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Gene Inheritance, Mapping and Complementation

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Donc, supposons que nous avons identifié ou nous avons isolé un mutant particulier qui a un défaut de développement ou un phénotype qui est de notre intérêt alors comment moveahead.Donc, la prochaine étape ce que nous faisons ou ce que nous faisons c'est que nous analysons pour la première fois la nature des mutants. Quel genre de mutants c'est, quel est son patron héréditaire?Parce que nous utilisons des validations basées sur la génétique. Il est donc très important pour nous de savoir si la mutation est héréditaire ou non, c'est la première question. Il y a des mutations qu'elles peuvent hériter de la génération suivante, mais si elles sont dans les tissus somatiques, si elles sont les mutations somatiques, elles disparaîtraient au cours de la prochaine génération, mais pour que nous comprenions plus dans le deTAIL de créer les mutants appropriés, il est important d'avoir des mutants héréditaires.Nous essayons d'identifier, si c'est héréditaire, quelle est sa structure d'héritage, est-ce que c'est le droit qui suit la loi Mendeliens?Donc, vous avez étudié dans votre cours de génétique de base que Gregor Johann Mendel a donné trois lois héritées de la façon dont un gène particulier ou des mutants génétiques sont hérités de la prochaine génération. Ainsi, si les mutants sont héréditaires d'une manière qui peut être justifiée ou qui peut être explicitée par le processus de Mendel ou par la loi mendélienne, ou s'ils ne suivent pas, l'hérédité est non mendélienne, nous nous intéresserons à l'hérédité mendélienne qui rend notre vie facile à étudier la biologie du développement des plantes.Mais si elle est héréditaire et supposons qu'elle suit le schéma de Mendel'sheritance, alors nous regardons et nous analysons ce qui est le motif de ségrégation ou ce qui est le motif de l'hérédité, est le mutant dominant dans la nature semi-dominant dans la nature ou dans la nature récessive; en premier lieu: si vous vous souvenez de la dernière classe ou si vous vous souvenez de la dernière classe, ce que nous avons découvert que dans cette technique il y a une possibilité d'avoir multisite mutation.Donc, nous aimerions aussi savoir si la mutation ou le phénotype est à cause de la mutation de l'asingle ou c'est à cause d'une mutation de l'ordre plus élevé que nous supposons le double La double mutation signifie qu'il y a une possibilité qu'il y ait deux mutants dans deux gènes indépendants ou que le résultat de ces deux mutants donne le phénotype. Et si c'est le cas, qu'est-ce qui se produit, comment ils se séparent, est-ce qu'ils ségrégent de façon indépendante?Donc, il y a une première possibilité là où il y a une mutation, mais à la fois le mutant ou le locus boththe ; les deux loci se séparent indépendamment ou ils se séparent ensemble, co-ségrégations.Donc, tout d'abord, nous aimerions exclure toute cette possibilité avec notre intérêt ormutant d'interest.Donc, pour la première chose ce que nous faisons comme je l'ai dit, les mutants si le mutant est héréditaire, alors si vous prévirez les graines des mutants et croissent à la génération suivante, dans la prochaine génération, vous obtiendrez le phénotype, mais si votre phénotype disparaît de la génération suivante, alors votre mutation est Une autre chose importante si votre mutation est héréditaire à la mode mendélienne, alors que vous attendez?Vous vous attendez à un résultat dépendant du fait de votre mutation initiale, si la mutation initiale nous laisse supposer hétérozygote. Heterozygous signifie pour chaque chromosome que nous avons une paire de chromosomes homologues. Donc, si nous supposons que c'est un gène où il y a une mutation hérée.Donc, si la mutation n'est que dans un seul allèle ou un seul locus ou dans le chromosome homologue et que la mutation n'est pas présente dans le locus correspondant d'un autre chromosome homologue, cette condition est appelée hétérozygous. Allèle, ici aussi bien qu'ici, il n'y a pas de mutation.Donc, si votre mutation est hétérozygote, alors