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Modèle d'expression différentielle

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Bienvenue au cours de la biologie du développement des plantes.Donc, dans la dernière classe, nous étions en train de discuter d'approches basées sur la génétique inverse, que nous sommes en train de prendre pour étudier le développement. Donc, dans cette classe, nous avons couvert l'identification et l'isolement des gènes pour les fonctionnements.Maintenant, nous avons commencé les approches basées sur la génomique fonctionnelle, ce que nous avons discuté de la première étape était la surveillance de l'expression des gènes. Et maintenant, nous avons vu comment vérifier le profil d'expression des gènes individuels.Et quelle est la façon d'étudier le modèle d'expression?Ce qui est important ici, c'est que vous pouvez à nouveau résoudre le problème. L'objectif principal d'une analyse génomique ou globale est d'identifier les gènes différentiels dans des conditions différentes. Il peut s'agir de différents organes, il peut s'agir de différents tissus, il peut être différent par étapes, il peut être différent entre un type sauvage et des mutants n'importe quelle combinaison. Je vais lister certains d'entre eux ici, mais nous ne nous concentrerons que sur le few.Donc, c'était la façon d'étudier.Tout d'abord, l'analyse en série de l'expression des gènes, SAGE.Here, a commencé par l'obtention de quelques courtes étiquettes de séquence à partir d'un grand nombre de cDNAclones.Et puis, ils l'ont séquençage et l'identification de l'expression différentielle des gènes. Une autre façon a été l'affichage différentiel RT PCR, ici ce que les gens ont utilisé pour prendre une population d'ARN total, ils ont utilisé l'ADNc.Ensuite, ils ont utilisé pour couper cette bande, amplifier le fragment, le clone, la séquence et identifier ce que sont les gènes. Une autre façon de procéder a été l'hybridation soustractive, c'est-à-dire l'amplification par PCR du seul cDNAfragment qui diffère entre deux conditions. Et donc, ici, il y avait deux populations de l'ARN messager, vous faites de l'ADNc puis faites la soustraction, soustrayez. Après soustraction, vous identifiez ou vous isolez seulement les populations qui La technique, cette technique a été très largement utilisée dans la plupart de la base de la génomique, l'expression différentielle, l'analyse qui était la microréseau.Microarray était la technique, où un petit fragment ou un petit oligo oligosé a été repéré sur une puce, puis l'ARN total a été, isolé à partir d'une particule, pour identifier l'expression différentielle. Nous allons voir les microréseaux de micro-ARN en détail, comment cela a été utilisé. Et c'est l'une des technologies les plus utilisées dans la biologie du développement des plantes.Et maintenant, le séquençage de la prochaine génération a changé tout le scénario, maintenant nous faisons beaucoup de séquençage de l'ARN et cela a beaucoup d'avantages sur le microtableau.Donc, avant d'aller au séquençage de l'ARN et de l'ARN en détail, je donnerais quelques exemples typiques de différentes technologies, qui ont été utilisées. Par exemple, si vous regardez ça, cette recherche ici le profilage de la transcription a été faite à l'aide de SAGE en tant que méthode. Donc, ça a été utilisé et les gens ont identifié l'expression différentielle ici. Alors, c'est un exemple, où l'affichage différentiel RT PCR était done.Donc, c'est Boîte MADS contenant un facteur de transcription dans le riz. Et ce qui était important ici, ce gène qui est MADS 1, il a été exprimé en sepaléquivalents. Ce qui dans le cas du riz, c'est le lemme et le palea, mais il n'a pas été exprimé dans l'organe interne. Mais quand le gène a été muté, alors que ce gène a été réduit au silence, l'effet a aussi été observé dans les organes internes, les organes floraux internes par exemple, les lodicules, les étamines, alors c'est la question qui, si le gène n'est pas présent dans ce tissu, comment il est régulé?Donc, peut-être qu'il est activé parce qu'à