Loading

Alison's New App is now available on iOS and Android! Download Now

Study Reminders
Support
Text Version

Set your study reminders

We will email you at these times to remind you to study.
  • Monday

    -

    7am

    +

    Tuesday

    -

    7am

    +

    Wednesday

    -

    7am

    +

    Thursday

    -

    7am

    +

    Friday

    -

    7am

    +

    Saturday

    -

    7am

    +

    Sunday

    -

    7am

    +

Cette diapositive est là si j'avais un moyen de le bloquer, je peux immédiatement demander un quiz et voir si vous vous souvenez, alors où va-t-on trouver le capuchon 5'? Au tout début de l'UTR. Alors quelle sera la relation du site de départ de la transcription avec la relation avec les exons et les introns? Donc le 5'UTR peut très bien commencer au site de début de la transcription pour qu'il puisse être dans l'exon aussi. D'accord, nous ferons plus de quiz plus tard. Donc maintenant, nous continuerons sur ce point, donc aujourd'hui nous allons surtout nous concentrer sur les techniques de biologie moléculaire, dont certaines ont été apprises dans d'autres cours, et certaines d'entre elles peuvent être nouvelles. Parce que certains d'entre eux sont des techniques basées sur des organismes entiers et que vous n'avez peut-être pas entendu ailleurs. Donc, essentiellement, l'accent est mis sur les techniques par lesquelles nous essayons de comprendre l'expression différentielle des gènes. Cela va donc être le point de vue de cette conférence et de la suivante. (Reportez-vous à la diapositive: 01:43) Nous continuons donc à rafraîchir notre mémoire de la structure des gènes eucaryotes. Donc le précédent était un dessin ; il s'agit d'une séquence réelle du gène de la bêta-globine. Donc vous avez les éléments de promoteur en amont comme la boîte TATA, et c'est la séquence -70. Donc ils sont là dans la plupart des promoteurs, c'est pourquoi ils font partie de la structure de base ici. Donc c'est la séquence qui signale l'ajout du bouchon. Et les couleurs sont les exons le gris sont les introns. Donc vous voyez que le UTR est un exon et là vous avez le bouchon, démarrez le codon ATG, puis le nucléotide réel et la séquence d'acides aminés traduite. Puis vous avez le début d'un intron et la fin d'un intron, puis ainsi de suite. Plus tard, en fin de compte, vous avez le codon d'arrêt, et ensuite vous avez 3'UTR. Donc, alors vous avez l'AATAAA, il s'agit d'un signal poly-A canonique, mais d'autres variantes de ce signal fonctionnent aussi comme signal de polyadénylation. Ils aident aussi à identifier le site de clivage. En fait, la machinerie qui fait le clivage, ici le clivage signifie, le pré-ARNm ou la transcription naissante peut être plus longue au niveau 3'que la maturité dans le cytoplasme ayant la queue poly-A. Donc à l'extrémité 3', le clivage se produit, donc une certaine quantité de l'ARNm transcrit est enlevée, et jusqu'au reste, la queue poly-A est ajoutée. C'est donc un complexe majeur et fortement régulé ; il est aussi gros qu'un ribosome. Un autre complexe aussi important est le spliceosome, le mécanisme d'épissage. Ce sont donc des complexes protéiques majeurs qui fonctionnent. (Référez-vous à la diapositive: 03:45) Donc, ensuite, nous regardons la transcription elle-même, donc c'est la première étape ici, donc vous avez la transcription. Donc, dès que l'ARNm ou l'ARN nucléaire naissant sort, vous avez le bouchon ajouté, le bouchon Triméthyl G. À ce stade, l'épissage n'est pas encore arrivé ; c'est ce que je veux souligner, ces ajouts aident à protéger l'ARN. Mais je ne sais pas pourquoi cette étape est rapide, mais ces ajouts se produisent aux deux extrémités avant le début de l'épissage. Donc vous avez le traitement, qui est essentiellement épissée. (Référez-vous à la diapositive: 04:28) Alors vous avez l'ARN messager ou l'ARNm mature, donc ceci arrive dans le cytoplasme où il est traduit, puis vous avez la chaîne de protéines. Et puis cela doit faire l'objet de deux choses: un bon pliage à la conformation native et aussi une modification post-traductionnelle. Ici, par exemple, le groupe prosthétique est ajouté, il s'agit d'une protéine à quatre sous-unités, c'est un hétérodimère. Donc la bêta-globine, l'alpha-globine, se rassemblent pour fabriquer la molécule