vous pouvez aller à la génération suivante et observer le schéma de ségrégation et cela dépend de la nature de votre mutation, si elle est dominante alors vous vous attendez à un rapport particulier, si elle est semi-dominante alors vous attendez un autre rapport génotypique et phénotypique et si elle est récessive, alors vous vous attendez à une différence de rapport, ce qui serait ce rapport que nous verrons à la diapositive suivante. Mais une autre possibilité est que si elle ne suit pas le schéma de l'héritage mendélienne, quel est le schéma de l'héritage?Par exemple, si la dominance n'est pas complète ou incomplète ou s'il y a une épigénéticmutation qui n'est pas transmise ; ce qui n'est pas hérité de la prochaine génération ou des locus qui sont liés au sexe parce que le sexe lié est une différence de l'homozygosityn' est pas entièrement maintenu parce qu'un chromosome est x et que d'autres chromosomes est y ok.Donc, supposons que le mutant ou que nous serons plus intéressés ou que nous serons plus heureux d'avoir un mutant qui est Si l'hérédité mendélienne suit le schéma de hérédité mendélienne, alors quelle pourrait être la nature des mutants?Donc, la première chose est que si votre mutant est dominant et si vous avez un locipour hétérozygote, vous pouvez vous attendre à un phénotype même dans l'hétérozygouscondition, mais si votre mutation est récessive dans la nature, alors la seule perturbation de l'oneloci n'est pas suffisante pour donner le phénotype. Dans ce cas, vous devez avoir une mutation dans les deux locus génétiques et si c'est la casethen, vous verrez le phénotype.Alors, comment étudier ça?Dans la prochaine génération, supposons que votre plant mutant était hétérozygote. Et s'il est hétérozygote si votre mute si la mutation est dominante, il a déjà un phénotype, mais s'il est récessif, alors votre plante mutante n'aura pas de phénotype, butif, vous allez à la prochaine génération, vous allez obtenir du type sauvage hétérozygote et homozygouspopulation dans le rapport de 1 est à 1 et si, comme je l'ai dit, si c'est dominant, vous vous attendez à ce que ces 3 soient les mutant.Donc, votre rapport phénotypique sera 3 mutants et 1 type sauvage, mais si votre mutationest de nature récessive Alors seulement ce homozygote qui est comme 25% de la population totale va avoir le phénotype mutant. Si vous regardez le schéma de ségrégation et si vous quantirez le nombre de mutants dans la génération de thenext, vous pouvez déterminer si votre mutant est dominant ou récessif dans la nature. Une autre condition est le semi-dominant.Donc, chez un mutant semi-dominant, ce qui se produit, c'est l'hétérozygotie et l'homozygous.Maintenant, les hétérozygotes et homozygotes dans le cas d'un mutant dominant purement dominant mutantelles ont un même phénotype. Un phénotype, mais dans le cas de mutants semi-combinants, les deux hétérozygotes et homozygotes auront un phénotype, mais la gravité du phénotype sera plus en cas d'homozygote que l'hétérozygous.Donc, vous avez une gamme de phénotypes dans ce cas. Supposons que votre plante originale ou le mutant plantis homozygote. Si c'est homozygote ce qui signifie que les deux loci sont mutés, alors si les deux loci sont mutés, alors la prochaine génération si vous allez à la prochaine génération toutes les plantules vont donner le phénotype ; tous les mutants. Les mutants, qu'il soit isdominant ou récessif, n'ont pas d'importance parce que ces deux loci sont mutés, de sorte qu'ils n'ont pas de ségrégation. Donc, pour écarter la possibilité que vous devez faire une croix de dos pour générer des hétérozygous.Donc, vous allez prendre cette plante de mutant homozygote pour la plante de type sauvage et le generatea F 1 qui n'aura qu'un seul locus muté un autre locus comme type sauvage. Attends le même ratio 3 est à 1, mais ici mutant sera 1 et dominantmutant sera 3, mais s'il s'agit d'un cas semi-dominant, 1 est à 2, 1 sera de type sauvage pur absolument normal, 2 aura un phénotype, mais 1 fractionce sera plus grave que ce one.Donc, la gravité sera donc différente. Donc, regardez ici ceci est un cas de mutants.Donc, c'est