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Benvenuti nella lezione di oggi, parleremo di strumenti del DNA e clonazioni geniche, quindi nella lezione precedente avrete appreso dei concetti teorici della clonazione del DNA, oggi avrete familiarita ' con i vari passaggi, che sono coinvolti nell'esecuzione di DNAclonazione in setup di laboratorio, vedrete anche che come un gene di interesse è insertedin un vettore allora viene selezionato in base alla presenza di un antibiotico gene.Quindi, iniziamo la sessione dimostrativa di laboratorio ora, salve a tutti oggi stiamo per discutere del flusso di lavoro della clonazione molecolare. Clonazione molecolare ha alcuni passaggi fondamentali che siamo andare avanti uno per uno, così firsticamente quello che stiamo provando a fare è; introdurre un gene straniero in un organismo che normalmente facciamo referenza come inserto, quindi questo è il mio inserto sample.Così, prendiamo il nostro inserto DNA, introduciamo in una molecola trasportabile normalisa come vettore, quindi la maggior parte dei vettori di uso comune include plasmidi, la sot in questo caso stiamo usando un DNA plasmide in cui introduciamo un gene straniero; il nostro inserto, la soce sono come sappiamo plasmidi, si verificano naturalmente nei batteri e negli anni si è fatto, e si è visto che questi plasmidi hanno anche qualche antibioticresistenza gene.So, che conferisce una resistenza contro particolare antibiotico ai batteri, quindi se un batterista coltivato in quella condizione antibiotica, lo farà; la sua crescita non sarà affettuosa e crescerà perfettamente normal.Così, qui abbiamo un DNA vettoriale, abbiamo il nostro inserto, quindi per introdurre il mio inserto nel vettore, abbiamo quindi preso un DNA vettoriale, abbiamo preso un inserto DNA.Quello che faremo è; li tratteremo con enzimi di restrizione, gli enzimi di restrizione andranno a tagliare questi DNA e creeranno dei fini compatibili, così che la inserendo il vettore possono unire e formare una struttura perfettamente circolare - Così, effettuiamo la digestione della restrizione separatamente per inserire un vettore, quindi ciò che dobbiamo fare è; prima prendiamo un vettore, poi aggiungiamo l'enzima di restrizione che serve all'enzima per effettuare la digestione. Aggiungiamo anche l'acqua per realizzare il volume e nell'ultimo passo, aggiungiamo l'enzima, quindi si aggiunge l'enzima in quantità molto ridotta, quindi userò una pipetta diversa per questo, in questo caso utilizziamo l'enzima EcoR1, quindi durante tutto il processo dobbiamo essere sicuri che venga effettuato utilizzando condizioni asettiche, quindi la punta dovrebbe essere autoclavata, anche i tubi dovrebbero essere sterili, allo stesso tempo dovremmo effettuare l'intera reattazione ice.Quindi, proprio ora ho fatto il cocktail di digestione per il vettore, sto goingto fare la stessa cosa per l'inserto e poi manterremo i tubi a 37 grado whichis la temperatura ottimale per gli enzimi ad act.So, ora sto portando una digestione di restrizione per l'inserto, quindi questo è l'inserto, aggiungo il buffer di restrizione, quindi sto aggiungendo diversi volumi per eachof i componenti. E di conseguenza, sto aggiustando anche la pipetta, ora sto aggiungendo acqua, quindi il lastione è l'enzima, quindi sto andando a vorticare i tubi, in modo che i componenti siano mixedcorrettamente, allora darò loro un breve spin, quindi che qualunque cosa sia rimasta bloccata ai wallswill verrà a incubare i tubi a 37 ° grado per 1 ora. Ora l'incubazione sarà fatta per 1 ora, quindi dopo la restrizione, la digestione è stata eseguita. Il passo successivo è la legatura del DNA da 2, così abbiamo il nostro DNA vettoriale così come l'insertDNA che è stato ripulito dall'enzima di restrizione, quindi ora ci uniremo i 2 compatibleend usando il ligasi enzimini.Così, qui hanno tutti i componenti della reazione, prima prenderemo rDNA, vectorDNA, poi aggiungeremo l'inserto, quindi una volta che avremo aggiunto vettore come inserito, wewill aggiungerà il buffer di legatura, quindi prima di aggiungere qualsiasi cosa, quindi basta mescolarlo un po' bit.Così, questo è il buffer di legatura, io lo aggiungo un piccolo vortice, aggiungo questo alla teligazione, l'ultima cosa da aggiungere è