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Maintenant, nous nous concentrerons sur les approches basées sur la génétique inverse. Donc, dans les approches de génétique inverse, nous avons d'abord identifié le gène et nous essayons de comprendre ce qui est la fonction spécifique d'un gène particulier ou d'un groupe de geneshave dans un processus de développement.Donc, si vous regardez cette diapositive, ce processus de génétique inverse peut être étudié en suivant les étapes.Nous voulons identifier un gène d'intérêt et isoler ce gène de l'état ; le gène de l'interestpour l'étude de sa fonction. Ensuite, pour analyser le patron d'expression de ce gène. Donc, nous partons d'une génétique. Donc, nous devrions savoir où exactement ce gène est exprimé en ce qui concerne les stades de développement, les organes du développement, quoi qu'il soit. Une fois que nous avons identifié le gène que nous connaissons le facteur d'expression, pourquoi nous voulons connaître le schéma d'expression, parce que cela nous permettra d'attendre un phénotype dans le tissu où il est normalement exprimé. Pour la caractérisation fonctionnelle de ce gène, il y a différentes approches qui sont prises en charge le plus souvent que nous prenons le gain de l'approche fonctionnelle et nous essayons d'exprimer un gène où normalement il n'est pas exprimé et regardez ce qui se passe. Ceci dit si un gène est suffisant pour lancer n'importe quel programme de développement ou pas. Deuxième approche que nous prenons pour une perte de fonction, dans cette étude, nous essayons de réduire au silence un gène ou de détruire un gène ou de faire tomber un gène, puis de chercher ce qui se passe dans un développement, cela nous permet de comprendre si le gène est nécessaire les forums particuliers Ensuite, nous déménagerons et nous essayons de comprendre ce qui est le mécanisme qui sous-tend un développement particulier en étudiant l'interaction d'un gène particulier, il peut s'agir d'une interaction interactionphysique génétique avec d'autres régulateurs ou de ses interactions régulatrices. Une autre chose très importante, donc si nous voulons prendre une approche génétique inverse, j'ai dit qu'il y a quelque chose que nous avons à fixer d'abord avant d'identifier un gène pour la première fois ce que nous voulons corriger est des processus de développement.Donc, vous devez définir ceci est très similaire ce que nous avons fait dans le généticsas well.So, dans Si vous êtes intéressé à rechercher la fonction méristématique ou les gènes qui sont responsables de la détermination de l'organogenèse ou de la phase de transition développementale, nous fixerons d'abord le processus, puis vous voulez préciser le type de gène que vous souhaitez étudier.Donc, il y a des gènes qui sont directement impliqués dans un processus biologique, par exemple, la division cellulaire ou certaines enzymes qui contrôlent fondamentalement un processus fondamental et la seconde classe de gènes sont des gènes régulateurs. Donc, ces gènes sont principalement régulant l'activité de certains des gènes de développement. Et quand il s'agit de la régulation, il y a différentes étapes de régulation génique régulationet au moins des étapes importantes où vous voulez regarder la régulation est la transcriptionalregulation, ici surtout nous nous focalisons sur le facteur de transcription spécialisé facteur de transcription. Il y a des régulateurs de développement connus qui régulent la synthèse des protéines ou la traduction d'un ARN messager particulier, puis de la régulation post-traductionnelle où vous controlez l'activité d'un régulateur particulier en régulant ou en modifiant la protéine de post-post-traduction.Donc, avant de commencer un processus, nous devons définir cette étape par étape, nous avons à fixer le processus biologique, nous Dans une seconde approche, vous pouvez prendre plus de gènes globaux, ce que l'on appelle génomicshere, vous n'identifiez pas un seul gène, vous identifiez un groupe de gènes qui sont spécifiques dans un processus de développement particulier, puis vous déplacez ahead.Donc, quels sont les critères que