un cas de type sauvage et ceci est homozygote. Si vous comparez le type sauvage et l'apparence homozygote, la sévérité phénotypique de cette plante est très petite, les feuilles sont très petites, sont très défectueuses, Mais si vous regardez la population F1 qui est fondamentalement hétérozygote, l'hétérozygous est la sévérité du phénotype est intermédiaire. Donc, c'est moins que le type sauvage, la croissance est moins que le type sauvage, mais plus de mutant.Donc, il s'agit d'une sorte de phénotype mutant semi-dominant. Donc, la prochaine chose que nous analyserais avec ce mutant est de savoir si la mutation est une mutation à un seul site ou une mutation multisite. Comment pouvons-nous faire ça?Alors, supposons que vous avez deux mutations ; l'une est un et un autre est b en généalob et vous aurez du type sauvage, puis vous avez un mutant. Supposons que le phénotype est à cause du phénotype mutant double et si vous faites ce type de croisement à la génération F1 et regardez le phenotype.Donc, c'est un type sauvage, c'est un mutant un, et regardez les plantes F1, ceci va tellan l'idée si votre mutant est dominant ou récessif. Si vos plantes F1 elles ont déjà le phénotype qui signifie que vos mutants sont dominants, si votre plante F1 n'affiche aucun Si la ségrégation des deux locus est totalement indépendante et si la mutation est due à la perturbation des deux loci à cause de la mutation des deux loci, alors vous attendez un rapport type 3 ; 9 est à 3 à 3 est à 1, le rapport phénotypique que vous obtenez toujours quand vous faites une croix dihybride ; et dans ce cas cette population la population 1 c'est la population qui sera homo doublehomozygote ; double Homozygote pour le mutant.Donc, il s'agit d'un petit ; une petite b ; petite b.So, si nous obtenons 1 sur 16 en tant que mutant dans la génération F2, ceci indique qu'il s'agit d'une aresult du double mutant les deux mutants sont de nature récessive et qu'ils ne sont pas co-ségrégatinés, c'est pourquoi nous avons ce rapport particulier, mais s'ils sont génétiquement liés, s'ils sont co-ségrégation, le rapport sera totalisé selon la force du lien ok.Donc, c'est l'analyse génétique préliminaire qu'on peut faire juste après l'identification des mutants. Identifié le mutant, vous savez quelle est la structure de sa ségrégation, maintenant la prochaine chose importante est d'identifier quels sont les locus génétiques associés à ces mutants, ce qui signifie que la cartographie des mutations cartographie le gène, comment faire?Donc, il y a deux approches en fonction de ce que le type de mutants que vous avez généré, si vous avez généré des mutations ponctuelles par exemple, par EMS, alors nous prenons normalement des approches cloningbased basées sur la carte et si vous avez généré une mutation par le biais de la mutation insertionnelle avec T-DNA ou transposon, alors vous pouvez faire le mappage des gènes par le gène tagging.So, maintenant nous allons prendre la première approche basée sur la carte cloning.Donc, ceci est fait par quelques marker.Donc, c'est très important pour vous de comprendre et ce qui se passe ici nous faisons par chromosomewalking.Donc, il y a certaines choses, donc il y a des marqueurs moléculaires. Pour une analyse rapide, nous préférons les marqueurs basés sur la PCR parce que c'est très rapide, et ensuite ce que nous faisons, nous essayons d'analyser le schéma de liaison et de ségrégation entre ces marqueurs, le marqueur moléculaire, le phénotype ok. Un marqueur très important qui est de préférence utilisé sont les marqueurs INDEL. Ces marqueurs sont produits sur le site d'insertion et de deletion.Donc, en gros, dans les marqueurs, vous pouvez avoir deux types de marqueurs ; L'un est appelé à nouveau dominantmarqueurs et un autre est codominant markers.So, co-dominant marqueur ; so, en cas de marqueur dominant ce qui arrive que ce marqueur donne un motif dans un bagage génétique particulier et qu'il ne donnera pas de bande dans un autre bagage génétique. Par exemple, si vous utilisez la PCR en fonction de la condition ou de l'origine génétique, elle donnera une bande, mais la taille des