l'enzima ligasi di nuovo, stiamo usando la pippa di asmall perché richiediamo pochissima quantità di enzima, darò di nuovo un shortvortex all'enzima, ora il nostro mix di legatura è pronto, vorremo vortici un vortice piccolo, seguito da un corto di spin.Ora, lo incuberemo a temperatura ambiente per 3 ore. Dopo la legatura è fatto, il passo successivo è la trasformazione, quindi dopo la legazione il vettore e l'insertessi formano una struttura covalentemente chiusa e questa molecola di DNA, la molecola combinata di DNA introduciamo in una cellula ospite, quindi in questo caso hai assunto DH5 alfa host, che non ha alcun enzima di restrizione, quindi introdurremo il DNA in questa cellula ospite, in modo da poter propagandare further.Quindi, questa trasformazione step viene effettuata all'interno del cofano laminare sotto una sterile condizioni, quindi all'interno del cofano, abbiamo filtri sterili, che possono mantenere l'aria all'interno della pulizia. Prima di partire dall'esperimento, prima di iniziare con l'UV per 10 minutes minuti, questa stepenne che all'interno delle condizioni sono estremamente sterile, questo passo assicura che all'interno delle condizioni di cofano thelaminar ci spegneremo l'UV e ci accenderemo il ventilatore e la luce button.Now, effettueremo l'esperimento di trasmissione, così avremo il nostro campione ligato, terremo l'acqua di controllo negativa, quindi in tutti gli esperimenti, normalmente manteniamo un negativo controllo, quindi abbiamo delle cellule competenti che sono le cellule ospiti in cui introdurremo molecola ricombinante, in uno dei tubi, aggiungeremo la nostra molecola ricombinante, aggiungiamo un controllo negativo, acqua. Questo è il nostro mix di legatura che aggiungeremo nelle cellule di competenza, quindi ora vivremo i tubi su ghiaccio per 30 minutes.Ora, daremo il trattamento shock termico, quindi terremo i tubi a 42 sgrasseCelsius per 2 minutes minuti. Questo trattamento shock termico aiuta la cellula ospite a ottenere il DNA estraneo; questo shock termico cura il DNA estraneo da introdurre all'interno dell'ospite cell.Così, ora eseguiremo la placcatura, così come possiamo vedere, abbiamo già targhe; LB agartarga. Queste lastre, hanno un sacco di componenti, che aiuteranno i batteri a crescere ulteriormente, abbiamo aggiunto l'antibiotico ampicillina perché un vettore, il DNA plasmato ha ampicillina resistantgene, in modo che quando avremo placcato il nostro prodotto ligato su questo, solo quelle colonie saranno presenti il nostro vector.Quindi, per 1 piastra, io userò il campione ligato che è stato trasformato in theDH5 alfa host cell. Per l'altro piatto userò il controllo negativo che ha ricevuto gli stessi trattati prodotto ligato, quindi prenderò il campione, quindi aggiungo il campione in gocce, quindi questo è il spreader che userò per placcare, quindi questo spreader è alificato in etanolo, in modo che tutti i microorganismi vengano uccisi, così che l'alcol evapora, aspetto che l'alcol possa evaporare. Perché se è troppo caldo, può anche uccidere anche il mio campione di DNA, posso toccarlo qui, così che diventi figo ora, comincerò a pattinare, quindi farò la placcatura in circolo, in modo che il campione sia spresso uniformemente, lo farò fino a un punto in cui mi sento che l'intero campione si diffonda uniformemente e quando l'agar sembra sembrare un po' asciutto e c'è qualche frizione a quel punto che mi fermerò. Uno deve fare in modo che non si faccia pressare troppo male potremmo finire anche a rompere l'agarpiatto e lo terremo indietro, etichetterò il mio plate.Next, metterò in etichetta il campione di controllo negativo che non è altro che acqua, quindi normalmente svela le piastre in questo modo sottosopra altrimenti, se le teniamo così, sometimesche a causa delle pieghe, potremmo finire per avere qualche tipo di contaminazione, quindi di solito si tiene sottosopra. Proprio ora, ho fatto pianeggiando, quindi per qualche tempo la terrò così, dritta, più tardi la terrò sottosopra come well.Now, prenderò di nuovo il campione di controllo negativo, aggiungerò in maniera uniforme, mostrerò la mia fiamma di spreader, farò vedere la mia fiamma uniformemente, per la mia temperatura di spreader, per la temperatura del spreader venire giù, questo