fonctionnelle. Toutes ces étapes réunies sont ce que l'on appelle l'expression génique. Ne supposons donc pas que seule la transcription est l'expression des gènes, et c'est quelque chose comme le niveau des protéines, l'ensemble est l'expression des gènes. Lorsque vous parlez de gène, la définition d'un gène est une fonction biologique qui est le phénotype, donc la protéine en est responsable. Nous ne distinguons donc pas ces étapes, à partir des modifications de la structure de la chromatine, comme de l'hétérochromatine à la transformation de l'euchromatine qui est due à l'élimination des groupes méthyles et à l'addition de groupes acétyle et de groupes méthyles spécifiques à la queue de H3 ; à partir de là jusqu'à la protéine active ou inactive post-traductionnelle. Ainsi, toutes les étapes sont appelées expression des gènes ; chacune est une étape de l'expression des gènes. Nous savons maintenant ce qu'est un gène et quelle est sa forme fonctionnelle finale. (Référez-vous à la diapositive: 06:13) Alors maintenant, regardons à nouveau que nous rafraîchissons d'autres étapes, nous ne sommes pas encore en train d'entrer dans l'expression des gènes différentiels. Pour cela, nous voulons nous familiariser avec ce qui se passe, de sorte que nous saurons où des règlements peuvent se produire. Donc la première chose est que nous allons regarder l'initiation de la transcription elle-même, donc l'initiation de la transcription dans cette caricature va avec quelques détails. Néanmoins, le résumé est qu'un ensemble de protéines doit se lier dans une séquence spécifique pour permettre à l'ARN polymérase de commencer la transcription. Donc l'assemblage initial et le recrutement de l'ARN polymérase au promoteur est ce que vous appelez comme initiation de la transcription. Donc ici vous avez TF2D, facteur de transcription 2D, donc qui a d'abord à lier, il lie la boîte TATA puis recrute 2A, puis vous avez B et H, ces structures de clamp. (Voir Diapositive Heure: 07:14) Ils ajoutent, et seulement vous avez le pol II recruté, et à la pol II, vous avez les E et F qui la lient déjà, et lorsqu'il lie ce domaine carboxy-terminal, le CTD joue un rôle significatif dans la régulation. Donc c'est lié à la structure 2D, la molécule principale. (Reportez-vous à la page Heure de la diapositive: 07:39) Et donc c'est comme ça, donc c'est déjà défini, mais ce n'est pas le cas. Cela nécessite la phosphorylation du CTD. Donc, au phosphorylate ou non au phosphorylate, c'est une étape. Si la phosphorylation ne se produit pas, alors la transcription ne sera pas amorcée, bien que tout soit lié. C'est donc une étape où la réglementation se produit souvent. Certains résidus de sérine sont donc essentiels à la phosphorylation. Par conséquent, les biologistes du développement utilisent les anticorps spécifiques à la sérine phosphorylée ou les anticorps spécifiques au CTD phosphorylés pour déterminer si la transcription se produit dans un noyau donné ou non. Ainsi, avec les anticorps spécifiques au phospho ou les anticorps phosphorylés spécifiques au CTD, si vous ne détecrez pas un signal probablement, il n'y a pas de transcription de l'ARNm. Rappelez-vous donc que nous ne parlons que de l'ARNm parce qu'il s'agit d'anticorps spécifiques de pol II, mais d'autres transcription pourraient se produire. Donc une fois la pol II phosphorylée, elle est libérée de TF2D, et elle est prête à s'allonger. Donc l'initiation s'allonge, il s'agit donc de l'étape d'initiation, et il s'agit d'une élongation. Et même en élongation, elle peut être mise en pause parfois, donc nous n'allons pas entrer dans ces détails, mais c'est assez bien pour savoir qu'il s'agit d'une étape potentielle pour la régulation. (Reportez-vous à la page Heure de la diapositive: 09:17) Alright, donc maintenant nous sommes en accord avec ces bases. Nous allons donc nous pencher sur une série d'expériences qui nous aident à identifier les séquences dans la région du promoteur et aussi bien qu'ailleurs dans le voisinage du gène qui pourrait contribuer à la transcription un, et deuxièmement, nous allons aussi voir comment on peut trouver des facteurs de transcription? C'est-à-ce que des facteurs comme les protéines. La séquence d'ADN est appelée Cis parce qu'elle est dans la même molécule que le cadre de lecture