nous chercherons à identifier ou à sélectionner une particule qui pourrait avoir une fonction dans le développement Donc, il y a deux paramètres importants que nous considérons comme le premier est l'analyse homologue. Donc, d'abord ce qui arrive à certains des organismes modèles, leurs génomes entiers ont été isolés ; si les génomes sont séquencés, alors l'étude a été faite à l'avant, les études de base génétique sont assez avancées et ensuite vous pouvez identifier certains gènes qui ont déjà montré une partie de la fonction développementale, et ensuite vous pouvez voir d'autres espèces de plantes, d'espèces végétales apparentées ou dans d'autres classes de plantes et ensuite vous essayez d'identifier s'il y a un gène homologue pour cette particule. Par exemple, certains organismes de réglementation font une sorte de famille de gènes.Donc, il y a plusieurs gènes qui appartiennent à cette famille et parfois ce qui se passe, la famille entirefamiliale est principalement régulant, certains types de voies de développement ou ils sont dicorégulés de multiples processus physiologiques et développementales.Donc, vous pouvez regarder la famille de gènes et ensuite vous pouvez regarder la similarité de la séquence.Donc, si nous supposons que vous avez un gène particulier peut-être dans quelques diapositives, je vais montrer l'exemple de la façon dont cela a été pris, mais vous pouvez choisir un gène qui est connu pour avoir une fonction de développement, alors vous pouvez prendre les séquences et essayer de trouver un gène homologue chez une autre espèce apparenté. Et puis s'il y a un domaine fonctionnel commun, vous pouvez rechercher cela, puis un autre est que vous voyez le lien qui est appelé analyse phylogénétique. Donc, en général, si un gène a un niveau d'homologie élevé ou s'il est très lié avec un gène particulier, vous pouvez vous attendre à ce qu'il ait un Donc, c'est dans des approches in silico, pour la plupart des approches de bioinformatique, cela vous aidera à définir un certain nombre de gènes que vous pourriez prendre pour l'étude fonctionnelle.Ensuite, la deuxième chose importante que vous pouvez vérifier l'expression pattern.Donc, c'est très important parce que si vous êtes intéressé nous supposons que vous êtes intéressé à étudier un gène qui est responsable du développement de l'organe floral, alors vous voudrez vérifier le motif d'expression et vous préférerez un gène qui pourrait avoir une expression spécifique dans la fleur ou certains des organes du flower.Ainsi, vous pouvez vérifier l'expression spécifique de l'organe et ensuite vous pouvez vérifier l'expression spécifique de l'organe même à l'intérieur de l'organe si vous voulez définir une fonction très spécifique. Si vous identiez un gène qui est présent dans une étape particulière, vous pouvez par exemple identifier un gène qui n'est pas exprimé dans les végéatives; mais il est exprimé dans les stades de la reproduction, vous pouvez vous attendre à ce que ce gène soit une fonction pendant le stages.Donc, ces deux approches principales que nous prenons pour définir un gène et vous pouvez voir certains de l'exemple, comment ces approches ont été prises. Par exemple, chez Arabidopsis thaliana une classe d'un facteur de transcription MADS box containingtranscription a été bien étudié et il a été identifié qu'ils jouent un rôle très important dans le développement de l'organe floral et de l'organe floral. Ainsi, cette approche a été utilisée pour identifier certains des gènes de la boîte de riz MADS. Par exemple, si vous regardez ce MADS 5, MADS 1 et ils ont été pris pour des approches basées sur la génétique inverse pour montrer leur fonction spécifique pendant le développement de la fleur de riz. De même, comme je l'ai dit, peut-être dans certaines des classes futures, nous étudierons comment le développement du flux est étudié Dans le modèle dicot Arabidopsis thaliana et là ce que nous avons trouvé, nous avons trouvé des classes de gènes en particulier A class, B class, C class.So, c'est typiquement A class gene, then you have B class gene and C class gene and A classgenes has been démontrée