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Caractérisation fonctionnelle du gène

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Bienvenue au cours de la biologie du développement des plantes.Donc, dans la classe précédente, nous avons discuté des approches basées sur la génétique inverse, et nous avons déjà terminé la façon d'analyser ou de surveiller le patron d'expression génétique. Et maintenant, dans cette classe, nous allons discuter de la façon de caractériser fonctionnellement le gène gene.Donc, pour caractériser fonctionnellement un gène qui signifie que vous voulez savoir ce qui est une fonction spécifique d'un gène dans un processus de développement.Donc, comment le savez-vous?Donc, une approche consiste toujours à savoir que certaines fonctions sont des pertes de fonctionnement.Donc, si vous dérangez d'une façon ou d'une autre le gène, et voyez quel type de défaut de développement vous voyez quand vous faites une perte de fonction d'un gène, et cela vous dira que pour quelle fonction votre gène est nécessaire.Et puis une autre approche complémentaire pour le valider ou pour comprendre la fonction d'un gène est le gain de fonctionnement.Donc, normalement, supposons qu'un gène développementale est exprimé dans un tissu particulier, mais il n'est pas exprimé dans un autre tissu. Ensuite, si vous prenez ce gène et si vous l'exprimez ectopiquement dans le tissu où il n'était pas presentnormalement, et si c'est le cas, vous pouvez dire que si c'est vrai, alors nous pouvons dire qu'un gène en particulier est suffisant pour les forums fonctionn.Donc, ce sont les deux approches principales que nous prenons pour comprendre la fonction d'un Donc, nous allons en prendre un par one.Donc, d'abord nous prendrons des loss-fonctionn.Et ici il y a deux façons de le faire soit vous faites tomber le gène, soit vous faites tomber le gène. En gros, vous faites complètement un mutant nul où le gène est totalisé. En gros, vous réduis l'expression d'un gène particulier, mais ce n'est pas un mutant nul. Et dans le gain de fonction ou il y a deux façons de le faire, l'un que j'ai dit est la surexpression ectopique ou l'expression ectopique. Donc, vous exprimez ce gène, vous changez le promoteur, vous utilisez un promoteur plus large pour exprimer ce gène dans Un tissu où normalement il n'est pas exprimé, et le marquage d'activation de seconde méthode que nous allons voir plus tard. Donc, d'abord nous allons prendre la perte de fonction comment générer des boutons. Donc, si vous regardez les deux premières approches, nous avons déjà et aussi discuté dans les approches génétiques avancées qui est de générer des lignes inactivationlines pour un gène particulier. Donc, l'insertion de l'ADN T, la seconde était l'insertion médiée par le transposon, mais la différence entre génétique avancée et génétique inverse est que, dans les gènes de l'avant, nous n'avons pas fixé le gène, nous avons corrigé le gène Si nous fixions le phénotype ou si nous fixions le processus biologique, et alors nous essayons de rechercher des lignes d'insertion de l'ADN-T ou des lignes d'insertion de transposon, puis d'essayer de cartographiez ce gène. Mais pour dans la génétique inverse, ce que nous faisons maintenant, nous savons un gène spécifique maintenant que nous savons que c'est le gène et que je veux comprendre ce qui est sa fonction biologique, alors vous pouvez spécifiquement y aller et chercher ce gène est là des lignes d'insertion de l'ADN-T disponibles pour ce gène ou des lignes de transposon disponibles pour ce gène ou non. Donc, d'abord nous prendrons les lines.Donc, comme je l'ai dit que les premiers ont fait à un niveau très global, ils ont un grand nombre de lignes d'insertion d'ADN-T ou de lignes d'insertion de transposon, et ces lineshas ont été déposés dans quelques bases de données. Par exemple, il y a déjà tant de bases de données ou si bon nombre de laboratoires ou de manyprojets ils ont généré un grand nombre de lignes d'insertion d'ADN-T ou de transposon insertionlines. Et ce que vous pouvez faire, vous pouvez choisir n'importe quel mutant, vous pouvez demander, vous