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Benvenuti al corso MOOC NPTEL sulla bioingegneria un'interfaccia con biologia e medicine.Oggi, impareremo i fondali della clonazione del DNA, prima impareremo aboutplasmidi che sono il DNA extracromosomico presente in varietà di batteri, questi sono usati astooli per la clonazione del DNA e l'ingegneria genetica, quindi iniziamo la lezione di oggi. Se ricordate da uno dei precedenti contest di discussione, vi avevo parlato di cloningbrevemente del DNA cloning.Sebbene, parliamo di clonaggio in molti modi, pensando anche alla clonazione di piante o anche ad un organizzatore ma solo lei sa ricordarsi del DNA clonare parte e lasciarci un po' di aggiornamento su questo e parlare di più per iniziare con il plasmid.Quindi, cosa è plasmidi?Plasmid è una delle parti extra cromosomiche del batterista, diverse organelle che maya presenti, quindi oltre al cromosoma batterico possiede anche questi extra cromosomici che sono noti come plasmids.Ora, questi plasmidi diversamente dal cromosoma batterico che ha tutti i geni utili e che sono naturalmente essenziali per i batteri per la sua stessa propagazione. Il plasmide ha solo pochissimi geni e sono utili ma si sa che sono extra cromosomici, quindi non sono così essenziali come bene e molte persone che studiano in ambito genetico ingegneria, hanno fatto da vicino queste osservazioni e poi felcano che studiano plasmidi potrebbero essere molto utili come strumento per noi per trasferire i geni fromone all'altro organizzm.Così, questi plasmidi sono doppie standard, covalentemente chiusi, si comportano come unità aggiuntive o unità accessorie di batteri che possono replicare e ereditare indipendentemente dal cromosoma batterico part.Così, come ho accennato, hanno pochissimi geni e quindi, anche se si sta rimuovendo l'itout di batteri o se si sta aggiungendo un nuovo plasma in i batteri, non cambia troppo, il complesso le dinamiche geniche per la batteria.Dunque, questi geni possono essere utili soprattutto per un ambiente particolare per i batteri, come potrebbero non essere necessari per la sopravvivenza batterica o per la sua riproduzione purpose.Quindi, le persone hanno usato nell'ingegneria genetica, questi plasmidi sono stati ingegnerizzati, quindi le persone hanno scattato questi plasmidi dai batteri e li hanno ulteriormente ingegnerizzati nel campo della genetica per il nostro stesso vantaggio, basta immaginare che si voglia assumere alcuni geni del gene o del gene del pesce o un gene vegetale e ora si vuole fare più copie di esso, si sta facendo che nei batteri si sta usando i batteri come sistema dove si possono moltiplicare genes.Così, in questo caso ci facciamo immaginare, questo è uno dei vettoriali, vettore è uno di questi plasmidsche può essere usato per trasferire un gene straniero da uno ad altro luogo, ok così questo è l'esempio di pBR 325 vettore, in cui abbiamo mostrato più caratteristiche che ha beato, oltre alle proprietà originali del plasmide, alcune nuove funzionalità sono state aggiunte in questo usando l'ingegnering.Quindi, un vettore di clonazione è una molecola di DNA in grado di spostare il DNA in una cellula ospite e canreplicare c'è, questo è uno dell'esempio, pBR 325 o 322, che sono diversi tipi di vettori presenti nell'E. coli, contiene un'origine di replicazione che qui viene mostrata nel colore blu, contiene anche molti del marcatore resistente agli antibiotici e si presta attenzione a questa parte, i batteri quando si sa che ci sono, presenti ovunque, di conseguenza, se si vuole far crescere qualche batterio, in realtà si avrà automaticamente molta contaminazione da altri battera.Quindi, come selezionare che si desidera un determinato tipo di batteri che possono avere solo il tuo genere di interesse, quindi se hai questo particolare vettore dove hai inserito alcuni geni di resistenza agli antibiotici, quindi che possono essere utilizzati per voi per selezionare come marcatore di selezione, solo quei batteri che possono contenere il vostro gene di interesse solo possono crescere, quindi in questa mappa vettoriale sono stati aggiunti anche ampicillina, cloramfenicolor tetraciclina etc. .. ci sono molti nomi enzimatici che potete vedere, EcoR1 e co1 etc. questi enzimi sono noti come enzimi di restrizione