to réguler sepal and petal identity B class genes are montrée toréguler l'identité des pétales et des stamen, et les gènes de classe C sont montrés pour réguler les stamen et la carpelidentité.Et si vous regardez le domaine d'homologie de similitude de séquence dans d'autres espèces, vous pouvez identifier le gène homologue. Si je prends un exemple, par exemple, si vous regardez ce PI ; PI est un générez de classe B qui interagit avec AP3 pour spécifier le développement des pétales et des étamines dans Arabidopsis.Now, on a identifié des homologues comme MADS2 et MADS4 en se basant sur l'analyse phylogénétique du domaine fonctionnel de séquencesimilarité dans le riz et lorsqu'ils ont étudié ; ils ont été étudiés dans le riz, il a été montré qu'en fait ils sont impliqués dans la régulation de l'équivalent pétale qui est lodicule dans le riz et les étamines Par exemple, il n'y a qu'un seul gène PI chez l'Arabidopsis, mais le PI est en double, nous avons deux gènes comme MADS2 et MADS4 et quand les deux ont été étudiés. Sur le plan fonctionnel, on a trouvé que MADS2 est plus important pour le développement de l'équivalent pétale, alors que MADS4 est probablement plus régulant le développement des étaits.Donc, il s'agit d'une approche où vous pouvez identifier un gène putatif pour l'étude.Donc, il y a différentes façons d'étudier le modèle d'expression. En général, les gens se servent de l'analyse de la buvardage dans le nord au début de la période où le génome ou les génomes n'ont pas été séquencés. Donc, c'est plus une technique basée sur l'hybridation que nous verrons un certain temps. Mais, ce que nous faisons, ce que nous faisons, c'est que nous extrayez un total de l'ARN fractionnant par électrophorèse sur gel et que nous utilisons un ARN antisens ou une sonde spécifique d'ADN ou d'ARN qui est étiqueté radioactivement, puis nous sondons. Donc, il va s'hybrider avec l'ARN messager qui est spécifique à la sonde et puis vous pouvez le détecter par la méthode de détection radioactive. Par exemple, si vous regardez quelques exemples, c'est un des gènes MADS et il a montré que cette feuille peut être sepale, pétale, stamen et carpelle, vous pouvez voir que le thisgène est très spécifiquement exprimé dans le carpelle, mais il n'est pas exprimé dans tous les autres tissus. De même, si vous regardez ces gènes sont des gènes différents et ils sont très larges très forts dans la fleur, mais ils ne s'expriment pas ou ils expriment très faible en feuilles et Donc, ça dit une sorte de ; c'est une sorte d'expression différentielle pattern.Donc, vous pouvez utiliser le motif d'expression, maintenant on peut s'attendre à ce que si j'ai pris ce gène, je m'attends à ce que ce gène ait un rôle dans le développement de la carpelle alors que, ce genre d'espèce générale, il a une expressionnelle spécifique à la fleur. Donc, on peut dire qu'il pourrait avoir une fonction dans la fleur.Pour isoler un gène si votre organisme modèle ou si votre plante vous intéresse, si le génome n'est pas séquencé, alors vous devez adopter une approche pour identifier le gène parce que vous ne pouvez pas concevoir une amorce que vous ne pouvez pas faire de polymérase en chaîne, butif votre génome est séquencé, alors il est relativement facile de concevoir une amorce spécifique pour votre gène toute la séquence est connue et vous pouvez amplifier la PCR.Mais prenons le premier exemple si le génome n'est pas une séquence, puis une façon d'isoler les gènes à l'aide de la banque d'ADNc ou de la banque génomique.Quelle est cette bibliothèque?Donc, en gros ce qui arrive que si le génome n'est pas séquencé, vous pouvez faire leur libraryet comment vous pouvez faire ça ; vous pouvez prendre soit une cellule spécifique à un tissu, soit un organigramme particulier vous pouvez extraire l'ARN messager total ou la DNA.Si vous voulez faire de la banque d'ADN génomique, vous allez extraire l'ADN génomique total, mais si vous voulez faire de la bibliothèque d'ADNc de messager, vous devez extraire l'ARN messager total ici ceci fournira l'information du gène exprimé ceci fournira l'information de l'entiregénome au niveau