pouvez commander, vous pouvez commander, et vous obtiendrez directement ces mutants pour votre analyse fonctionnelle détaillée. Donc, il y a beaucoup de nombreux nombres de ce type de collection de mutants sont disponibles.Je vais prendre l'un des exemples, par exemple, ce T-DNA exprime ou c'est un Institut Salk qu'ils ont généré largenumber de la ligne d'insertion de l'ADN-T. Et puis vous pouvez définir où vous voulez avoir l'insertion, par exemple, si vous regardez ce gène vous pouvez avoir autant d'insertion que vous pouvez choisir que je veux une insertion dans exon 1, je veux une ligne d'insertion dans exon 2.Et puis vous prenez ces nombres et demande à partir de la base de données, et ces graines les graines mutantArabidopsis seront à votre disposition, et ensuite vous pouvez obtenir ce mutant ou Et la première chose que vous faites, si vous obtenez ce genre de ligne d'insertion, vous avez d'abord établi qu'il y a d'abord une insertion. Deuxièmement, ce qui est le motif génétique, c'est homozygote, les deux allélessont perturbés ou il est hétérozygote qu'un seul allèle sont perturbés.C'est très facile puisque vous connaissez le site d'insertion prévu site d'insertion, vous connaissez la séquence de T-DNA, vous connaissez votre gène id, vous savez essentiellement la séquence de votre gène, vous pouvez concevoir une amorce ici, une amorce inversée ici et une primeryou peut concevoir dans le T-DNA et ensuite vous pouvez faire certains PCR.Si vous faites avec cet ADN génomique vers l'avant et l'amorce inverse, s'il y a insertion, s'il y a insertion, la ligne d'insertion ne le donnera pas parce que la taille de fragment est très grande, vous n'obtiendrez pas l'amplification.Donc, si vous avez une ligne homozygote, dans la ligne homozygote, c'est essentiellement vos deux Si vous utilisez LP et RP ensemble, vous n'obtiendrez pas de bande ici. Mais s'il s'agit d'un type sauvage ou d'un hétérozygote, dans un locus hétérozygote, un autre locus n'a pas d'insertion. Ensuite, à partir du locus où vous n'avez pas d'insertion, votre type sauvage et votre hétérozygotie donneront à la bande LP et RP.Alors vous choisissez votre PL avec ceci ou RP avec ceci en fonction de l'orientation de votre ADN, et si vous avez un hétérozygote, vous aurez une sorte de bande ici. Et si c'est un type sauvage, vous n'aurez pas ce band.Donc, ceci Il est très important pour vous d'établir ce qui est le statut d'insertion de l'ADN thisT dans votre gène. Une autre chose importante que nous essayons de faire, c'est que nous avons toujours retourné la croix parce que les sinceall ont été générés par une insertion aléatoire, il y a une possibilité que dans votre plante il y a plus de site d'insertion de T-DNA. Donc, vous pourriez avoir une insertion dans votre gène, mais il pourrait y avoir d'autres insertions quelque chose dans d'autres gènes. Et que vous pouvez enlever en prenant ces lignes en croisant avec le type sauvage, puis en goingant à la génération F2 et à nouveau l'écran pour homozygote. Il existe de nombreuses techniques que vous pouvez utiliser pour éditer le genomeZFN, puis TALEN, mais récemment CRISPR Cas 9 a été utilisé très largement et très extensivelythis days.So, nous allons voir comment cela est utilisé pour éditer le géné.Donc, c'est essentiellement ce que ce CRISPR Cas 9 a basé sur l'édition du génome. Donc, ici ce que nous utilisons?Nous sommes des endonucléases bactériennes qui sont des endonucléases guidées de l'ARN qui est Cas 9.Donc, et vous ne faites que produire un ARN guide et vous produisons des protéinines de type Cas 9. Ce guide, vous pouvez cibler votre séquence là où vous l'êtes. Donc, vous pouvez concevoir un guide très ciblé, puis ici quand vous exprimez l'ARN de guide avec la protéine Cas 9, alors, ce que vous faites, supposons que ce soit votre gène et que vous voudrez modifier ce gène, vous pouvez perturber ce gène, ce que vous pouvez faire, vous pouvez choisir une séquence typicallyhere. Et il y a une exigence qui est Alors, vous pouvez cibler votre région qui est proche de la séquence PAM, et vous pouvez généraliser l'ARN qui est spécifique