ouvert et que la protéine est codée ailleurs, et qu'il s'agit d'une molécule différente de ce morceau d'ADN où vous avez le gène, donc, donc, il s'appelle Trans. Donc, lorsque vous dites des facteurs de transposition, vous parlez de facteurs autres qu'une séquence génétique donnée qui influence cette expression génique. Il s'agit donc d'un Assay très couramment utilisé ; les gens l'utilisent pour plusieurs contextes où vous voulez tester l'interaction acide nucléique-protéine. Donc, maintenant, nous étudions l'interaction entre l'ADN et les protéines afin de découvrir les éléments du promoteur qui peuvent être impliqués dans l'interaction avec un facteur de transcription spécifique. Ainsi, ces facteurs de transcription montrés en bleu aident à recruter l'ARN pol II au promoteur, et ce sont des facteurs de transcription, de sorte que ces facteurs sont énumérés ici et nommés ; ils sont là pour chaque gène. Ce sont des facteurs de transcription de base, et il y a des facteurs de transcription spécifiques à un gène que nous allons apprendre plus tard, et comment tester si un facteur de transposition donné interagit avec un élément donné de l'ADN ou non? Donc, pour tester que nous utilisons cette expérience appelée essai de déplacement sur gel ou essai de déplacement sur gel ou gel de mobilité sur gel, il y a plusieurs noms pour ça. Le terme le plus couramment utilisé est le poste de mobilité électrophorétique Assay ou E M S A ou EMSA. Certains laboratoires appellent EMSA, ou certains laboratoires appellent E M S A, certains laboratoires ne disent même pas qu'ils disent déplacement de mobilité ou changement de gel. C'est une technique simple. Donc ce que vous faites, c'est que vous prenez une version radiomarquée montrée ici, quelle que soit la couleur qui se trouve sur cet écran ici pour moi il a l'air violet. Donc vous prenez une version radiomarquée du fragment d'ADN que vous voulez tester si elle interagit avec une protéine donnée. Ensuite, vous couvrez l'ADN avec la protéine ; il peut être une protéine purifiée, ou il s'agit d'un lysat de cellules où la protéine peut être présente, donc vous incuber avec elle, et ensuite vous courir sur un gel. Si la protéine se lie à ce fragment d'ADN, la taille du complexe est plus grande que l'acide nucléique individuel, de sorte que la mobilité est réduite. Comme dans le gel, vous le voyez comme un décalage, un décalage vers le haut que vous appelez ça comme un test de mobilité par déplacement de gel ou parce qu'il retarde la mobilité de l'acide nucléique que vous appelez le test de retard de gel, donc tous ces noms sont valides. C'est ainsi que vous le voyez. Ici dans ce cas particulier, Pax 6 est un facteur de transcription dont nous verrons plus. Et sans que l'acide nucléique libre nous l'appelons une sonde libre, donc la sonde libre pour un temps donné dans une condition donnée de gel, par exemple, la taille des pores du gel, etc. Il déplace une certaine distance, et lorsque vous ajoutez le facteur de transcription qui lie ce fragment d'ADN particulier, sa mobilité est décalée ; étant donné qu'il est radiomarqué, vous pouvez le détecter par autoradiographie, il s'agit donc d'une expérience très polyvalente et très utile. Dans notre laboratoire, nous l'utilisons principalement pour trouver des protéines liant l'ARN qui interagissent avec 3'UTR et régulons la traduction. C'est donc le contexte dans lequel nous avons utilisé, donc il est donc utile pour l'interaction acide nucléique-protéine dans différents contextes. Donc dans la voie 3 vous avez ajouté Pax6, donc il se déplace, et dans la voie 4 aussi Pax6 est ajouté ; c'est une expérience de contrôle. Donc l'interprétation ici a deux explications alternatives une peut-être qu'il s'agit d'une protéine qui lierait n'importe quel acide nucléique, non spécifiquement. Il peut ne pas être spécifique à la séquence, pour vérifier que ce que vous faites est que vous ajoutez un excès molaire significatif du même fragment d'acide nucléique, mais sans radiolabeling. Donc maintenant ce qui va se passer dépend de ce qui est l'excès molaire ; disons que j'ai un excès molaire de 10 fois ou un excès molaire de 100 fois, alors cette intensité va descendre ici. Il n'y en a qu'un parce qu'il s'agit d'une caricature et juste de vous montrer