de l'ADN. Pour la banque génomique, vous prenez l'ADN faire la digestion partielle. Vous pouvez le faire, vous pouvez le faire, et ensuite vous pouvez fractionner, vous pouvez choisir la taille ou le fragment que vous voulez créer une bibliothèque.De même, pour l'ARN messager, vous extrayez l'ARN total de l'ARN total que vous pouvez isoler ou vous pouvez fractionner spécifiquement l'ARN messager, puis utiliser cet ARN messager pour généraliser la synthèse de l'ADNc. La façon typique de générer la synthèse de l'ADNc est donc, vous savez qu'un cas typique de RNAin des eucaryotes, ils ont une queue poly A et vous pouvez concevoir une amorce qui est oligodT.Cet oligo dT est une amorce inversé qui se lie à la queue poly A de tous les messagers RNAand, puis vous pouvez faire un processus de transcription inverse par lequel vous pouvez faire de l'ADN à partir de RNA.So, maintenant votre modèle est messager ARN et vous êtes en train de faire RT et ensuite il va faire de la DNA.So, c'est votre ADN, donc vous pouvez générer de l'ADN à partir de l'ARN messager, vous pouvez fractionner sur gel et vous pouvez choisir la taille de la bibliothèque que vous voulez préparer orque vous pouvez préparer toute la bibliothèque, et ensuite vous pouvez utiliser un vecteur approprié selon la taille de votre fragment ou la taille des clones que vous voulez générer, puis digest thisvecteur et do Grâce à la ligature et à la transformation, vous pouvez capturer l'ensemble des ADNc ; tous les ADNc spécifiques qui sont présents dans un tissu particulier ou dans un organe particulier ou dans un stade particulier, puis vous pouvez les cloner et les mettre sous forme de libraires différents. Maintenant, comme vous avez la bibliothèque, vous voulez identifier un gène spécifique de cette bibliothèque.Donc, il y a deux façons de le faire selon le type de bibliothèque que vous avez made.Donc, une façon de faire est l'hybridation de colonies, puis l'hybridation des plaques. La technologie sage les deux techniques sont très semblables ce que vous faites basique, vous pouvez faire de la bibliothèque ici et ce que vous pouvez faire, vous pouvez faire pousser cette colonie sur un plateau, vous pouvez faire une réplique plating.Donc, vous pouvez prendre une membrane et vous pouvez en gros reproduire ou vous pouvez faire une réplique de cette plaque particulière et ensuite vous utilisez cette lyse de la cellule de cette membrane et ensuite vous pouvez utiliser cette lyse et bakeit.So, que l'ADN qui vient de cet ADN, l'ARN tout ce qui est Si vous faites l'hybridation et la détection si c'est la colonie qui montre le signal avec votre gène A à l'aide d'une sonde contre le gène A, alors vous pouvez assumez-vous que les bactéries correspondantes ou la colonie correspondante pourraient avoir un fragment de A. Vous isolez l'ADN de l'isolat de la colonie, isolez la séquence d'ADNc et ensuite vous pouvez identifier votre gène de l'interestpour votre étude fonctionnelle.Comme je l'ai dit si le génome est séquencé, alors probablement qu'il est très facile d'isoler le gène, vous pouvez faire une amplification génique simple basée sur la PCR où vous devez concevoir des amorces spécifiques à un gène. Donc, en gros, si c'est votre gène, vous pouvez concevoir un amorceur à court terme, un amorceur à l'avant, et ensuite vous pouvez faire un amplification.Maintenant, vous pouvez cloner un gène appelé clonage de gènes, vous pouvez cloner un gène et bien que vous clonez le gène vous pouvez soit utiliser la copie génomique, soit vous pouvez faire un ADNc.La copie génomique, si vous le savez et si vous vous souvenez de votre biologie moléculaire de base, vous savez que dans le cas de génomes eucaryotes, les gènes ont des exons aussi bien que des introns.Donc, si vous utilisez l'ADN génomique comme modèle et si vous utilisez une amorce et amplifiez le gène thenyou, vous allez amplifier à la fois l'exon et l'intron ; alors que si vous faites de l'ADNc pour le makingcDNA, vous utilisez l'ARN messager à maturité et dans les ARN messagers matures tous les introns sont déjà épissés. Introns.Donc, en fonction de votre utilisation