à cette séquence. Et puis vous clonez ce RNA guide dans un vecteur et le même vecteur vous pouvez cloner le Cas 9 et la protéine de l'endonucléase. Et puis quand vous prenez ça et que vous faites une plante transgénique, les deux partenaires vont s'y rendre. Alors ce qui va se passer, c'est la protéine Cas 9, quand la protéine Cas 9 se lie avec l'ARN guide, l'ARN guide va cibler ces endonucléases de la manière séquencespécifique. Et quand ces endonucléases sont recrutées sur le génome Copier, il fera une double strandedbreak dans la copie génomique, et ensuite que cette rupture a été considérée comme un mécanisme endogène et endogène endommagé qui est appelé mécanisme de jointure de fin non homologue sera activé dans la plante et il remplira cet écart, il sera réparé ici. Mais au cours de ce processus, il est possible de générer une suppression, vous pouvez générer une insertion, vous pouvez générer une insertion, vous pouvez perturber la région de codage, et c'est comme ça que vous aurez une perturbation génomique d'un génére.Donc, c'est une partie de la méthode qui est utilisée pour faire la mise à l'eau. Un autre mécanisme que nous utilisons pour étudier la perte de fonction est la baisse ou la rétrorégulation.Donc, nous ne perturbons pas la copie génomique, mais nous réglementons après la transcription.Donc, nous réduisons le niveau d'expression soit au niveau de la protéine, soit au niveau de la transcription.Et il y a certaines des techniques qui sont utilisées pour cette fonction ; l'une est la technologie de l'ARN anti-sens, c'est l'une des techniques pionnières qui a été utilisée, mais ces jours-là, il y a beaucoup plus de techniques.Donc, la seconde méthode est l'interférence ARN double brin ou la micro-RNAA artificielle, Si vous avez un gène et que vous connaissez la séquence de gènes, vous prenez simplement le même gène ou le fragment spécifique du gène du gène et clonez dans l'anti-senseorientation.Alors, si c'est une copie génomique de votre gène, il transcrira dans cette direction, mais vous avez généré une autre transcription qui est complémentaire à cet endogène parce qu'il est orienté anti-sens et que cette transcription ira et qu'elle se liera avec le transcrit endogène, et ensuite cette transcription sera soit dégradée, soit elle sera inhibée pour la synthèse des protéines. C'est un exemple qu'il y a peu de gènes qui ont été ciblés par l'ARN anti-sens, vous pouvez le voir, c'est le promoteur et les gènes ont été clonés dans l'orientation anti-sens. Et quand vous avez conduit ces gènes, vous pouvez supprimer le gène endogène de cette méthode comme vous pouvez voir le phenotype.Donc, c'est le contrôle, quand les gènes ont été supprimés, il y a beaucoup de défauts de développement. Et quand vous vérifiez le niveau de l'ARN ou le niveau de transcription, vous pouvez clairement voir qu'en tant que comparedto contrôles dans ces lignes anti-sens, là Mais il y a quelque chose d'important si vous regardez cette ligne, ici almostdown régulée, mais ces lignes sont partielles régulation.Donc, ce n'est pas une sorte de mutant nul, mais c'est une sorte de régulation.Donc, vous pouvez avoir ici un gradient ou vous pouvez avoir des lignes où vous avez près du phénotype thenull, mais certaines lignes que vous avez qui sont des lignes faibles, là la régulation en bas n'est pas si efficace. La seconde méthode qui est utilisée pour la régulation en aval est l'interférencetechnologie de l'ARN double brin.Cette technologie a été développée à partir des mécanismes endogènes. Dans les plantes, les ARN et les micro-ARN sont connus comme un mécanisme de régulation. Il y a un grand nombre de petits ARN, et ils régulent l'expression de nombreux gènes endogènes très importants. Donc, si vous regardez un mécanisme général, il y a deux façons d'avoir un double ARN ou de l'ARN à cheveux, ceci va subir le processus de traitement par le traitement par DICER ou AGOmédiation, puis le téléchargement, je ne vais pas entrer dans le détail ; je suis sûr que vous l'avez déjà étudié. ARN anti-sens Et ces ARN qu'ils peuvent aller et pair avec l'ARN messager endogène, et ensuite