un stade très précoce, il a été exprimé dans l'ensemble floral a.Donc, on a émis l'hypothèse que peut-être, il activait certains régulateurs précoces à très précoce, dont l'expression est basique dans les organes floraux intérieurs et la régulation. Pour identifier ce genre de gène, l'affichage différentiel RT a été repris et l'un de ces gènes a été identifié qui était OsMGH3.Et il a été montré qu'en fait OsMGH3 a été exprimé dans les fleurs florales, intérieures. Donc, c'est encore si vous regardez, c'est de la tache nord et si vous regardez la L'expression patternof OsMGH3, vous pouvez voir que dans le type sauvage, la gaine foliaire n'est pas exprimée alors que, dans la jeune panicule, la panicule est une inflorescence dans le cas du riz, elle a un niveau très élevé d'expression. Mais si vous regardez une panicule qui est une panicule mutante, où MADS1 est régulée, l'expression d'OsMGH3 disparaît également. PCR.Ensuite, l'hybridation subtractive a été utilisée dans cette étude.Là où ils ont fait un profil comparatif de l'expression génétique entre la variété de semences et le type sauvage seedy durant l'orgue florale et le développement, je ne vais pas entrer dans le détail, puis la technique dont je parlais est la microréseau.Donc, comme je l'ai dit que le microarray est une sorte de chip.Donc, ce genre de puce a été généré et ceci a été très largement utilisé à l'ère post-génomique, avant le séquençage de l'ARN. Une fois le génome séquencé, nous avons identifié les gènes, nous avons identifié la séquence des gènes, puis ces gènes, les sondes pour ces gènes ont été conçues et ces sondes étaient spottedin ces chips.Donc, pour chaque gène, nous avions une sorte de sonde. Et puis il y avait deux façons d'identifier l'expression différentielle, l'une était la couleur et l'autre.Donc, d'une façon de couleur ce que vous devez faire, supposons que vous voulez tester un échantillon de type sauvage qui est votre test ou votre mutant sample.Donc, vous voulez identifier les gènes qui sont exprimés de façon différentielle entre ce type sauvage et ce mutant. Et ce que vous pouvez faire, vous pouvez extraire l'ARN total du type sauvage, l'ARN total à partir de thèmes alors vous étiquetez cette RNA.Et une façon d'étiqueter était, la synthèse de l'ARN de la biotine, tous les deux étaient essentiellement labeled.Donc, l'ensemble de la population d'ARN dans ces deux conditions, ont été marqués et ensuite ce cRNA étiqueté a été appelé pour faire l'hybridation dans les puces. Donc maintenant, ces puces contiennent, Maintenant, depuis que nous avons un gène A, plus en cas de type sauvage, le butit est régulé en cas de mutant. Alors vous vous attendez à plus de cRNA dans le type sauvage, moins de cRNA chez le mutant. Et quand vous hybrider sur la puce, vous attendez plus de signal pour cette sonde de type sauvage alors que, moins signal en cas de mutant. Et si vous comparez l'intensité du signal, vous faites le balayage de l'acquisition de données et si vous calculez la valeur absolue de l'hybridation, vous pouvez identifier la différence dans le profil expressionnelle du gène A entre la nature Et puis, une autre façon d'analyser était que vous avez l'ARN de type sauvage, vous avez de l'ARN mutant et ensuite vous prenez l'ARN total de l'échantillon. Et ensuite vous les étiquetez avec deux colorants différents par exemple, c'est cy5, c'est de la couleur rouge, le cy3 donnera de la couleur rouge, le cy3 donnera de la couleur verte, et ensuite vous prenez la même quantité d'ARN et hybrider sur le même chip.Donc, la différence entre ces deux méthodes était, ici les deux ARNt, les louecadas ont été marqués avec la même étiquette, alors qu'ils sont étiquetés avec les différentes étiquettes. Si le niveau d'expression de A est identique chez le type sauvage et le mutant, alors vous attendez la même quantité d'ADNc de cy 5label et de cRNA de niveau 3 pour s'hybrider avec ce probe.Donc, vous attendez la même quantité de signal rouge, la même quantité de signal vert et le résultat sera jaune ici. Mais si l'un d'entre eux est présent