bandes sera différente. Actuellement, mais si vous ne voyez pas la bande, vous n'êtes pas sûr à 100% que l'absence de bande est réelle parce qu'il s'agit d'un marqueur, il pourrait s'agir simplement d'un problème technique du PCR.Donc, c'est pourquoi dans les marqueurs codominants vous voyez les deux bandes dans les deux conditions, mais en fonction de cette taille différente, vous pouvez dire clairement que c'est ce fond génétique, c'est ce fond génétique ok.Donc, par exemple, dans la plupart des plantes ces marqueurs ont été bien identifiés, bien établis et maintenant les gens savent si vous prenez l'exemple de l'Arabidopsis thaliana plants.Donc, c'est le chromosome numéro III d'Arabidopsis. Thaliana ce sont des variétés différentes d'Arabidopsis Columbia, Landsberg tout ce genre de C 24.Donc, une variété différente et ce que les gens ont essayé d'identifier, quels sont les marqueurs?Les marqueurs sont essentiellement les éléments génétiques qui sont différents en deux variétés.Donc, si vous regardez ça c'est Columbia, alors Columbia a été pris comme référence et si vous regardez le LER, donc, ici, si vous regardez ceci est, donc il y a une différence. Donc, Columbia a une différence différente dans les locus génétiques avec le LER et vous canopez cette région et si vous concevez-vous une amorce spécifique pour cette région, alors cette amorce permet de faire la distinction entre l'arrière-plan de Columbia ou le fond de Columbia et le type de marqueurs que vous pourriez utiliser pour identifier si une région particulière d'un chromosome de l'arrière-plan de Columbia ou de l'arrière-plan du RELMM. Par exemple, si vous regardez à cause de certaines insertions il y a une différence, donc c'est le NGA59.Donc, c'est le nom d'un marqueur dans ce cas vous avez identifié une région où il y a une différence, par exemple, dans cette région si vous comparez ceci et que c'est la base pair.Donc, c'est 110, c'est 141, donc la différence est 30 nucléotide ce qui signifie qu'en Columbiasoit il y a une suppression de 30 nucléotides dans cette région particulière ou en Ws4, cette insertion de 30 nucléotide.Donc, si vous regardez ici, alors qu'est-ce qui se passe?Si vous prenez le génome de Columbia donc, il y a une région ici et si vous prenez le génome de corresponding4 ici est une région, mais il y a une petite insertion.Donc, si vous concevez-vous une amorce ici, si vous concevez-vous une amorce ici et si vous dites l'amorce ici et ici, ce que vous allez obtenir de l'arrière-plan de Columbia?Vous allez obtenir cette taille de bande qui est 111 et de ce contexte vous êtes goingto get this.Donc, il s'agit de 111 plus cette insertion de 30 nucléotides qui est 141.Donc, si vous les prenez et si vous exécutez le gel, ce que vous pouvez vous attendre?Une autre chose importante que vous pouvez vous attendre ici, supposons que si un locus génétique n'est que Columbia, alors si vous utilisez ce marqueur, vous allez obtenir 111 paires de base. Si ces loci sont hétérozygotes un locus est Columbia et un locus est Ws et si vous utilisez ici ce que vous allez des locus Columbia, vous allez obtenir une bande de 111 à partir des loci de thisWs4 vous allez obtenir une bande de 41 et si vous avez un locus génétique qui est homozygote pour Ws4 et si vous utilisez le même apprêt que vous n'êtes que goingto pour obtenir une bande de 141 nucléotide.Donc, si vous exécutez sur la gell, vous pouvez voir clairement ce genre de motif, s'il s'agit d'un homozygouspour Columbia, alors vous allez obtenir une bande de cette taille, si elle est hétérozygote pour Columbiaand Ws4 vous allez obtenir une bande de cette taille et une bande de cette taille. Donc, ça vient d'un locus, ça vient d'un autre locus, mais si c'est homozygouspour Ws4, alors vous n'obtiendrez qu'une bande de 141 pair.Donc, ce motif de baguage et la recherche de cet ensemble d'amorces, vous pouvez distinguer clairement ce qui est les locus génétiques sur le chromosome numéro 3 ou quelque part ici où ce marqueur est located.Donc, ce marqueur par exemple est situé sur le chromosome. Si nous devons cartographier un gène, alors ce que vous pouvez