ils cibleront l'ARN messager pour la dégradation ou ils peuvent inhiber la synthèse protéique ou la régulation épigénétique n'importe quel type de régulation est possible.Donc, pour faire ça, si vous voulez utiliser cette technologie, alors ce que vous pouvez faire, vous pouvez générer votre propre construction d'interférence ARN pour un gène spécifié.Vous devez simplement imiter cette génération de épingle à cheveux, comment vous pouvez faire, vous pouvez faire un fragment spécifique à un gène et un clone en sens de sens, puis mettre une séquence non spécifique ici ou des fragments de l'étui ici, le fragment de linker, et ensuite vous prenez le samefragment et le clone en aval, mais en sens opposé. Si c'est dans le sens de l'orientation, ceci vous mettez dans l'orientation antisens et le promoteur de la puta ici, conduisez cette boucle d'épingle à cheveux. Et puis qu'est-ce qui va se passer?Cet ARN messager va faire un tel genre de structure. Donc, cette région et cette région vont paire ici, et elle va générer une structure en épingle à cheveux, et ceci sera traité de façon endogène, puis il générera le siRNA.Et ce siARN ciblera spécifiquement l'ARN endogène ou l'ARN messager contre le whichit a été conçu, puis il régulera l'expression de ces gènes. Il y a beaucoup d'exemples d'interférence ARN a été utilisé pour réguler le gène. Certains d'entre eux je vais le montrer ici. Donc, si vous regardez ici, deux des gènes ont été régulés par la méthode de l'interférence de l'ARN. Vous pouvez voir ici cette forme de buvardement nord est un niveau d'expression élevé, mais dans la ligne d'interférence ARN le niveau a diminué de façon significative. Très important facteur de transcription MADS 1.Et quand la ligne d'interférence ARN a été générée pour MADS1, vous pouvez voir ceci est le blotagain nord. Dans le type sauvage, vous avez un très haut niveau d'expression, mais dans la ligne d'interférence de l'ARN, l'expression endogène est presque nulle. Si vous pouvez détecter la structure des épingles qui est en gros plus grande de la taille, vous pouvez détecter les petits siRNAsas bien. La troisième méthode qui a été utilisée pour fabriquer des mutants à la baisse est une microRNAA artificielle. Comme je l'ai dit, le micro-ARN est un petit ARN naturel présent dans le génome des plantes, il est traité par le biais du dicer et du mécanisme muté il y a plus d'un moment.Et puis cette technique a été prise et ensuite utilisée pour générer certains micro-ARN artificiels, essentiellement ce que vous faites que si vous prenez une structure de tête de cheveux naturelle ou la boucle du micro-ARN naturellement existant, et si vous pouvez remplacer cette séquence de base, les séquences de base de microARN qui montrent essentiellement la complémentarité avec le gène. Et si vous remplacez par votre propre gène d'intérêt, vous pouvez le régler facilement par la combinaison de plusieurs PCR.Donc, par exemple, si c'est votre construction ici, vous pouvez utiliser un ensemble différent de primersyou peut amplifier cette région d'ici, puis ici, puis Vous pouvez amplifier cette région à partir d'ici, et vous pouvez amplifier cette région d'ici à ici. Donc, en gros ce rouge est votre séquence micro-ARN artificielle, puis si vous utilisez ces trois modèles ensemble et utilisez ces deux amorces, vous pouvez donc les combiner de cette façon.Et puis ce micro-ARN artificiel, vous pouvez cloner sous promoteur puis générer une ligne de frappe, et si vous voyez ici, cela a été utilisé avec succès dans une partie de l'étude.Par exemple, si vous prenez cet exemple d'Arabidopsis, chez Arabidopsis, il s'agit de mutants foliaires, donc ceci est essentiellement insertionnel mutant.Donc, si vous regardez LEAFY12, ceci a un phénotype significatif par rapport au type sauvage. Mais si vous l'attez par micro-ARN artificiel contre le LEAFY, vous pouvez imiter le phénotype. Donc, votre micro-ARN artificiel ici est aussi fort que les autres mutants. Produire à nouveau un micro-ARN artificiel contre le FT, vous pouvez voir qu'il ismontre un phénotype sévère comme l'autre mutant.Donc, ceci dit que l'ARN