de façon différentielle par exemple, si l'expression est de type sauvage, alors vous attendez plus de signal rouge que le vert et Alors la couleur de ces taches va changer, elle sera plus orientée vers le rouge. Si le gène est régulé, alors il sera plus vers le vert. Donc, sur la base de cette couleur et ensuite la quantification, vous pouvez calculer la modificationentre le type sauvage et le mutant pour tous ces gènes. Ces techniques que vous pouvez également utiliser pour les différentes étapes, ce n'est pas seulement dans le type sauvage et le mutant. Par exemple, si vous prenez cette case.Donc, où ce que les gens ont étudié?Les gens ont étudié les gènes qui sont exprimés de façon différentielle, à différents stades de développement du développement des panicules de riz ou de développement des fleurs. Par exemple, si vous prenez ces étapes, il s'agit de l'étape 0 qui est essentiellement de la phase végétative; il s'agit de votre méristème apical de la tige. Donc, ce que les gens ont fait, ils ont pris de l'ARN d'ici de toutes ces différentes stageset ils ont effectué l'analyse des microréseaux en détail, et comment ils pouvaient en fait identifier plusieurs choses, première chose qu'ils pourraient identifier le gène qui est présent dans un stade de développement particulier, mais absent dans le stade développementale développementale. Ou un gène particulier, comment c'est le schéma d'expression dynamique est à travers le développement. Par exemple, certains gènes peuvent être 0 ici et ils sont soudainement activés et ils sont maintenus Ou bien ils sont activés dans ce domaine de développement et ensuite ils vont vers le bas .Donc, c'est un modèle d'expression fondamentalement dynamique que vous pouvez analyser à l'aide de cette technologie.Et tout cela, nous le faisons au niveau mondial et nous pouvons identifier.Si vous voyez le gène LAX, si vous voyez le gène LAX, le gène LAX est très bas à 0 stade, mais à travers les étapes 1 2 34 5 le niveau d'expression augmente, alors que si vous prenez ce FZP qui est FRIZZY PANICLE, c'est l'expression commence ou active seulement à partir de la phase 4 et continue l'étape 5.Il n'est pas présent dans la phase initiale, alors que ce MADS3 est activé dans stage5.Donc, c'est comme ça que ce microtableau a été extrêmement utile, dans l'étude de ce type d'analyse différentielle de l'expression du génome widéor. Exemple d'un microtableau qui a été utilisé et ici vous pouvez regarder ici que, ils ont concentré leur étude sur la boîte MADS contenant des gènes. Pourquoi je me concentre le plus sur la boîte MADS contenant le gène?Parce que c'était la classe, qui est bien établie pour réguler beaucoup de processus de développement, ils sont très importants pour le développement de la plante. Et ici, ils ont pris un grand nombre de tissus matures feuille, racines, semis de 7 jours, puis cette panicule, différente taille de la panicule. La taille de la panicule ou de l'inflorescence est différente de celle de celle-ci. Et puis ils ont vérifié le patron d'expression, par l'analyse des puces, et ce qu'ils peuvent identifier, il y a beaucoup de genes.Donc, si vous regardez l'expression est hérée.Donc, si le vert est moins Et puis vous pouvez regarder qu'un gène particulier, si vous allez à travers les différents organes, vous pouvez voir leur expression. Comment les patrons d'expression changent d'un stade de développement à un autre de développement ou d'un tissu à un autre. C'est donc une étude importante.De nos jours, c'est le séquençage de l'ARN, c'est le séquençage de la prochaine génération il est très bon marché et très facilement disponible.Donc, maintenant, les gens font le séquençage de l'ARN et le séquençage de l'ARN a certains avantages sur themicroarray.Le premier avantage est que, pour générer les puces, vous devez avoir des informations de séquence, ce qui signifie que les génomes de l'organisme doivent être séquencés, puis, et ensuite, vous pouvez définir des sondes pour la puce. Mais dans le séquençage de l'ARN, le génome même n'est pas séquencé, il peut