare ciò che può essere possibile annealing temperatura osservando calcolatingi AT e GC contents.Quindi, questa è la formula per fare che puoi avere A + T volte 2 + G e C contentstimes 4 che ti darà il valore Tm e che il valore Tm potrebbe essere di 65 gradi o 70 gradi, può essere usato come temperatura di annealing, quindi inizialmente hai usato una temperatura molto alta che era per la denaturazione, poi stai riducendo la temperatura in basso ora, stai portando un primerto a legarti a quel particolare filone di DNA che usa la temperatura annealing. E poi tu per ampliarne ulteriormente la sua ulteriore, di nuovo si sta cambiando la temperatura intorno al 72 sgrassante per la taq polimerasi a work.Quindi, analizziamo una delle sequenze e supponiamo di voler progettare teprimer per questa particolare sequenza genica e vuoi amplificare questo tu sai, startingfrom this arrow region, vuoi amplificare il loro gene, quindi per boththe DNA strands, abbiamo accennato qui la, la sequenza completa qui, quindi per il forwardprimer devi avere il pairs.p.a. di base oppresso di base opposta, se A è qui o la G è qui, quale sarà la coppia di base complementare?C, giusto, se hai A allora, C allora, quello che sarà il complimento, quindi puoi startwritti su quella che può essere la sequenza di primer in avanti, scrivi che in the5 prime a 3 prime direzione, questa è una sequenza genica che abbiamo su di amplificare il gene fromquesta parte qui, per farlo stiamo dicendo che puoi iniziare a fare primer, puoi sintetizzare primer che sarà; il primer in avanti sarà complimentoso per questo particolare segmentato che vuoi amplificare.Quindi, se hai una sequenza opposta di quella in 5 prime a 3 prime direzione che può essere il tuo primer in avanti, ora il primer inverso è molto più semplice e facile becausewe che deriva tutto da 5 primi a 3 prime, ti stai sintetizzando di fatto, chimicamente sinteticamente i primer, ora sappiamo sintetizzare le basi chimicamente ATGC, quindi si può sintetizzare la sequenza nucleotidica, quindi puoi davvero sapere aggiungere un po' d'acqua per rendere il tuo mix di primer, quindi ora tutto quello che vuoi avere sempre nei 5 primi a 3 prime direzione questo è ciò che hai usurpato qui per la avanti primer.Ora, se un primer opposto si desidera progettare da questa parte qui, diventa molto più semplicissimo perché si sta solo scrivendo la sequenza dell'altro filone di DNA in questo caso per il primer inversa. E quindi, la tua sequenza per il reverse primer diventerà una partenza da C, diventerà CAT GCC, A e puoi continuare con quella. Sei con me?Quindi, vuoi amplificare un determinato segmento di gene e ti ho mostrato le frecce dalla tispart a questa parte che vuoi amplificare che il DNA, per fare che stai aggiungendo un piccolo tratto di nucleotidi che vuoi sintetizzare chimicamente insieme a quei sintetizzatori chimici, aggiungete l'enzima, aggiungete i nucleotidi, renderete il mixturetutto le condizioni di temperatura giusta all'interno dello strumento. E eseguire la reazione a catena della polimerasi, in modo che il vostro DNA possa continuare a moltiplicare i multiplecopie che è l'intenzione qui. Per fare questo, il primer in avanti compiuto da 5 prime a 3 prime direzioni, basta usare una sequenza omaggio di esso e hai ottenuto questa particolare sequenza derivata forthe forward primer. Reverse primer; il filone opaco di questo che abbiamo usato per il DNA e la becausewe dobbiamo ricavare in 5 primi a 3 primi in formazione, stiamo semplicemente scrivendo la sequenza da C 80 onwards.So, ecco dove potrai sintetizzare e progettare questi primer ora, se ti sto dando una sequenza primer ladina che va dai 5 primi a 3 prime, quale sarà la temperatura di fusione, dato che hai questa formula che non verrà mostrata nell'esame, whatwill be the melting temperatura Tm per questo particolare primer, un dritto in avanti, giullare A, T' s, G's e C s.So, se questa era una temperatura da utilizzare per PCR, quindi la seconda condizione che si annega, si va a usare 64 gradi per annealing perché si ha qualche idea teorica che questa sia la temperatura giusta in cui le mie coppie di base avranno le migliori condizioni di annealing o di collegamento, quindi si userà 64 gradi per la condizione di annealing a accad.Sì, "inizia la conversazione studentesca".Va bene, penso