artificiel est l'un des moyens très efficaces de réduire les régulatégènes dans Arabidopsis.Et des choses similaires ont été utilisées chez d'autres espèces de plantes. Par exemple, si vous prenez le cas de rice.Donc, ici, un micro-ARN artificiel a été généré pour deux genes.Donc, c'est le gène SPL11, et vous pouvez voir clairement que c'est le contrôle, c'est l'ARN ou la micro-RNAline artificielle et vous pouvez voir le phénotype clair dans les micro-ARN artificiels. Par cette étude, soit vous allez à travers l'étude basée sur les knockout, soit vous passez par l'étude basée sur les knock-down.Ce que vous concluez que vous pouvez générer une perte de mutants fonctionnels et vous concludeque ces gènes sont nécessaires à cette fonction particulière. Une autre façon complémentaire comme j'ai dit que c'est le gain de fonctionne.Donc, d'abord que nous pouvons générer de l'ectopic sur l'expression ou l'expression ectopique, vous utilisez un promoteur plus large ou un promoteur qui est exprimé au niveau supérieur. Et vous pouvez utiliser soit un promoteur spécifique de tissu pour le tissu où votre gène endogène n'est pas express, soit vous pouvez utiliser une sorte de promoteur 35S général ou Ubiquitine promoterto pour conduire votre gène au sens Et si vous regardez les cas de ce mutant, vous pouvez voir clairement que c'est votre niveau d'expression de basalte, mais quand vous avez exprimé sous le promoteur 35S, vous pouvez voir que dans la plupart des lignes le niveau d'expression est très élevé par rapport au contrôle. Et vous pouvez voir ici l'expression relative et ensuite ceci est associé avec le phenotype.Donc, c'est et ensuite si vous pouvez aller à la génération suivante, vous pouvez voir clairement que l'une de la ligne a été testée dans la génération suivante, donc Si vous regardez cette plante, elle ne montre pas le phénotype, mais ces deux plantes présentent le phénotype. Et si vous allez vérifier le niveau de l'expression, il est clair que cette plante qui n'a pas de phénotype ne montre pas non plus la surexpression. Mais ces deux plantes qui montrent la surexpression, montrent le phénotype. Une analyse similaire a été faite pour le facteur de transcription MADS1.Et vous pouvez voir clairement quand MADS1 a été ectopique sur exprimé dans le riz transgénique, vous pouvez canvoir un phénotype très significatif dans l'architecture des paniques et au niveau de la Et si vous voyez le niveau d'expression, vous pouvez clairement voir que dans le contrôle, vous faites une expression de nothave dans ce tissu, mais ces lignes ont un niveau très élevé d'expression.Donc, une autre façon de générer un mutant de gain de fonction est l'étiquetage d'activation. Dans le marquage d'activation, en gros ce que vous faites de la construction de l'ADN T, vous pouvez prendre une copie multiple d'éléments de l'enrichisseur. Ici, vous pouvez prendre 4 x de l'élément enhancer, puis lancer aléatoirement dans le génome et il va s'intégrer, mais ce qui se passe dans un environnement proche avec certains promoteurs de base ou Mais maintenant, le promoteur a une partie de l'élément enhancer à proximité, puis le promoteur va commencer son activité très forte. Et dans ce cas, il se produira un phénotype qui pourrait être becauseof le gain de phénotype de fonction. Si vous regardez ici, il y a une insertion d'éléments de l'enrichisseur ici. Et si vous regardez le résultat de ceci, si vous regardez ce gène, ce gène est plus expressedin les lignes d'insertion des lignes que les lignes d'insertion. Donc, si vous regardez ici, vous pouvez voir qu'il y a un phénotype de thisline.Donc, c'est ce que l'on appelle tagging enhancer, vous pouvez rechercher beaucoup plus de gènes et identifier plus de lignes de marquage d'activation et vous pouvez les prendre pour l'étude de la fonction. Donc, c'est une façon typique d'étudier le gène dans la plante, mais il y a quelques problèmes. Donc, supposons que si vous voulez étudier la fonction de certains des gènes essentiels, les spathapens, si vous faites un knock-out ou si vous faites un bouton, si le gène est essentiel, vous devez un problème de