le schéma. Mais dans une expérience réelle, nous aurons deux fois, 4 fois, 10 fois, 100 fois comme par exemple une augmentation en série de l'acide nucléique non marqué. Donc, cela aurait aussi une tendance égale à se lier ; c'est plutôt un inhibiteur compétitif. Donc maintenant vous avez la bande là-bas, mais ça n'a pas de radioactivité, donc vous ne la détecrez pas. Donc un autre contrôle qui n'est pas montré ici est que vous ajoutez un excès molaire similaire d'un nombre similaire de nucléotides de même longueur de l'acide nucléique mais une séquence non spécifique. Et cela ne se fera pas concurrence s'il s'agit d'une liaison spécifique à la séquence, la même séquence sans étiquette sera en compétition avec le label radiomarqué, mais une séquence différente ne sera pas compétitive. Donc même il est excessif, cette protéine va encore la lier à cette séquence particulière. (Voir la diapositive Heure: 15:41) Alright, donc la suivante est la protection de la DNase Assay, donc cette image si vous voyez, nous ne faisons plus le séquençage de l'ADN par cette méthode, mais sinon, supposons que quand j'étais étudiant, c'est un gel de routine, donc ce genre d'image que nous voyons tous les jours si nous faisons le séquençage de l'ADN. Donc, à l'époque, nous n'avons pas beaucoup fait en biologie du développement. Donc ces expériences de biologie moléculaire sont ce que la plupart des gens ont fait, donc c'est comme ça que vous faites le séquençage de l'ADN. Donc vous avez un oligo radiomarqué pour commencer, et dans chaque réaction, vous avez un didéoxy de ce nucléotide, donc vous aurez quatre voies que vous aurez quatre voies sur un gel. Et puis vous regardez dans quelle voie vous avez le plus petit fragment, et de là progressivement, vous comptez vers le haut, et c'est ainsi que vous obtenez la séquence d'ADN. Donc, c'est un tel gel de séquençage de l'ADN, mais ici, vous ne séquenez pas l'ADN lui-même. Donc à la place, l'ADN est incubé avec une protéine qui se lie à une région de l'ADN, de sorte qu'il s'agit d'un fragment vraiment important par rapport à ce qui est utilisé dans l'essai par transfert de gel. Donc ici vous essayez de trouver quelle séquence dans la séquence plus grande de l'ADN, se lie à la protéine. Une fois que la protéine se lie à l'ADN, vous ajoutez une nucléase, un traitement de nucléase contrôlé est effectué. Donc maintenant le fragment qui est protégé par la première protéine qui est liée à l'ADN, protège cette séquence, et le reste est clivé. Et quand vous exécutez un gel, puisqu'il est contrôlé par digestion et que vous avez une digestion partielle pour chaque longueur de nucléotide. Donc, dans la voie de contrôle, vous voyez des bandes pour toute la longueur car à chaque endroit qui pourrait être digéré. Mais si vous regardez cette partie dans ces deux voies et ensuite ici, vous voyez des bandes manquantes lorsque vous ajoutez Pax6. Donc, si vous comparez les deux premières voies avec la voie de contrôle qui n'a pas de pax-6, indiquez que pax6 se lie à cette région, principalement vous teste quelle portion de l'ADN est protégée par votre protéine du clivage de la nucléase. Donc, ceci est aussi fait avec la protection RNAse pour trouver une partie de l'ARN où les protéines de liaison de l'ARN se lient. Donc, c'est un test de protection DNAse, qui est aussi appelé "empreinte au sol" parce que c'est comme une empreinte, l'empreinte de la protéine ’. Avant de passer à la prochaine série de techniques, nous allons regarder une partie du gène qui est un élément régulateur, ils n'appartiennent pas à la partie codante du gène, et il peut être n'importe où il n'a pas besoin d'être toujours dans la région du promoteur, il peut être à une distance considérable, il peut être en aval du site d'initiation de la transcription aussi. Donc c'est ce que nous allons regarder, et ils sont appelés enrichisseurs. Alors, qu'est-ce que les enrichisseurs? Le premier point vous dit qu'ils contrôlent l'efficacité et le taux de transcription. Donc, ils peuvent augmenter le taux, ou dans certains endroits, ils spécifient très strictement l'expression spatiale ou temporelle d'un gène, donc c'est montré ici. Dans le dessin animé Pax6, ces barres ou bandes de couleur orange sont les exons. Ce rouge est le promoteur lui-même, alors