selon le besoin, vous pouvez choisir le modèle que vous utiliserez et c'est ainsi que vous pouvez identifier ou isoler un gène particulier d'intérêt.Donc, vous avez défini votre gène d'intérêt là où vous voulez, que vous voulez étudier par le biais de la génétique inverse. Maintenant, vous avez déjà isolé le gène et ensuite vous pouvez procéder à la caractérisation de la fonction que nous prendrons dans une autre classe. Une autre approche que vous pouvez adopter pour faire de multiples identifes de gènes isque la génomique basée sur la génomique. En génomique, en gros, il y a deux classes de génomique structurelle de la génomique et de la génomique fonctionnelle. En génomique structurale ce que nous faisons en gros, nous séquentions le génome entier, lorsque vous séquentiez le génome entier, vous pouvez utiliser certains des modèles de génome déjà séquencés et ensuite vous pouvez faire l'organisation génomique. Dans l'organisation du génome, vous pouvez identifier les gènes, ce qui est le Ensuite vous pouvez faire une annotation génomique où vous pouvez prédire le gène à l'aide de bioinformaticstool faisant l'analyse basée sur l'homologie, en utilisant un modèle d'autres séquences connues ou un referencegenome comme une séquence connue, puis vous pouvez prédire la fonction putative ou vous pouvez prédire le domaine ou la classe de la protéine toutes ces choses. Ensuite, une autre chose importante que nous faisons dans la génomique structurale est le séquençage EST ; EST est fondamentalement Exprimé Séquence Tag.Donc, voici ce que vous faites en gros vous pouvez déterminer les séquences partielles de certains ADNc et Vous pouvez cloner un petit fragment de la séquence de clones de l'ADNc pour identifier quels sont les gènes qui sont exprimés dans une condition.Donc, si vous regardez ce diagramme schématique, vous pouvez faire que si vous avez une séquence génomique, vous pouvez faire une découverte de gènes, comment vous pouvez faire la prédiction du gène in silico, le séquençage EST, l'ADNc de pleine longueur que vous pouvez faire comme je l'ai dit par PCR.Donc, il y a aussi d'autres méthodes, puis vous pouvez faire une annotation fonctionnelle du gène, vous pouvez faire une analyse de modèle d'expression dans la prédiction de la silice. Une autre approche génomique de ce que nous prenons est l'approche génomique fonctionnelle. Ainsi, nous avons d'abord identifié ou nous surveillons l'expression des gènes, puis nous allons pour la caractérisation des gènes, puis nous tracerons les mécanismes derrière un processus particulier. Maintenant, nous en prendrons un par un, si vous devez commencer à surveiller l'expression des gènes, puis la première chose que vous voulez voir qui est là tout gène spécifique à un organe. Il peut être un organe, il peut être un organe, il peut être un organe, il peut être des stades, il peut être tissulaire tout ce que vous voulez et ensuite vous pouvez identifier les gènes exprimés différemment ou vous serez plus intéressés si l'expression d'un gène particulier est régulée par le développement. Si le gène est exprimé partout probablement, cela pourrait ne pas être très régulé et alors nous nous intéressons plus à un gène qui est spécifiquement ou présent dans certains Alors vous pouvez étudier l'expression spécifique du tissu ; dans l'expression spécifique du tissu, vous pouvez y aller et regarder le motif d'expression dans l'organe ; dans l'organe si vous faites l'anatomie de l'organe, vous voulez voir où exactement le gène est exprimé, ce qui est expressedis plus important. Alors, comme je l'ai dit, si vous voulez étudier les stades de développement, si vous voulez étudier les stades de développement, un développement vient après le texte et ensuite ce que vous pouvez faire ici vous pouvez identifier le début d'une gene.Donc, supposons que le gène est exprimé dans une phase de développement particulière, mais il est absentin le Alors, vous pouvez identifier ce qui est le premier stade de développement où ce gène est activé ou commencer à exprimer ceci est appelé le modèle d'expression temporelle. Ensuite, nous faisons du piégeage du