létalité.S'il est mortel, si la perte de fonction est létale ou si le gain de fonction est létal, vous noez une plante transgénique ou vous n'aurez pas de plante à étudier.Dans ce cas, comment résoudre le problème?Certains de ces gènes sont très importants à un stade très précoce au cours du développement embryonnaire. Donc, ils pourraient être létaux embryonnaires certains de ces gènes pourraient ne pas être létaux embryonnaires, ils pourraient être mortels au stade de la plantule ou à tout moment ils complèteront leur croissance végétative, mais ils ne peuvent pas entrer dans le phasée.Donc, ils ne feront pas de fleurs fertiles, ils ne feront pas de graines que vous ne pouvez pas passer à la prochaine génération. Donc, vous ne pouvez pas prendre un gène ou vous pouvez réguler tout le temps ou vous pouvez descendre de façon régulière ou vous pouvez par-dessus exprimer constitutivement.Si vous le faites, vous ne pourrez pas étudier.Alors ce que vous pouvez faire, vous pouvez générer une construction ou vous pouvez faire une stratégie où vous pouvez réguler un gène chaque fois que vous voulez ou vous pouvez avoir une sorte de régulation plus temporelle et spatiale de base de votre gène silencing ou overexpression.Donc, il y a trois façons de réguler le gène en général est le gène régulatedconstruct.Donc, ce que vous pouvez faire, plutôt que d'exprimer un gène dans tous les tissus, vous cible la surexpression dans une partie du tissu où vous pensez que ce ne sera peut-être pas si nocif qu'il aura une létalité.Pour ce genre de choses, vous pouvez utiliser des promoteurs spécifiques de tissus ou des promoteurs connus qui s'expriment dans un organe particulier, par exemple, vous pouvez vérifier dans la feuille et vous pouvez faire un promoteur spécifique de la feuille, et exprimer des fleurs dans la feuille et y voir des fleurs dans la feuille. Second moyen de régulation ce que vous pouvez faire est le concept de régulation temporelle. Ici, ce que vous pouvez faire pour exprimer ou diminuer la régulation d'un gène à un stagenot particulier avant cela. Par exemple, supposons que la régulation d'un gène X est létale embryonnaire, ce qui vous permet de réduire le nombre de vos gènes. Dans ce cas, ce que vous pouvez faire, et si vous voulez étudier le rôle de ce gène maybein le développement végétatif ou peut-être dans le développement de la reproduction, alors vous n'avez pas besoin de réguler ou de réduire le silence ou d'exprimer ce gène pendant le processus d'embryogenèse. Donc, ce que vous pouvez faire, vous pouvez, dans ce cas, vous pouvez faire du promoteur spécifique à la construction de l'expression construire la construction RNAi ou n'importe quelle construction. Et puis ce que vous pouvez faire vous pouvez sauter votre stade précoce de l'embryogenèse. Deuxièmement, vous pouvez même combiner les deux et vous pouvez générer une construction où vous cando tous les deux. Donc, vous pouvez réguler un gène ou une construction sur l'expression, RNAi construire temporallyas et spatialement.Comment tu peux le faire?Par exemple, si vous étudiez un facteur de transcription, il y a un système qui est largement utilisé est un système basé sur les récepteurs glucocorticoïdes. Donc, nous savons que des facteurs de transcription, ils doivent entrer dans le noyau pour activer l'expression du gène. Et si vous les conservez d'une façon ou d'une autre dans le noyau et si vous pouvez réguler leur translocationentre le cytoplasme et le noyau, vous pouvez réguler leur activité et cela est fait en fusingant votre facteur de transcription avec un récepteur glucocorticoïde de rat ou de souris. L'hormone chez les animaux et les récepteurs des glucocorticoïdes qu'ils sont normalement présents dans le cytoplasme, quand ils reçoivent des hormones, alors ce qui s'est passé à l'intérieur du nucléeusable, ils activent leurs genes.Donc, si je prends un gène ici, c'est l'exemple de MADS1 ; si je prends le gène MADS1 et que j'utilise le delta GR et que le sur-express n'a pas d'importance ici, le promoteur 35S a un niveau élevé de MADS1 exprimé, la protéinis déjà fait de la protéine de