faire, si nous devons cartographier un gène.Vous pouvez simplement choisir ces gènes et montrer leur association et regarder leur patternes de ségrégation avec votre mutant.Donc, ce que vous faites en gros?Supposons que j'ai une plante mutante qui est en fond de Columbia et que je sais que ce mutant est récessif en nature, il suit le motif mendélienne de ségrégation, ce qui signifie que si je prends l'hétérozygotie de ceci et va à la génération suivante dans la génération F2 je m'attends à ce que 3 soit à 1 ratio et 1 ce ratio 25 plantes de percentimes vont être mutant.Donc, si je prends cette plante et cette plante mutante et que je traverse avec le type sauvage, le mutant est Columbiabackground si je prends le fond Ws4. Et si je les croirais ce que je vais m'attendre?Dans la génération F1, je suis un hétérozygote. Heterozygous signifie que la moitié des génomes viennent de Columbia, un autre demi-groupe de génomes vient de Ws4, ce qui est hétérozygote. Et si je les autorise à s'autofécondation et à aller à la prochaine génération, il y aura une lotion de croisement sur un chromosome 1, un chromosome 2 et en gros ce qu'il y a de la fusion du genome.Donc, si vous allez à la génération suivante et passez à la génération F2, les génomes de Columbiaand Ws4 seront totalement fusibles et vous pourriez trouver une région différente de possibilityyou peut trouver un chromosome comme , vous pouvez trouver le chromosome comme this.Donc, n'importe quelle possibilité vous pouvez imaginer que vous pouvez trouver ici dans la génération F2, quelle chose nous faisons ça, alors nous prenons cette plante. Alors, supposons que j'ai pris 100 plantes d'ici à partir de la population F2 et ici aussi, donc de cette population F2. Donc, les 25 pour cent de la plante qui sera comme nous supposons qu'environ 25 plantules seront le mutant, ils montreront le phenotype.Donc, ce que cela signifie que pour ce mutant depuis que ma mutation vient de la Columbia backgroundet cette mutation est totalement absente dans le fond Ws4 ce qui signifie que dans Ces 25plants le locus où cette mutation est elle sera homozygote pour Columbia.Pourquoi ce sera homozygote pour Columbia?Étant donné qu'il a un phénotype, cela signifie qu'il s'agit d'un homozygote ; homozygote pour la mutation. Et puisque la mutation ne vient que de la Columbia, ce qui signifie que la région où il y a une mutation ne sera qu'à partir de la Columbia et qu'il n'y aura pas de région chez les Ws inthat one.Now, si vous prenez toutes ces 25 plantes mutantes avec le phénotype mutant et vérifiez le chromosome différent, supposons qu'il y a 5 chromosomes typiquement chez Arabidopsisand si je mesure un chromosome ici un marqueur ici ; un marqueur ici ; un marqueur ici ; un marqueur ici que j'utiliserai Marqueur moléculaire basé sur la PCR pour différentes régions, et supposons que mon site de mutation est quelque part ici, alors ce que je m'attends?Donc, ce locus est homozygote pour Columbia dans ces 25 plantes, je ne parle pas de 75 plantes, il pourrait y avoir quelque chose de différent, mais dans ces 25 plantes qui montrent clairement le phénotype, ce locus est homozygote pour Columbia.Maintenant, si je regarde ; donc dans ces 25 plantes, cette région sera Columbia, la butall d'une autre région peut être autre chose que par le pattern.Donc, si je regarde cette région ou si je vérifie cette région dans cette plante de 25, ce que je vais attendre?Je vais m'attendre à un patron de this.Donc, sur ces 25 plantes, 25 pour cent de cette population seront de type sauvage pour Columbia ; 25 pour cent de cette population pourrait être sauvage pour les Ws et 50 pour cent de ces plantes peuvent être hétérozygotes pour Columbia et Ws, c'est un modèle typique de modèle mendélienne. Alors, que dois-je faire?Je vérifie différentes régions du chromosome et si j'ai trouvé sur le chromosome que nous assuméons le chromosome n ° 1 tous les trois marqueurs montrent un assortiment indépendant par rapport au phénotype, s'ils donnent 1 est à 2 est à 1 rapport pour ce marqueur, ce qui signifie que ma mutation n'est pas présente dans ce chromosome. De même, vous excluez