ce vert est l'enrichisseur, et vous voyez l'enrichisseur présent ici quatre fragments ou quatre parties, et l'un d'eux est en fait dans un intron. Donc, 1, 2, 3, 4, 5, 5a, 6, 7, sont exon et entre ce sont des introns, donc l'un des enrichisseurs fait partie d'un intron aussi. Donc, tous ces enrichisseurs, comme je l'ai mentionné, contrôlent l'efficacité et le taux et parfois une réglementation temporelle et spatiale rigoureuse. Et ici nous voyons de telles informations de régulation spatiale, par exemple, cet enrichisseur entre exon 4 et 5 confère l'expression de Pax6 dans la rétine et cet exon particulier ici juste avant le début de la transcription est un enrichisseur de tube neural qui s'assure que cette protéine est exprimée dans les tubes neuronaux. Et l'autre lentille et la cornée, si vous ne l'avez pas, ne s'y exprimez pas et l'autre le plus en amont est spécifique du pancréas. Ainsi, chacun de ces quatre a quatre expressions différentes de ce gène. Donc, vous pourriez avoir le principal promoteur, le facteur de transcription de base tout, mais vous n'aurez pas de transcription, si vous n'avez pas ces enrichisseurs et ces facteurs de transcription spécifiques à l'amplificateur. Donc, nous les verrons un par un. Donc, cette séquence réelle vous indique dans une partie de cette séquence d'enrichisseur pancréatique où vous voyez des sites de liaison pour deux facteurs de transcription différents. (Référez-vous à la diapositive: 21:28) Donc, un peu plus de détails sur ce que nous verrons dans deux diapositives plus tard. Il y a plusieurs façons par lesquelles on identifie les enrichisseurs, et une technique facile à comprendre et très puissante est un piège à enhancer. Il s'agit donc d'avoir un promoteur de base conduisant un gène rapporteur, tout cela incorporé dans un élément transposable. Cette technique est donc utile dans un organisme où existent des éléments transposables endogènes naturels. Ces éléments sautent et sautent selon le contexte, où ils sont actifs ou non ; en fonction de cela, ils se déplaceront autour du génome. Et généralement, pour les éléments transposables à insérer, ils ont besoin de séquences répétitives, et où que cela soit là, ils vont y aller. Donc, si vous utilisez les éléments transposables comme un véhicule pour transporter ce rapporteur avec le promoteur principal, sans aucun élément réglementaire comme aucun enhancers ou quoi que ce soit et si vous fournissez le contexte dans lequel les éléments transposables sont actifs, pour une période donnée et si vous regardez, vous trouverez différentes insertions. Il s'agit d'une sorte de mutagenèse utilisant des éléments transposables, au lieu d'un autre mutagène. Ainsi, dans un organisme donné, l'élément transposable sera présent dans différentes parties du génome. Si ce reporter transcriptionnel est inséré dans le voisinage d'un enrichisseur comme vous le voyez dans cette photo ici. Si cet enrichisseur influence l'expression de ce reporter, cela s'exprime là où un gène est généralement exprimé, et ensuite vous pouvez le détecter de cette façon dans l'image. Il s'agit d'un embryon de drosophile dans l'image, de sorte que vous voyez le motif d'expression. Donc, pour l'essentiel, vous piégez un enrichisseur avec l'aide d'un gène rapporteur. Donc, le gène rapporteur a un promoteur faible ; il a juste le cœur de base, et il ne va pas s'exprimer seul sans être soumis à l'influence de l'enrichisseur. Ainsi, lorsque vous effectuez une insertion aléatoire, si le rapporteur est inséré à proximité d'un enrichisseur, et si le rapporteur exprime où cet enrichisseur active la transcription d'un gène, typiquement, il montre que cet enrichisseur travaille dans ce tissu particulier. Donc plus tard cela peut être vérifié par d'autres méthodes aussi, le gène rapporteur ici est LacZ. Donc, c'est fait à une époque bien avant que GFP n'ait été découvert. Donc, que vous découvrirez en séquençage de la région d'accompagnement, ce ne sera pas difficile, mais le point c'est que vous avez piégé un enrichisseur. Donc, le principal objectif à nouveau est que ces processus de pensée proviennent de la génétique ; en génétique, vous ne vous inquiéez pas de la molécule. D'abord, vous voyez si vous touchez une molécule qui est responsable d'une fonction, alors vous