che la sua domanda sia giusta che tu sappia farci dire, tu hai ricavato un valore teorico di 64 gradi, come esattamente ci aiuterà ad amplificare quel gene di interesse, questo è molto credo che tu sappia, domanda pratica teoricamente, dovresti vedere un divieto amplificato a causa del Tm ma di solito, sai più minus 2degrees può succedere, quindi qualche volta che stai derivando 64 gradi che può accadere 66degree può essere la temperatura giusta per quel gene da amplificare, è possibile. Quindi, devi giocare con determinate condizioni di temperatura per scoprire qual è la migliore temperatureper il tuo gene di interesse da legare. "La conversazione docente - studente finisce". Quindi, ora lei era partito dal DNA doppio helix, il DNA a doppio strato, dopo aver fatto la denaturazione, hai ottenuto il singolo strampalato una volta, hai aggiunto questo primer che ti sei progettato. Perché volevi studiare il loro gene di lamina A per esempio e ora stai amplificando il loro gene di interesse ora, hai aggiunto dNTP e nucleotidi e fornendo condizioni di temperatura verticale, in modo che i nucleotidi si stiano sintetizzando e si fanno newstrands, così ora questo è diventato DNA a doppio filato, questo tutto è un ciclo onlicamente di PCR.Ora, stesso modo in cui si ripete il ciclo PCR secondo tempo, terza volta e ora si può doversi n numero di times.Idealmente, le persone vanno per almeno 30 a 35 o 40 cicli per fare più copie del genere di interesse, quindi immaginate che dopo ogni ciclo di esecuzione della reazione a catena della polimerasi, si stia generando n numero di frammenti e quindi, per molte delle applicazioni forensi, pensate a qualsiasi tipo di caso si sa, la scena del crimine, quando c'è qualche eroina è fallita qualche sorta di macchia di sangue viene rilevata laggiù, non si ha troppo DNA a dolot di investigazion.Così, usano solo la piccola parte di quelli che conosci, il DNA estratto da quei bioesemplari e poi amplificano quelli che utilizzano queste condizioni con la chemio polimerasi, per poi fare ulteriori test che possono derivare da deduzioni molto accurate. Così, stiamo eseguendo qui più cicli in qualsiasi ciclo di reazione.A 3 passi ciclo che produce la reazione a catena che produce le catene del DNA in modo esponenziale e dopo ogni ciclo successivo avrete la sequenza target che dubiterà dei numeri e questi i numeri saranno raddoppiati; 2 alla potenza n, quindi se hai fatto 30 cycleo 40 ciclo, idealmente, sembra solo 10 ° differenza di ciclo ma se si pensa a 2 secondi alla potenza 30 o 2 alla potenza 40, c'è un enorme numero di differenza in quante copiesche si produce per quel gene di interesse .Quindi, una volta che si fa il PCR, ci sono molte cose da ottimizzare, ovviamente come qualcuno di cui si parla, bisogna guardare la temperatura di annealing, quello che è la migliore temperaturein che i tuoi primer ti legano e potresti dover giocare all'interno di una gamma di temperamenti da 60 a 65 o 70 per scoprire dove il tuo gene si lega al meglio con il primer e thenyou devono vedere che a quali numeri del ciclo si può ancora vedere abbastanza bene il DNA beingproduced.Quindi, allora cosa puoi fare; dopo aver fatto la reazione a catena della polimerasi, puoi eseguire i tuoi campioni sul gel, tantissime volte la gente fa questo gradiente PCR, dove useranno le ogni condizione PCR, diciamo startinghere; 60, 62, 64 e 66 e queste sono le mie corsie e quello che sto trovando tu sai, la band molto multe è apparsa al 62 probabilmente, conosci una buona band che vedo a 64.So, poi probabilmente questo 64 è la temperatura giusta per me per prendere i miei esperimenti avanti, semmai come le persone hanno cercato per la prima volta di visualizzare dove ci si accorge che i primer si uniscono al meglio si legano al, gene di interesse e ora, una volta che hai fatto allora, willdo 30 o 35 o 40 cicli per amplificare e fare abbastanza numero di copie del gene di interesse .Ok, quindi nel giro di poche ore di fare questa reazione a catena di PCR o polimerasi, in modo da poter fare più copie di quel target specifico e poi puoi fare molti test genici in base al DNA amplificante, che è presentiamo il dato sample.Now, solo immaginare che tu sappia, finora siamo stati parlare di tutte le cose che accadono al livello del gene, ora pensiamo a voi volendo studiare in