ce chromosome ; vous excluez ce chromosome ; vous excluez ce chromosome ; vous excluez ce chromosome, mais une fois que vous atteindrez ce chromosome et si votre mutation est ici, si vous recherchez ici un marqueur qui est présent ici car il est loin du site de mutation Il est encore possible qu'il y ait un croisement sur des événements ici. Mais une fois que vous commencez à bouger, on appelle la marche des chromosomes, si vous vérifiez ici que vous pourriez étouffer 1 est à 1 ségrégation pour ce marqueur dans ces 25 plantes, mais une fois que vous vous approchez de cette direction ou de cette direction, ce que vous attendez. Les Ws de type sauvage commencent à décroître, alors l'hétérozygotie ou l'homozygote Columbia va commencer à augmenter. Alors, il y aura une déviation que vous ne pouvez pas attendre 1 à 2 est à 1 et ensuite si vous comecloser ; plus proche ; plus proche et supposons que si vous regardez ce marqueur, Dans tous ces 25 pour cent il y a une possibilité que ce soit soit seulement l'hétérozygotie soit seulement homozygote pour la Columbia, puis si vous descendu, il y aura un point où toutes les plantes n'auront que Columbia genome.Donc, alors vous pourriez avoir une condition où 100% de ces 25 plantes auront homozygousColumbia et ils n'ont pas de génotype pour Ws this est appelé votre carte de carte. Donc, maintenant, nous faisons de cette direction que nous conservons sur la cartographie et nous avons trouvé qu'ici est un markerwhich qui est à 100% Columbia, voici le marqueur qui est 100% Columbia, maintenant c'est mon window.Maintenant, je sais que la mutation est quelque part dans cette fenêtre. Si vous voulez aller plus loin et affiner ce mappage, alors vous devez augmenter le nombre de plantes mutantes ce n'est pas possible avec 25 plantes, vous pouvez aller 1000 plantes plus, vous pouvez faire la cartographie fine et vous pouvez faire, mais ces jours depuis que nous sommes à l'ère post-génomique, la plupart des plantes modèles de plantes leur génome entier ont été séquencés, maintenant dans les différentes variétés de ces plantes les génomes ont été séquencés et maintenant séquencingis n'est plus très coûteux ou très consommant du temps. Et puis pourquoi nous avons fait cette cartographie rugueuse, pourquoi nous avons fait cette cartographie brute parce que toute cette plante a été exposée avec l'EMS.Donc, il y a une possibilité qu'il y ait un grand nombre de mutations ponctuelles dans le génome, mais nous devons découvrir quelle mutation est en fait responsable du phénotype, et si nous avons déjà défini cette fenêtre, alors nous ne pouvons que regarder ce qui est le mutationsin cette fenêtre et ensuite un par un vous pouvez exclure en fonction de vos connaissances si Comme vous pouvez le signaler et que vous pouvez trouver une mutation ponctuelle ou deux points mutationdans ce gène qui pourraient avoir le phénotype pertinent, alors nous pouvons passer à l'étape suivante et valider qu'en fait ce mutant est responsable du phenotype.Donc, ceci est de cartographierune mutation ponctuelle alors que le site d'insertion de l'ADN-T est relativelyeasy et a été fait de la même façon.Une façon de faire cela est appelé TAIL PCR.In TAIL PCR ce que vous faites?Comme, cette région T-DNA que vous avez conçue, vous connaissez la séquence, vous pouvez désigner des amorces pour ce T-DNA.Par exemple, SP 1 amorce, SP 2 amorce, SP 3 amorce et supposons que ceci est intégré dans le génome et que cela pourrait être le génome végétal et ensuite vous pouvez concevoir un arbitre d'amorces. Donc, ce n'est pas très spécifique ceci est plus genre de primers.Donc, il peut se lier dans un très ou vous avez une sorte de pool de primers.Donc, vous pourriez trouver une amorce qui pourrait se lier ici et cette amorce si vous exécutez primaryPCR avec SP 1 vous pouvez enrichir cette amplification, puis vous utilisez un autre amorceur. Et si vous faites une combinaison d'amorces, vous pouvez amplifier cette région, la région d'ici. Et puis vous prenez ce produit amplifié par PCR, clonez dans un vecteur comment faire du clonage vous avez étudié quelque part, prenez ce fragment de