pouvez rechercher et trouver la molécule ; c'est beaucoup plus facile que d'avoir une boucle de molécules comme vous pouvez prendre n'importe quel organisme et l'écraser et l'envoyer à une entreprise. Et ils vous donneront toutes les protéines produites là, tous les mRNA qui y sont produits, mais que ferez-vous avec, sans vous connecter à la fonction? Donc, on appelle généralement ça une grande liste de buanderies, mais vous ne savez pas quoi faire, beaucoup de ces listes sont suspendues pendant les 20 dernières années sans que les gens aient fait des progrès, ce n'est pas un détour de l'utilité de ça. Ceci ne fait que souligner l'importance de se connecter directement au phénotype parce qu'il est simple de faire une PCR inverse et de séquencer la séquence voisine. Puisque vous connaissez la séquence, vous pouvez digérer avec des enzymes de restriction, et certains pourraient couper quelque part ici et là. Dans un état très dilué, si vous ligniez, une ligature intramoléculaire se produira. Donc, il sera circularisé, puis vous prenez la séquence que vous savez alors que vous utilisez des amorces allant dans la direction opposée, puis ces amorces PCR amplifient la région d'accompagnement et enfin vous séquence, et vous saurez où c'est. Donc c'est comme ça que vous identiez, mais l'objectif principal ici est de trouver, est-ce que j'obtiens une activation spécifique aux tissus? Donc ça veut dire que je suis à proximité d'un enrichisseur potentiel, donc c'est l'objectif de ça. Donc, ils ont été faits au milieu des années 80 à la fin des années 80. (Référez-vous à la diapositive: 26:25) Donc le suivant est la même chose, mais vous aide à déterminer, comme par exemple si vous connaissez un enrichisseur, et ensuite vous voulez savoir ce qui sont tous les différents endroits, où cet enrichisseur fonctionne, Donc vous pouvez faire des reporters sous le contrôle de l'enrichisseur et le regarder. Donc, c'est une méthode d'essai plus ancienne où il est LacZ, et ensuite vous voyez son expression principalement en vous connaissez le système nerveux central ici et l'expression spécifique du muscle. Et ici, ce que vous voyez est le cristallin de cristallin, l'enrichisseur, et vous voyez où il est exprimé, donc c'est l'image que j'aime particulièrement parce qu'elle vous montre si clairement le contrôle spécifique des tissus. Donc, il y a beaucoup de choses comme hier dans le labo, nous avons eu quelques images où le gène GFP est exprimé uniquement dans les noyaux d'un ensemble particulier de cellules le long de la longueur du ver. Donc, le ver a quelque chose appelé la couture, une structure horizontale qui fournit un renforcement structurel pour le corps. Et c'est composé de 16 paires de cellules, et ce gène particulier n'est exprimé que dans ces 16 cellules ; le reste des 959 cellules sont toutes sombres, et seules ces cellules sont vertes. Donc, il était trop tard, donc je n'ai pas fait une photo qui pourrait être montrée ici aujourd'hui. Donc, mais cela fait le même travail pour que vous ne le voyez que dans la lentille pas même dans le reste de l'œil. Parce que vous ne voulez pas de la cristalline exprimée ailleurs, vous ne voulez que dans la lentille. Donc maintenant, vous avez une idée de ce qui est l'expression différentielle des gènes. (Référez-vous à la diapositive: 28:09) Alors maintenant, laissez ’ voir les applications de l'enrichisseur. Ils sont donc bénéfiques dans deux contextes différents. Nous allons voir deux exemples. L'une d'elles est, elle est souvent utilisée à la souris où vous voulez avoir un knockout conditionnel. Disons qu'un gène a un rôle crucial dans le stade de clivage de l'embryon, et si vous venez de le frapper et de créer un allèle nul, alors il sera potentiellement mortel. Imaginez que le gène ait une fonction dans le foie, et vous voulez savoir ce qu'il fait dans le foie ; vous ne le savez jamais. Donc, quand les gens veulent trouver la fonction spécifique aux tissus ou aux organes d'un gène, ils veulent avoir des dénouements conditionnels, c'est-à-dire la suppression conditionnelle. Knockout est un nouveau nom, fondamentalement, ce que vous dites est la suppression d'un gène, c'est ce que les non-généticiens ont d'abord appelé un "knockout". Maintenant les généticiens l'utilisent aussi, puis certains