e questi siti sono lì, dove questi enzimi essenziali vanno al lavoro, quindi alcuni enzimi di restrizione che conoscete, hanno nome molto complicato, nome difficile, non preoccupate troppo su quello che il nome è e esattamente come loro, dove lavorano, quindi non vi chiederò esattamente dove erano gli Hind. Quello che è importante per voi ricordare che questi enzimi di restrizione, funzionano molto, funzionano solo su una specifica sequenza di DNA e quando vedono per in questa casezza 5 primi a 3 prime; AAGCTT, quindi ora tra 2A ' s, si va a ripartire solo tra questi 2 A, così come da parte opposta, quindi questo particolarissimo sito è noto come sito di restrizione perché si è in grado di mettere molto preciso lo yousa questo particolare frammento di DNA in quel particolare site.Dunque, questi enzimi di restrizione sono molto precisi, molto specifici, quindi ora se guardiamo a diverse proprietà di enzimi di restrizione, sono molto brevi le sequenze di DNA, da 4 a 8 longs di nucleotidi e possono tagliare entrambi gli stand del DNA a puntini molto precisi nei siti di restrizione. Ecco come si può vedere, se si hanno plasmidi batterici, ora questo plasmide, se si elabora questo è come la sequenza del DNA sembra e all'interno della sequenza del DNA, si ha BCATTC, ora questo enzima di restrizione sta andando ad allenarsi solo nei siti, quindi ora questo DNA circolare; il il plasmide circolare è aperto a becausedell' enzima di restrizione tagliato e ora, si sta usando lo stesso enzima di restrizione per alsotagliare aprire il tuo gene di interesse. Così che ora, si può creare questi particolari tipi di tagli e stanno per creare lo stesso tipo di tagli e stanno andando a creare gli stessi enzimi del DNA, poi possono andare a inserire gli stessi enzimi, all'interno di questa spina dorsale del plasmide, così il tuo gene di interesse può essere inserito e inserisci il tuo gene di interesse, quello del verde è la tua spina dorsale di plasmid.it, ora dopo aver fatto la reazione di legatura, si può avere una molecola di DNA ricombinante che può essere formata, una molecola di DNA ricombinante è un plasmista che trasporta il gene del tuo interesse, giusto o ha avuto qualche domanda. "La conversazione docente - studente inizia" Così, dipende dall'origine della replicazione in cui l'origine della replicazione può accadere, sicuramente sì, va bene ". Così, diciamo che abbiamo discusso di uno dell'interessante esempio di progeria, giusto e ormai sappiamo che c'è un gene che è il gene di lamina A, che sta avendo carenza di questo individuo e quindi, lo sai che non sta mostrando il fenotipo normale, tosuperare questo lasciaci dire che vuoi studiare sul gene che vuoi sapere che cos' è il, il tuo sapere, il malfunzionamento che accade a livello di gene o al livello protesico in lamina A. Quindi, vuoi clonare anche il formato proteico, giusto, quindi pensiamo al nostro esperimento di clonazione brevemente, penso di aver parlato in passato, di aggiornarci ora e di parlare in più dettagli now.Quindi, hai appena imparato che hai questo plasmide hai un gene di interesse in questo caso, diciamo che abbiamo lamina A, quindi ora si areare alcuni enzimi di restrizione, lavoreranno a determinati siti di restrizione e molto precisamente, faranno tagliare laggiù, quindi ora il vostro plasmide sta diventando openand ora, potete avere il gene lamin A qui inserito, se potete aggiungere il DNA ligasi enzimini.Così, questa particolare molecola che è formata da DNA ricombinante che contiene il gene del vostro interesse, si tratta di una molecola ricombinante del vostro interesse, questa è una molecola di ricombinantina, è il primo passo per avere la formazione del rDNA, ora questo è comodante dai batteri, quindi volete farne più copie e il vostro originale l'intenzione era; possiamo moltiplicare questo interno ai batteri?Quindi, ora si vuole spostarla all'interno dei batteri, quindi membrana batterica; si cerca di rendere l'itinere permeabile solo facendo una sorta di trattamento chimico con il cloruro di calcio orusando qualche elctrophirazione, qualche piccolo shock elettrico, in modo che la membrana batterica diventi permeabile e ora questo particolare plasmide possa muoversi all'interno di questa membranea, all'interno dei batteri e ora, questo