fusion, MADS1 delta GR, la protéine de fusion est déjà faite MADS1 est un facteur de transcription jusqu'à ce qu'il entre dans le noyau, il ne peut pas jouer la fonction. Ensuite, si je prends cette plante et induit avec l'hormone que nous utilisons ici dexaméthasone, alors ce qui se produira, il entrera dans le noyau et il peut activer le gène. Et c'est une technique très importante, que vous pouvez utiliser pour faire la distinction entre les gènes directgènes qui sont régulés directement par le MADS1 ou le gène qui sont la conséquence de l'induction.Donc, si vous combinez ce traitement de dexaméthasone avec la synthèse des protéines Inhibiteur cycloheximide.Donc, supposons si c'est un exemple d'OsMGH3 ; OsMGH3, comme je l'ai dit plus tôt, que c'est une partie du gène qui est régulé par MADS1.Et ce qui se produit, lorsque vous traitez avec la dexaméthasone, vous pouvez voir à un point particulier le niveau d'expression d'OsMGH3 est en hausse, ce qui signifie que MADS1 est suffisant pour activer l'expression d'OsMGH3.Mais lorsque vous traitez avec le cycloheximide, donc essentiellement le cycloheximide est une protéine synthétisisinhibitor.So, il ne permettra pas la synthèse de nouvelles protéines, dans ce cas quelle que soit la protéine MADS1, la protéine delta GR est déjà faite, seulement La cible indirecte MADS1 ne sera pas activée, mais la cible directe de MADS1 ne sera pas activée, mais la cible directe sera activée et c'est comme cela que vous pouvez voir ici, lorsque nous traitons la dexaméthasone et le cycloheximide ensemble, vous ne pouvez pas voir l'activation d'OsMGH3.Ceci indique que OsMGH3 n'est pas directement régulé par MADS1, mais qu'il est indirectement réglementé par le MADS.Et si vous regardez cette construction, c'est un autre constructeur très important. Donc, c'est un cas quand vous régulez le gène MADS1 ce qui arrive que tous les organes floraux sont défectueux, vous ne ferez pas de graines fertiles, vous pouvez voir ici ce sont les organes floraux, ils sont tous convertis en ressemblestructures de feuilles ou de la forme de lemma palea comme la structure et vous n'aurez pas d'organ.Donc, c'est très difficile pour la prochaine génération est presque impossible.Vous pouvez faire une fusion MADS1 delta GR ainsi que des micro-ARN artificiels et ce que vous faites, normalement ce micro-ARN artificiel supprimera le gène que vous détestez le phénotype, mais si vous grandisissez en présence de dexaméthasone, ce delta GR va compléter le phenotype.Donc, cette construction a plus d'expression que de micro-ARN artificiel, mais il importe ici que ce micro-ARN artificiel soit conçu pour cibler 3 untranslatedregion de la MADS1 et que 3 autres régions non traduites ne sont pas présentes ici. Ici nous avons pris MADS1, désolé ici nous avons pris MADS1 seulement jusqu'au codon d'arrêt, Untranslatedregion n'est pas présent pour expliquer pourquoi, si nous prenons cette région, alors ce micro-ARN artificiel gèrera et fera taire ce gène aussi bien. Donc, dans cette construction, ce micro-ARN va spécifiquement réduire au silence la copie endogène du gène, mais il ne fera pas taire la copie transgénique et de cette façon vous pouvez utiliser un test à base de complémentationet faire ce que l'analyse phénotypique ou vous pouvez aller même identifier la cible en aval, directe vers l'aval pour l'étude.Vous pouvez voir ici, quand vous induit avec la protéine dexaméthasone est localisée dans le noyau, mais quand vous n'induit pas, vous ne voyez pas la protéine à l'intérieur du noyau. Une autre façon très importante, la technique qui est utilisée pour réguler à la fois l'expression spatiale comme l'expression spatiale, est le système de base XVE ou le récepteur des œstrogènes. Donc, ici fondamentalement ce qui a été done.Donc, un facteur de transcription chimérique a été généré, donc ce XVE ; XVE est un facteur de transcription, ici il y a trois composants X, V et E. X est un domaine de liaison de l'ADN de la protéine LexA, LexA est de Et puis V est le domaine de trans-activation de la protéine VP16 qui est du virus, puis E est le récepteur des oestrogènes humains.