appellent des boutons, et puis les gens disent que la chute, une déplétion partielle qu'ils appellent "knock-down". Je n'aime pas ce mot parce que cela ne donne pas le sens ; il ne dit pas ce que l'épuisement dit. Et de la même façon, c'est-à-dire l'insertion de transgènes. Donc maintenant nous regardons à la sortie conditionnelle, c'est-à-dire que nous ne la supprimons pas au noyau zygotique, nous allons frapper dans un tissu somatique particulier. Alors, comment faire ça? Comment les enrichisseurs vous ai­ils? Donc maintenant vous avez une souche de souris, où vous avez un bactériophage recombinase. Donc, je vais vous parler un peu du bactériophage. Je ne sais pas combien d'entre vous ont appris le cycle de vie des bactériophages. Quelqu'un a-t-il appris les lysogènes des phages et les cycles lytiques? Que fait le bactériophage pour leur vie? Comment survivent-ils? Donc, ils sont intégrés dans la cellule hôte, et quand des conditions favorables viennent, ils peuvent faire plusieurs copies et sortir de la cellule hôte. Ils le font en utilisant une recombinaison spécifique au site, et cela est exploité ici parce que si je dis recombinase et si vous ne savez pas quelle recombinase est alors il n'y a aucun intérêt à aller de l'avant. Donc Cre est une telle recombinase, donc vous exprimez cette protéine dans cet exemple particulier sous le contrôle d'un enrichisseur pour l'albumine. Donc, vous avez une souche de souris qui a une recombinase de Cre sous l'effet de l'enrichisseur d'albumine en tant que transgène. Ainsi, elle ne sera exprimée que dans le foie où l'albumine sera produite ; seule la Cre recombinase sera produite. Maintenant vous avez une autre souche de souris où votre gène d'intérêt, par exemple, dans ce cas, le facteur de transcription HNF4 alpha, son exon 2 est flanqué par la séquence reconnue par la recombinase Cre. C'est ainsi que fonctionne la recombinaison spécifique au site. Donc, le site de la Cre est appelé bactériophage p1, et c'est ce qu'on appelle les sites de loxp. Donc, les flancs du site du loxp exon 2, normalement les gens l'appellent comme floxed, flanqué de lox si floxé. Donc, vous flox le gène d'intérêt cet exon 2 ne va pas être supprimé de cette souche n'importe où parce qu'il n'y a pas de recombinase généralement dans la souris qui reconnaira le loxp. Donc, ça va être sain, et simplement exprimer la recombinase de Cre dans le foie ne va pas causer de problème pour cette souche parce qu'elle ne fonctionne que s'il y a un loxp ; sinon, vous produis une protéine qui n'est ni toxique ni d'interférence fonctionnelle. Mais si vous traversez ces deux souris et générez un double mutant, la souris qui les transporte à la fois dans son foie, vous aurez les deux éléments fonctionnels réunis. Vous aurez une recombinase Cre produite parce que tout l'enrichisseur d'albumine ne l'exprime que dans le foie et nulle part ailleurs et aussi vous devez vous rappeler que c'est du floxing germline. Donc, dans cette souche de souris, le génome de toutes les cellules aura cette séquence. Nous connaissons déjà l'équivalence génomique et cela n'a pas d'importance. Seulement dans le foie où vous avez la recombinase de Cre, le site du loxp sera reconnu et il sera traité comme le génome du bactériophage et il sera soumis à l'accise. Et puis vous n'aurez pas d'exon 2, donc c'est un knockout conditionnel. Donc, c'est comme ça que les gens utilisent des enrichisseurs. Donc maintenant dans un club de revue ou un séminaire, si quelqu'un dit que le bouton conditionnel et j'ai floxé ce gène, vous comprenez immédiatement ce qu'il est, donc il est essentiel de le savoir. (Référez-vous à la diapositive: 34:04) Et la seconde est principalement utilisée chez la drosophile. Pourtant, c'est fascinant et ils ont fait cela depuis longtemps. Ce n'est que récemment que les gens le font avec succès à C. elegans, probablement lorsque les gens ne trouvent pas de contexte critique où ils en ont besoin ou paresseux pour développer un outil ou autre. Mais récemment, ils ont montré qu'il fonctionne, mais chez la drosophile, cela a été très bien exploité, et vous savez que cet exemple est assez bon pour comprendre à quel point c'est puissant. Donc, c'est le système GAL4-UAS très similaire en principe à la précédente. Vous aurez deux souches