être séquencé par séquençage de l'ARN. Par exemple, dans un ARN messager, vous pouvez générer un ARN messager, vous pouvez générer un ARN messager, vous pouvez générer un ARN messager, où vous n'épingez pas d'intron 1 ou que vous n'avez pas de spliceintron 2 ou que vous n'épingez pas d'intron 3 ou que vous n'épingez pas des introns, vous pouvez même ignorer les introns, vous pouvez fractionner cet exon avec l'intron.Donc, ceci fournit un grand nombre de transcrits différents du même gène. Il est très difficile de garder des sondes pour toutes les variantes de la hanche, dans le microarray expérimental. Donc, c'était très difficile parce que si vous ne savez pas, combien de variantes d'épissées existent pour un gène particulier, c'est très difficile. Parce que normalement, quand vous concevez-vous la puce, vous conservez une ou peut-être deux ou trois puces pour un gène particulier. Mais s'il y a un intron ici, vous n'aurez pas de variante d'intron ou de variante d'épissage, mais en cas de séquençage de l'ARN, il peut capturer toutes les variantes.Donc, si vous regardez la technique Comment fonctionne le séquençage de l'ARN?Donc, en gros, ce que nous faisons dans le séquençage de l'ARN, vous extrayez l'ARN messager total, puis vous pouvez supprimer spécifiquement l'ARN messager de l'ARN total. Comment vous pouvez faire ça?Vous savez tous que les ARN messagers ils ont la queue poly A aux trois extrémités et que vous pouvez utiliser l'oligo dT marqué avec une sorte de perles. Et utiliser ce système, vous pouvez spécifiquement retirer l'ARN messager de la population totale d'ARN. Et ensuite vous pouvez utiliser cet ARN et vous pouvez faire le fractionnement vous pouvez faire une petite fragmentation de l'ARN, puis utiliser des amorces aléatoires. Les amorces aléatoires sont essentiellement de petits nucléotides simples de six nucléotides avec différents séquences.Donc, il peut aller de façon aléatoire et lier différents endroits et ensuite vous pouvez faire le premier strandcDNA, la synthèse de synthèse d'ADNc de deuxième brin. Produisent un ADNc différent, différent de petits fragments, et il s'agit d'un ADNc doublestandard.Et puis une chose importante, ce que vous pouvez faire, vous pouvez mettre le phosphate, normalement les amorces, ils n'ont pas de phosphate à leur end.Donc, alors vous pouvez mettre du phosphate parce que si vous devez utiliser ça pour un processus de ligationprocess, s'ils n'ont pas de phosphate à leur extrémité, alors ils ne peuvent pas faire de phosphodiesterbond.Donc, vous pouvez faire la réparation finale mettre le phosphate. Et une autre chose que vous pouvez faire, vous pouvez ajouter le flanc A, ceci vous pouvez faire avec la polyA polymérase et ensuite si vous ajoutez cette queue, ceci vous permet de prendre ce fragmenteur et d'ajouter un adaptateur de sorte, vous pouvez liger l'adaptateur. De T. Donc, T et A, ils vont se rendre et ils vont s'annealto, puis vous pouvez effectuer une action ligation. Donc, essentiellement ce que vous générez, vous générez des fragments d'ADN à double brin avec adaptateur à la fin. Et puis vous savez la séquence de cet adaptateur, vous pouvez utiliser cette séquence d'adaptateur et vous pouvez prendre et séquencer toute cette population d'ADNc, ce qui est très largement utilisé ces jours-là et cela peut être utilisé pour identifier.Donc, si vous prenez deux populations différentes d'ARN, deux populations différentes d'alors génèrent deux populations différentes d'ADNc fragmenté.Et si vous les séquencer et les comparer, vous pouvez identifier un niveau d'expression différentielle différent de RNA.So, encore une fois, je donnerai quelques exemples où le séquençage de l'ARN a été utilisé pour identifier le modèle d'expression différentielle. Par exemple, si vous prenez this.Donc, ici différents fruits de scène ont été pris et l'ensemble des ARN ont été extraits et l'ARN séquencinga été fait. Et vous pouvez voir clairement différents gènes et leur mode d'expression. Alors, ça dit, qu'il y a une expression différentielle de différents types de