è il modo in cui i miei platelo.Now, ho iniziato a sentire qualche frizione sul piatto, così se mi fermo, quindi, a questo punto, mi fermerò, ora prenderò le mie piastre e mi lancero in incubatore .Così, queste sono le piastre che terrò nelle incubatore per incubazione per la notte, così come potete vedere la temperatura varia da 37 a 38 che è ideale per i batteri togrow.Ti posso mostrarvi un altro piatto, che abbiamo già fatto trasformazione ieri andhow un piatto di trasformazione che ha un sacco di colonie all'interno, quindi questo in questo caso di efficienza di trasformazione è stato molto buono. In alcuni casi, non otteniamo altrettante colonnine, quindi in questo momento abbiamo mantenuto 2 piastre; in uno, speriamo di avere una buona efficienza di trasformazione e nel secondo piatto, ci assumiamo di essere ciechi perché a fondo è solo acqua da garantire che i nostri esperimenti sono assolutelfini e non c'è contaminazione.Quindi, una volta ottenute le colonie dobbiamo essere sicuri se queste colonie riflettano una molecola ricombinante perché come si sa una volta che abbiamo fatto la digestione della restrizione, wecan ottiene diversi tipi di prodotti. Può accadere che durante la legatura, il vettore stesso si legga e abbia una molecola autolegata che possa accadere che ci sia solo l'inserto che si è trasformato nella cellula ospite, è necessario essere sicuri che queste colonie abbiano effettivamente una molecola ricombinante, quindi una cosa che siamo sicuri che qui non c'è inserto qui perché il vettore ha resistanza antibiotica e qui, nei media abbiamo un antibiotico ampicillin.Così, solo quelle colonie che hanno il vettore cresceranno su queste, ora quelle colonie canteranno il vettore autolegato o possono essere la molecola ricombinante che avrà l'inserto, per questo prenderemo queste colonie, noi le faremo crescere il plasmide e ne controlleremo le dimensioni, così questo è il LBmedia, questo è lo stesso supporto che è stato, già noto nel solidifiedform in questo agar plate.So, questo media LB ha tutti i componenti, che è richiesto da i batteri per crescere, quindi raccoglieremo una colonia, aggiungeremo anche il nostro antibiotico, l'antibiotico per il quale il gene resistente è già presente sul vettore, quindi che solo il nostro vettore cresce, non c'è altra contaminazione da seen.Quindi, questo è il nostro antibiotico ampicillina, tutto quello che si indossa vicino alla fiamma, per cui non c'è alcuna contaminazione, non c'è alcuna possibilità di contaminazione ora, io raccoglierò una colonia, questa sarà di nuovo incubata a 37 per overnightalmost 16 hours.Così, questo è l'incubatore tremendo in cui terrò questo tubo per la notte incubation.Quindi, potete vedere la temperatura impostata è 37 che sono ideale per il growth.So, ecco come appare una coltura batterica, potete vederla è molto turbida e dopo la tisis un segno che i batteri sono cresciuti correttamente nella notte, ecco il tubo che abbiamo appena conservato per l'incubazione di notte, è, caso non così turbida, è trasparente ma dopo la crescita è così che sembra probabile .Quindi, in conclusione, spero ora che i vostri concetti per la clonazione genica siano molto migliori e muchesi ora. Come ho appena visto la sessione di dimostrazione del laboratorio con l'avvento di avanzamento tecnologico, l'ingegneria genetica può essere eseguita in un laboratorio allestito con grande facilità ora, whyit potrebbe conoscere un semplice aspetto ma la clonazione un gene spesso comporta la conoscenza del processo di pensiero e l'intera ottimizzazione dei parametri potrebbe richiedere diversi mesi di tempo per ottenere davvero il clone corretto. E poi bisogna assicurarsi che la sequenza sia corretta e non si autoligatedvector, ciò che si ottiene è il gene giusto di interesse da cui si è iniziato con, quindi ovviamente, il processo è semplice e molto più semplice ma per ottenere davvero un risvolto in cornice ha bisogno di conosci ottimi protocolli operativi di ascoltatori e qualche volta hai consapevolmente esperienza di conoscere i concetti coinvolti in ingegneria genetica. Spero che ti sia piaciuta la sessione di laboratorio e continueremo le nostre interazioni e discuteremo della clonazione genica anche nella prossima lezione, grazie.