différentes ; ici une souche est sous l'enrichisseur d'un disque imaginaire particulier. Je ne sais pas combien d'entre vous savent ce qu'est le disque imaginaire, donc le disque imagininal revient à la métamorphose. Comme la drosophile est un insecte, elle a un stade de chenille semblable à celui des vers ; la mouche sort, donc il y a la métamorphose. Donc, dans cette scène de vers, elle a le primordium pour toutes les étapes adultes, et ces primordiums sont appelés disques imaginaux. Ainsi, les primordiums d'ailes signifient le disque imaginaire de l'aile, c'est-à-dire les cellules primordiales qui sont présentes dans la chenille qui finira par s'étendre en aile chez l'adulte et ce sont donc les disques imaginaux. Vous utilisez cet enrichisseur pour contrôler l'expression d'un facteur de transcription GAL4. Donc GAL4 a de nouveau une séquence courte particulière qui est utilisée pour reconnaître et activer la transcription. Donc, vous avez ce facteur de transcription produit chez une souche de Drosophila sous cet enrichisseur imaginal spécifique à un disque. Maintenant vous avez une autre souche où vous avez l'amont de votre gène d'intérêt, ou le gène lui-même est un transgène, par exemple, Pax6. Vous prenez du système de mammifère et vous le mettez ici, donc vous essayez d'exprimer ceci sous le contrôle du promoteur où GAL4 se lie. Donc, c'est ce qu'on appelle la séquence d'activation en amont, donc la SAMU. Donc, la SAMU ici est GAL4-UAS, et c'est pour Pax6, et dans l'autre, disons un disque imaginal spécifique à l'oeil. Donc maintenant, quand vous franchez les deux et faites un double mutant, vous allez produire la protéine pax6, où en général, cela va conduire l'expression GAL4. Donc, dans ce cas particulier, ce n'est pas l'œil ; c'est une autre structure dans le thorax ou dans la région de la tête où en conduisant pax-6, ils ont été en mesure d'induire la formation de l'œil à la place de l'antenne. Donc, ce qu'il vous dit ici est que la pax-6 agit comme un maître régulateur du développement des yeux. Donc une fois que vous avez fourni pax-6, alors il semble que tout le reste est déjà là dans ce tissu particulier pour conduire la formation de l'œil. Donc, nous allons voir une telle formation d'organes similaires au mauvais endroit dans d'autres exemples plus tard au fur et à mesure que nous allons passer. Un bon groupe de gènes appelés gènes HOX ou les mutations homéotiques où vous avez un organe remplacé par un autre organe simplement parce que vous avez changé le régulateur maître. Donc, ça vous donne la polyvalence comme, par exemple, je peux avoir cette ligne, et la traverser avec une autre ligne où la SAMU pour un autre gène est présente. Il vous donne cette flexibilité, donc je peux avoir une bibliothèque comme un ensemble de gène de pilote, et un ensemble d'UAS, donc comme ça, je peux avoir, et ensuite en les rassemblant, je peux activer, donc c'est la raison principale. Dans la précédente, c'est aussi la même chose, donc c'est parce que vous voulez savoir dans quel disque imaginaire ; si j'active pax-6, je vais voir ce phénotype ou à la place si j'exprime pax-6 dans différents disques imaginaux ce qui se passe? Donc, vous voulez savoir deux choses ici: qu'est-ce que cette protéine fait si elle est mise dans un contexte biologique particulier? Un autre est le disque imaginal qui peut développer le type de structures. Dis, par exemple, il forme généralement une antenne, mais il peut aussi faire des yeux si vous fournissez un facteur de transcription spécifique à l'oeil. Donc, ceci a été largement exploité par les biologistes du développement de la drosophile, vous trouverez beaucoup de papiers, vous trouverez à peine un papier où ils n'utilisent pas cette méthode. (Reportez-vous à la section Heure de la diapositive: 40:15) Alright, c'est-à-dire la fin, mais nous n'avons pas terminé. Nous avons une autre conférence que nous pouvons commencer, qui est la continuation de la même, nous retournons dans la même région du promoteur pax-6. Donc, ça aiderait si vous vous rappelez ça, je parle du promoteur pax-6. Donc, là où l'expression de la pax-6 et comment elle est réglementée est la priorité. Donc, nous regardons son enrichisseur, et à son tour, Pax-6 est aussi un facteur de transcription, de sorte que nous