gènes. Et ici vous pouvez voir que c'est une carte thermique des données de séquençage de l'ARN qui implique le développement de thésaurus. Donc, ils ont pris différents types de tiges ici secondaires, des pousses primaires, puis il y en a, quelque chose appelé "pousses mères". Et ils ont extrait l'ARN total et ils ont effectué le séquençage de l'ARN, à travers les différents types de pousses et ils ont identifié différents gènes spécifiques des tissus qui sont présents ici. L'analyse de séquençage a été effectuée pour les transcriptomédicaux durant le développement des pétales à Rose.Un des membres de Rosaceae et où vous pouvez voir qu'ils ont pris différentes stagesdes pétales du stade de développement différent et qu'ils ont réalisé la séquence d'ARN séquencinganalyse, et ils ont pu identifier un autre motif d'expression génomique. Et vous pouvez voir ici tous ces différents types de facteurs de transcription. Un autre moyen si vous prenez ce type de séquençage de l'ARN dans le séquençage de l'ARN, vous pouvez combiner avec un autre technique.Donc, il ne s'agit pas d'une technique autonome, et ensuite vous pouvez effectuer une méthode plus précise ou plus précise pour générer des données de séquençage de l'ARN. Par exemple, si vous avez des stades de développement peut-être que j'en tirera ici, par exemple, si vous voulez étudier un stade de développement à un moment particulier, supposons que vous voulez étudier la phase de développement racinaire et que vous savez que le développement des racines s'effectue à différentes étapes du développement. La racine latérale, ramification, c'est que la spécification de certaines cellules, certaines celles.Donc, ce sont les cellules matures, maintenant elles prennent des propriétés de cellules souches, puis ces cellules commencent la division cellulaire. Elles subissent le processus de la division cellulaire et elles génèrent une sorte de primordia qui s'appelle primordiums racinaires. Et puis cette racine, les primordiums racinaires subissent le processus de différenciation cellulaire. Il commence à établir un programme de différenciation spécifique et enfin, les primordiums sont émergés.Il y a beaucoup de techniques disponibles, l'une de la technique qui est appelée capturemicrodissection laser. Vous pouvez utiliser et vous pouvez collecter tous ces primordiums, puis extraire l'ARN total de ce primordia et ensuite vous pouvez identifier.Ou vous pouvez prendre un échantillon de type sauvage et l'échantillon mutant, il manque un facteur de transcription particulier. Et vous voulez identifier quels sont les gènes, qui sont ceux dont les expressions sont affectées, lorsque vous mutez un gène particulier. Ensuite, vous pouvez prendre l'ARN total, vous pouvez faire l'extraction totale de l'ARN, et ensuite effectuer le séquençage de l'ARN pour identifier les gènes différentiels qui sont présents dans ces deux conditions particulières ou deux mutants.Donc, c'est l'analyse du schéma d'expression, où nous avons essayé d'étudier aujourd'hui comment identifier l'expression différentielle Maintenant, pour faire une analyse spatiale et temporelle de l'expression temporelle, il y a plusieurs méthodes, dont nous allons discuter plus dans la prochaine classe. Mais pour les présenter brièvement, une façon de faire est d'étudier la localisation de l'ARN, ce que nous allons faire par hybridation in situ à ARN ARN. Ensuite, vous pouvez faire la localisation des protéines, vous pouvez utiliser des anticorps spécifiques et vous pouvez étudier leur localisation spécifique dans les tissus. Et vous pouvez faire une sorte de piégeage du promoteur, où vous pouvez utiliser une sorte de gène de réduction du promoteur. Et vous pouvez identifier si un promoteur ou vous pouvez faire la transcription La fusion, vous pouvez faire fusion.Donc, nous allons peut-être arrêter cette classe ici. Et dans la prochaine classe, nous allons discuter en détail, comment étudier l'exprespattern spatio-temporelle et la caractérisation fonctionnelle du gène par des approches basées sur la génétique inverse.