aberrazione o il passaggio a livello proteico soprattutto, se si pensa al contesto della progeria, se si pensa al contesto della progeria, c'è stata una proteina difettosa A causa difettosa del gene lamin A, quindi se si pensa al gene della lamina A, quindi se si pensa alla sequenza del DNA, tutti questi codonti di triplette vanno a fare un aminoacid.Quindi, diciamo che abbiamo glicine da triplo G, fenicina alanina da TTC e come quella svela più aminoacidi derivati da questa sequenza di codoni triplet, quindi nucleotide the3 lettera, sono corrispondenti ad una determinata sequenza aminoacidica e queste nucleotidesequenze potrebbero essere tradotte per darvi sequenza aminoacidica o osservando la polipeptidecatena di quella data protein.Quindi, se volete studiare permetteteci di dire di sapere, cambiare accade a livello proteico fromlo stesso tipo di esperimento di clonazione e la stessa idea di quello che abbiamo discutere per fare la clonazione, ora potete studiare quei cambiamenti a livello proteico che qualcosa io penso che ora dovete pagare con attenzione. Quindi, immaginate di avere una particolare proteina che volete studiare e becausein quella proteina, lì è qualche cambiamento che avviene ad un livello di aminoacido e che ogni aminoacido deriva dal codone di tripletta della sequenza genica, quindi se si sta guardando atquel sequenza genica per esempio, TCT è la sequenza genica per la serina e si sta justreponendo un C con la G quindi, il TCT diventa TGT, che diventa un altro aminoacido, che è 16.Just cambiando una coppia di base, è cambiato da un aminoacido ad altro aminoacido, che introdurrà così tanto cambiamento nel sistema vivente, rado, quindi ora se si pensa anche quando si progetta il primer, anche quando si sta studiando il cose a livello di gene, se vuoi introdurre i cambiamenti a livello di proteine, successivamente puoi pensare a cosa ti cambia in tripletcodons, che può comportare i cambiamenti a livello proteico, right.Quindi, se hai questo particolare modello è strand, se questo è il filone, che è normalaland ora, vuoi creare una proteina che sta avendo una leggera differenza solo con un posto particolare, ora questo un nucleotide hai fatto un cambiamento e ora, una proteinche da esso derivata o da aminoacidi che ne deriverà, avrà una disabbinamento, avrà diverse modalità rispetto al filone parentale, right.Così, ecco come se tu, stai progettando i primer sul sito di primer designingutti, puoi fare qualche piccolo cambiamento e quelli possono sfoderare le variazioni che possono essere viste dopo aver fatto la clonazione, allora si possono vedere quei cambiamenti che avvengono anche a livello proteico, qui ancora le persone hanno usato batterica il sistema e solo immaginarlo è un concetto molto complesso perché pensare a noi areare sapori, eucarioti e sistema umano molto complesso. E ora, per le nostre proteine umane per crescere, stiamo ancora usando un sistema batterico, che sistema isprocariotico giusto, quindi ma, ma in qualche modo con l'ingegneria genetica, abbiamo saputo superare queste barriere e siamo ancora in grado di crescere, le proteine di nostro interesse nei batteri, quindi proteine di interesse eucariotico origin.Così, le cellule esprimano le diverse versioni delle proteine e si traducono nei fenotipi che possono effettivamente informare circa la normale funzione delle givenproteine. E possiamo usare quelle informazioni per esprimere proteine eucariotiche nel sistema batterico sebbene, è molto impegnativo ed è ancora una domanda che come diverse eucariotiche e batterie batteriche sono e come si può usare il sistema batterico per rendere addirittura la proteina umana o la proteina teeucariotica che è davvero una domanda impegnativa, quindi se volete usare il sistema batterico per esprimere una determinata proteina di interesse, dovete usare certi promotori che stanno andando a superare questo problema nell'espressione vector.Quindi, il vettore di espressione è un vettore di clonazione che contiene alcune promoterze batteriche in grado di fornire i geni eucariotici nella corretta cornice di lettura, quindi ci sono lotterie di differenza nel sistema procariotico ed eucariotico e naturalmente, lei non asseconda che le tue proteine eucariotiche si accingano a fare in batteri molto correttamente e godano correttamente piegate ma in