contiene il gene di interesse che è stato lamina A. E ha ovviamente il suo DNA circolare, così ora questo particolare batteri se si tratta di un vostro gene di interesse o del plasmide che avete fatto del DNA ricombinante, che sia hasinserito o non non hai idea e vuoi solo selezionare che per i tuoi ulteriori esperimenti, quindi ora stai usando quella proprietà dove abbiamo detto che puoi avere alcuni dei geni antibioticresistenti, quindi diciamo che abbiamo qui il gene resistente all'ampicillina; nel tuo plasmid.Dunque, questo marker resistente all'ampicillina c'è, se fai un platee su quella piastra, aggiungi l'antibiotico medio agar e aggiungi l'antibiotico dell'ampicillina, hai aggiunto ampicillina, quindi solo quei batteri che stanno avendo questo particolarplasmista sopravviveranno qui e vedrai solo quelli che sono avendo il vostro geneof interesse sopravviverete su questo piatto e faranno la colonia, questo è il loro percorso di selezione. Questo è stato il primo processo che sta facendo una molecola di DNA ricombinante, questo è un secondo processo che è il; questo è il secondo processo in realtà, qui è la trasformazione e il terzo processo è noto come selezione, si sta facendo la selezione qui di seguito. Ora una volta selezionato che è il clone giusto, questo è il batteri giusto che contiene gene del tuo interesse, ora puoi fare più cose da esso. Perché i batteri possono moltiplicarsi molto rapidamente, quindi ora puoi prendere questo colonica batterica e si possono coltivarle nel tubo e si va a continuare a moltiplicarsi e da thisone o si può sfruttare le proprietà di avere più copie di DNA oppure si parlerà di come meglio ottenere l'ottenimento dello stesso sistema per rendere anche la proteina, quindi bothof questi può essere usato proprio facendo questo esperimento di base. Questo sarà molto cruciale per molti concetti che vi chiederò successivamente, dove vi verrà chiesto di sapere dato qualche situazione di malattia o qualche ipoteticalsituazione in cui potrete superare quel problema e dovete solo sapere come funziona il processo, in quale modo puoi realizzare la molecola del DNA ricombinante e puoi avere una selezione precisa solo per i cloni che stanno avendo dei geni del tuo interesse .Quindi, questi sono i; questo passo, ti ho già mostrato prima nel precedente concetto, come le biotecnologie hanno fatto una differenza enorme quella volta, non ti ho spiegato più nel dettaglio ma oggi penso che sia il luogo in cui possiamo parlarne molto più nel dettaglio, così abbiamo fatto la molecola ricombinante del DNA, noi l'abbiamo trasformata e stiamo facendo le copie multiple dei batteri, che contiene il geneof nostro interessante .Ora, questo particolare gene di interesse potrebbe essere per più applicazione se si pensino di avere le piante contenenti le proprietà o vegetali resistenti al pesto che contengono alcuni contenuti aumentati di vitamina o molti tipi di proteine terapeutiche potrebbero alsobe purificare e produrre in eccesso sulla base di questi speriments.Così, questo, questo ha conosciuto molta applicazione. E solo a un'altra visione della comprensione dell'esperimento di clonazione, dove si può pensare al gene del tuo interesse e del vettore, lo stai legando qui facendo plasmare il plasmidi ricombinantina e da qui quelli che contengono il tuo gene di interesse è onlicamente selezionato sul mezzo di selezione ma quelli che non hanno più ordo plasmidi non contengono il, il plasmide del tuo interesse non sta ottenendo selected.Così, quindi solo selettivamente stai selezionando quei plasmidi che stanno avendo il tuo genere di interesse perché hai ingegnerizzato il plasmide in modo tale da avere alcune proprietà resistenti agli antibiotici, quindi quelle proprietà che stai usando per la selezione, d'accordo, così in generale, sai che questi sono tutti fatti dai biotecnologi, bythe ingegneria genetica comunque possiamo capire qualche queste cose in parole muchsemplificate. E soprattutto, nelle tue parole, nelle tue parole pensando più ai numeri giusti, giusto, quindi non preoccuparti troppo del nome, se nome di un tu conosci vettore o nome di un enzima, questi 2 solo per il momento puoi ignorarlo. Immagini di avere un vettore o un plasmide che è 20 kilo base per lungo e ora tu sei using2; enzima di