promoteur comment nous allons discuter dans un autre class.Donc, quelles sont les différentes façons dont nous utilisons dans la biologie du développement de la plante l'expression du gène du tomonitor comme je l'ai dit, et c'est l'ancienne façon ce que les gens ont fait était une analyse de Northern blot. Si vous regardez ceci a été fait pour certains micro-RNAs; microARN 393 et micro ARN 171 et si vous avez l'apparence de différents tissus racine, les feuilles, la tige, l'inflorescence et la silique, il était utile. Donc, la sonde a été utilisée contre ce micro-ARN et si vous regardez, elle a été testée de fond de fond de type sauvage ainsi que de l'ADN de l'ARN. Et vous pouvez clairement voir que la première chose que le micro-ARN est présent dans certains tissus, il est présent dans la feuille, il est présent dans la tige, il est présent dans l'inflorescenceet la silique, mais il est totalement absent de la racine. Donc, il s'agit de l'expression spécifique à l'organe, donc il est plus en forme de la tige, il est présent dans le système racinaire, mais il est absent dans le système racinaire, mais il est absent dans le système racinaire, puis non seulement vous regardez ces mutants. Dans le contexte de mutants, l'expression est réduced.Donc, par exemple, si vous prenez le cas de feuille, donc il est très présent en cas de fond de caractères de type sauvage, mais dans Semblable genre de choses que vous pouvez vérifier ici pour d'autres micro-RNA.Donc, la blot du Nord est utilisée ici, mais c'est comme si j'avais dit qu'auparavant, on l'utilisait lorsque les techniques de pointe n'étaient pas découvertes parce qu'elle implique un akind de l'activité radio.Alors, bien que nous ayons une autre méthode d'activité non radio, mais c'est plus genre de laboriousmethod.Donc, c'est utilisé maintenant dans des cas très spéciaux, mais ce n'est pas une sorte de routine de vérification de l'expression pattern.Maintenant, l'analyse d'expression plus rapide et plus facile à faire est la transcription inverse PCR.Donc, dans la transcription inverse PCR, vous extrayez l'ARN total, alors vous utilisez des amorces inversées qui peuvent être des oligo dT ou il peut être simplement des amorces aléatoires, et ensuite vous faites de la transcriptionelle inverse pour faire de l'ADNc et donc si vous avez extrait l'ARN total à partir d'un Alors vous pouvez voir si un gène est exprimé ou non. Par exemple, si nous regardons ce gène, il s'agit du produit PCR RT. Ainsi, si vous regardez dans différents tissus, ces geneslook sont assez stables dans presque tous les tissus comme les racines aussi bien que les feuilles, butif que vous regardez les différentes conditions. Par exemple, lorsque vous indurez avec le sel ou en induisant dans l'osmose, lorsque vous le faites. Notindéduire le niveau d'expression est presque 0.Mais quand vous induisez à un moment différent de la racine, alors vous pouvez voir que l'expression de ces gènes est en hausse que vous pouvez surveiller par RT PCR et cette PCR RT est appelée semi-quantitativeRT PCR.Donc, ici ce que nous faisons?Vous faites de l'ADNc, vous faites quelques cycles de PCR et ensuite vous preniez le produit final de la PCR et en cours d'exécution sur le gel ici. L'inconvénient ici est que vous ne savez pas après combien de cycles la PCR RT va se saturer. Donc, la méthode alternative qui est venue est quantitative RT PCR qui est morekind de fixation de colorant basé ici Syber green est très couramment utilisé et de ce que vous pouvez faire exactement, vous pouvez essentiellement contrôler le patron d'expression plus quantitativement.Et par exemple, si vous regardez ce sont les différents tissus ont été pris, ces gènes sont différents et ici vous pouvez concevoir une amorce spécifique à un gène et vous pouvez surveiller l'exprespattern de manière plus quantitative pour différents gènes dans différents conditions.Donc, c'est une autre technique très importante qui est utilisée pour cela one.Donc, nous nous arrêterons ici pour cette classe et dans la prochaine classe nous prendrons d'autres approches basées sur la génomique fonctionnale.Merci beaucoup.