qualche modo, stai ancora cercando di usare determinati vettori di espressione, alcuni dei vettori di clonazione dove hai alcuni promotori inseriti upstreamof il sito di restrizione che ti aiutano ad almeno mettere le cose nella cornice giusta. Così che gli aminoacidi giusti possano essere sintetizzati in base alla; quella espressione particolare, così la cellula ospite batterica riconoscerebbe un promotore ed esprimere un gene straniero o gli eucarioticgeni che sono legati a quella promoter.Così, ora lasciateci prendere questo situazione particolare che è davvero, davvero complessa situazionma vogliamo studiare una proteina mutante complessa, pensiamo a questa parte che è la cloninità che abbiamo già abbastanza familiare con ora, proprio così, tutte le cose che Iho ha parlato finora sono ora riassunte in questa immagine particolare, facciamo attenzione a questa immagine e vediamo quali sono tutte cose di cui possiamo discutere da qui. Abbiamo discusso, abbiamo avuto un vettore plasmifero dove hai voluto inserire un gene di tuo interesse, hai fatto questo DNA ricombinante e ora hai fatto la trasformazione, hai fatto la trasformazione e ora hai ottenuto il batterista colonia che stanno avendo il vostro gene di interesse, questo è quello che abbiamo discusso di earlier.Now, questo DNA che è un frammento, ora questo particolare DNA potete anche amplificare la reazione a catena di usingpolimerasi, se avete una copia molto ridotta di quel DNA che potete farne multiplecopie usando PCR.Per fare PCR o reazione a catena di polimerasi, avete usato certi primer che sono ghiacciati da entrambi i lati, avete anneo certi primer e quei primer sono quelli che amplificano il gene di interesse, ora nella sequenza primer stessa, se si può introdurre qualche variazione, che può cambiare il vostro codone di tripletta, quindi che la tua proteina che verrà sintetizzata da esso avrà dei cambiamenti. Si sa già da quale codone, quale aminoacido sta per essere sintetizzato, quindi se si fa anche solo un cambiamento nella coppia base della sequenza primer, anche questo si resulterà in mutazione o cambiamento diverso, peoplecan do tante innovazioni, molte idee arrivano che si desidera studiare un gene diverso ordiverso, ora è possibile effettuare quelle modifiche alla progettazione primaria level.Now, si fa PCR, quindi il tuo gene di interesse ora conterrà determinate coppie di base aggiunte più o meno coppie di basi, giusto che tu possa fare usando la reazione a catena di polimerasi e oncete ha fatto che poi, il resto del passo della clonazione rimane lo stesso, ora puoi avere il passo nello stesso formato, il modo in cui abbiamo discusso .Ora, tutto quello che stiamo parlando per il DNA funziona tutto quello che devi relazionarti del tuo semplice apparato elettroforetico. Devi amplificare il tuo gene, devi correre sul gel e devi vedere che erano, quali sono le dimensioni di questa particolare banda; sono in grado di amplificare per gene giusto, ora letus dire, se hai fatto un cambiamento nel gene a causa della sequenza primer che si è arrivati, ora c'è qualche amplificazione che potete vedere o qualche eliminazione potete vedere, un cambio di coppia di piccole basi, quelli che potete contro monitor sull'agarosio gels.So, questi sono il tipo di tecnica che siete molto interessanti per noi per studiare, avete una PCR; reazione a catena di polimerasi, ok, così a breve vi mostreremo un termociclatore, lo strumento che è molto semplice conosci, in generalinnovazione, è come 3 semplici stati termici e in quegli stati termosifoni, stai solo molto cambiando la temperatura, quindi mentre PCR sembra che tu conosca una grande tecnica. Ma sai una grande tecnica. a breve vi mostreremo lo strumento, la reazione a catena della polimerasi, è molto semplice termociclatore di strumenti, dove stiamo semplicemente regolando inizialmente la nostra temperatura inizialmente, si sta riscaldando ad altissime temperature, 100 gradi, poi si sta abbassando la temperatura in base alla temperatura di annealing potrebbe essere 55or 60 gradi e poi, si sta di nuovo facendo estensione a 72 sgrass.Quindi, usando questi cambiamenti di temperatura, si è in grado di sintetizzare il DNA usando PCR, quindi di nuovo uno strumento molto semplice ma con solo opere su una precisione molto precisione e che deve essere monitor.