restrizione; un enzima è Nco1, secondo enzima è Hind 3, ora stai generando certi frammenti, quindi è consigliabile prendere i tuoi quaderni e iniziare a fare pochi esempi qui di seguito, abbiamo pANT 7 potrebbe essere GST o qualche altro altro vettore qui, ora quello che dice che se si sta usando la digestione di Hind 3, si hanno 3 frammenti generati, i frammenti di dimensioni are12 Kb, 2 Kb e 6Kb, se si utilizza un solo enzima, si fanno 3 tagli, 6 Kbanda 12 Kb, ora se abbiamo usato un altro enzima che è Nco1, totale state vedendo 4size di questo plasmi.Così, ora un'altra dimensione che appare è 8 e 4, quindi, diciamo se il taglio di Nco è stato fatto qui, questo 12 potrebbe essere diviso in 8 e 4, giusto, così in questo caso, questa sarà la mappa witha differenti enzimi di restrizione, ora se volete testarlo è che quanti fragmentati siano stati generati possibilità teoriche, ora le persone fanno questo sperimentalmente usando atechnique noto come elettroforesi di DNA o elettroforesi di agarosio in cui questo è il DNA standards.Così, diciamo che conosciamo da 1 a 20 chilo base per marcatori ci sono e ora ci troviamo ad avere 8, 6, 4 e 2 minuti, quindi immaginate di aver eseguito un certo standard del DNA e quindi ora state provando a vedere questo frammenti plasmidi, quanti frammenti potete risolvere su quel gel di agarosio, osservandole che potete vederli sono 4 gel, le bande di gel sono apparse sul gel, una è 8, 6, 4 e 2 chilo di base di base. È possibile in certi casi che hai 2, 6 Kb frammenti e entrambi in tal caso vanno a separarsi sullo stesso posto perché nell'elettroforesi, si sta andando a separarsi in base alle dimensioni, quindi questo può creare qualche confusione ma in questa situazione è stato solo un frammento che hai avuto, quindi questo è molto più semplice, ecco che abbiamo 2 enzimi; Hind 3 andNco1 che ha creato diversi frammenti di 6, 2 e 12, dopo aver aggiunto Nco1, hai ottenuto 8and 4.Now, facciamo un altro esempio, dove abbiamo un altro vettore che è vettore pUC1 andora, stai usando enzima EcoR1, che si è tradotto in una banda di 26 chilo di coppia base, quindi se si ha l'enzima BamH1, ha fatto 4 frammenti; 13, 6, 4 e 3 kilo base pairs.Ora, quando entrambi gli enzimi sono stati utilizzati, si vedono ancora 4 bande; 7, 6, 4 e 3 Kb, quindi, i piaceri sviluppano una mappa plasmide e mostrano i siti di restrizione; i siti di restrizione sono i luoghi che vanno a funzionare, non hanno bisogno di sapere nulla su come questi enzimi funzionano, quali sono il nome di questi enzimi o il vettore, basta disegnare un cerchio usato saper per 1 enzima, quali sono i possibili frammenti?Ora, se si aggiunge un altro enzima in cui quei frammenti saranno montati, quindi sono sicuro che qualcosa che si può facilmente fare, bisogna semplicemente provare più possibilità che in cui questi frammenti possono darvi la giusta dimensione frammenti da entrambi gli enzimi, right.Ora, lasciatevi una situazione in più, quando abbiamo più enzimi usati, le plete ci provate. Avete usato l'enzima X e enzima Y e anche enzima X + Y per un vettore che è pET28, che ha dato diverse dimensioni di restrizione, diverse fasce che potete vedere di 2.3,0.25 e 1,8, in un altro caso avete 2,1, 1,55 e 0,7 e con entrambi gli enzimi utilizzati, si avere più frammenti da 1,2, 0,75, 0,7, 0,35, 0,35 e 0,25, quindi ora si havedo 2 cose; una è disegnare la mappa vettoriale, dove queste bande vanno posizionate gel per elettroforesi; gel elettroforetico, gel di agarosio e disegnare che sappiate, le band appariranno se avete usato solo enzima X e Y e quando avrete usato l'enzima X o solo enzima Y, dove le band saranno comparse sul gel, 2 cose si proveranno, ora questo è uno schema che cercherà la mappa vettoriale, potrete ora disegnare come sarà il vostro modello elettroforetico per il gel di agarosio. Questo era il gel giusto, quindi immaginate di poter usare qualche numero teorico qui come thestandard, poi usate una lane per eseguire frammenti basati su X e lane X, un'altra lane fora lane Y based frammenti e terza corsia per una lane X + Y, ok, quindi non possiamo avere così tanto tempo ora, per favore prendi questa domanda e facciamola indietro. Così una tecnica che è nota come elettroforesi in gel di agarosio è utile per separare DNAon i materassi in gel, dove il DNA è addebitato negativamente, così può muoversi verso il positiveelettrodo e questa proprietà è essendo utilizzato per separare il DNA in questo particolare tipo di elettrofororesis.Now, per visualizzare il DNA si può aggiungere un certo colorante, che si legano al DNA o al DNA possono anche essere visionati con l'ultraviolet.Così, si potrebbe usare anche quello per visualizzare il DNA e qualche volta se si è visualisingon il transilluminatore, si vedrà questo tipo di gel di DNA rosa, il modello di DNA sarà presente sul gel infatti, oggi avremo qualche dimostrazione alla fine, come l'elettroforesi dell'agarosegel e come è possibile visualizzare il DNA sul gel perché abbiamo discusso molte volte di gene e DNA, di come le persone quando effettivamente fanno sperimenta come vegano questi gel. avremo qualche piccola demo di quella odierna, quindi immaginate solo la domanda precedente, se state parlando di X, Y e X + Z, giusto, quindi in questo caso diciamo che vi abbiamo fatto sapere solo con un enzima questo è uno schema che sta emergendoci, questo è il modello di tipo che c'è e quando usiamo entrambi gli enzimi, questo schema aggiuntivo sta emergendo.ecco come si deve prima disegnare corsie diverse e poi provare a vedere quella che può essere l'immagine di teoverlap da tutte queste corsie, giusto, è così che bisogna ricavare le domande elettroforeticali basate sul vettore maps.Quindi, se questa era una domanda che è qualcosa di simile a quello che abbiamo parlato prima ma giustamente semplificata qui, si sta avendo questo particolare pattern elettroforetico da fare, quindi immaginein questo caso, abbiamo 3 enzimi; BamH1, EcoR1 e Pst 1, quindi questo frammento è 0,46 e rimane uno che è 0,46 + 0,2, quindi vedrete qui 2 bande che compaiono per questo particolare enzima di restrizione. Se avete usato EcoR1 e Pst1, 2,14 e 0,46, ora diciamo che avete usato ora 2 enzimi; EcoR1 e BamH1, questi 2, quindi un pezzo è 0,2 Kb e poi restarne uno è questo intero, 1,94 + 0,46, questo andrà a fare banda 2,4 KB, quindi vedrete 2 bande; 2,4Kb e 0,2 Kb.In terza situazione quando avete aggiunto tutti i 3 enzimi; EcoR1, BamH1 e Pst1, ecco che qui si stanno mappando più frammenti di 0,46, 0,2, 1,94 e sono mappati qui. Questi sono gli standard che sono noti marcatori per il DNA che possono essere utilizzati per rilevare che whatca sia l'esatto peso molecolare o le dimensioni di queste particolari fasce, quindi analizzando questo modello di gel, ora è possibile estrapolare queste informazioni e disegnare anche la vectormap, quindi sono sicuro di darvi questa comprensione informativa, è saranno molto giustificati toporvi domande in entrambi i sensi.Se vi mostro un modello di gel e vi racconto diverso enzima di restrizione usato, allora dovete darmi informazioni per come la mappa vettoriale sembrerà o se vi diamo la vectormap, potrete effettivamente disegnare le informazioni come sembrerà nei modelli di elettroforeticband, quindi queste 2 informazioni possono essere facilmente degustate da questi tipi di domande s.Così, in sintesi finora abbiamo studiato che la clonazione è un fenomeno molto importante, il processo in cui possono essere prodotte più copie di un DNA o del singolo gene, plasmidsare come vettore per portare il gene del vostro interesse, il DNA estraneo e canbe si è trasferito in una cellula ospite soprattutto, cellula batterica. L'elettroforesi in gel di Agarosa potrebbe essere utilizzata per separare queste molecole di DNA e il gene cloningca può avere molte applicazioni, la maggiorenne si può vedere le 2 finalità larghe; una è quella di moltiplicare le copie del gene e la seconda; per fare varie produzioni proteiche terapeutiche, produzioni ricombinantprote.Così, queste 2 possono essere le applicazioni più ampie che ha conosciuto n numero di già note applicativi che possiamo vedere uscire dal campo delle biotecnologie, così solo dalla clonazione e da come il lavoro vettoriale, molte cose possono essere done.Oggi abbiamo imparato la fondamentali della clonazione genica; continueremo la nostra discussione sull'applicazione pratica dell'ingegneria genetica e la clonazione del DNA nella nostra prossima lezione. Nella prossima lezione vedrete anche come la clonazione genica potrebbe essere fatta in un laboratoryset up, grazie.