PCR et clonez dans un vecteur de clonage et maintenant si vous avez cloné dans un vecteur de clonage c'est votre fragment, dans le fragment vous avez une certaine région de l'ADN génomique de la plante et une région de T-DNA.Now, vous avez un site de liaison d'amorce ici séquence d'ici et identifier ce que le nucléotidesequence vient de la plante et ensuite vous pouvez faire, vous pouvez vérifier ceci aller à la sitevous websiteyou juste Essayer ce qui est la séquence et où c'est positionné à l'usine, vous pouvez cartographiez ce qui est le site d'insertion. Une autre façon de cartographié est le sauvetage par plasmide, ici ce que vous faites?Vous savez que si l'origine de la réplication est présente, si l'origine de la réplication est présente, alors cet ADN s'il est de nature circulaire, il peut se propager dans les bactéries qu'il peut répliquer dans la bactérie. Nous supposons que cet ADN-T est intégré dans le génome de la plante. Donc, mais assurez-vous que ce site de l'enzyme ne coupe pas dans le T-DNA.So, si vous utilisez un site de restriction, il pourrait venir ici ; ici ; ici ; ici, n'importe où dans le génome de la plante et ensuite quand il digest l'utilisation de ce fragment et que vous pouvez réligate it.Donc, la ligature va générer un tel type de Il s'agit d'une sorte de votre plasmide que vous transformez en bactéries E. coli bactéries et dans des bactéries qu'il peut propager, extraire le plasmide et séquencer à l'aide d'amorces spécifiques à l'ADN-T et ensuite vous pouvez identifier les séquences qui flanquant l'ADN-T et vous pouvez identifier le locus ofintegration. La troisième façon d'identifier le site d'insertion est inverse PCR.In inverse PCR ce que vous faites?En gros, vous choisissez un site de restriction de site qui coupe au moins une fois dans le T-DNA et thensomewhere dans la DNA.Lorsque vous direz que vous connaissez la séquence où elle a été coupée, vous avez conçu un apprêt spécifique au T-DNA qui est spécifique à cette région, puis vous religateit; vous avez une amorce positionnée ici ; vous avez une amorce positionnée ici ; vous avez une amorce positionnée ici faire le PCR.Et ceci va amplifier cette région et cloner cette région dans un clone particulier vectorséquer les séquences et identifier ce qui est la séquence d'accompagnement dans le T-DNA.Dans une autre technique que nous sommes En utilisant pour cartographierle site d'une insertion est adaptor PCR.Adaptor PCR est tout à fait similaire, mais ce que nous faisons que vous digez avec la restriction enzymeet puis en fin de ce que vous faites remplir cette fin en fonction du type d'enzyme que vous utilisez, vous utilisez l'enzyme de fin blunt, l'enzyme collante, mais aussi ce que vous faites?Vous ajoutez des molécules d'adaptateur aux deux extrémités de ces molécules. Et lorsque vous ajoutez ces molécules d'adaptateur depuis que vous connaissez la séquence de l'adaptateur que vous pouvez havea spécifique à la séquence de l'adaptateur, vous connaissez la séquence T-ADN, vous pouvez désigner un autre ensemble d'amorces et vous pouvez faire l'amplification par PCR, prendre ce fragment, cloner et séquence.Donc, vous pouvez identifier la séquence qui est et dépend de ce que vous pouvez positionit dans le génome ; dans le génome de la plante. Database.Now, simplement basé sur votre phénotype mutant ou si vous voulez identifier les gènes ou si vous connaissez les gènes que vous voulez identifier le phénotype, vous n'avez qu'à commander ces mutants et si vous commandez les mutants vous savez qu'il y a une mutation et vous savez qu'il y a une insertion d'ADN, vous pouvez tout simplement aller et faire le génotypage et valider qu'il y a une insertion.Donc, ce que vous faites pour faire ça?Alors, supposons que c'est le gène de l'intérêt et que vous savez le site d'insertion becausethis est déjà établi, séquencé, cartographié, tout est done.Maintenant, vous concevez-vous une amorce dans le gène, l'amorce et l'amorce inverse juste à l'extérieur de la région d'accompagnement de l'ADN-T et si vous faites la combinationde PCR.So, un PCR que vous utilisez à l'aide d'amorces spécifiques à un gène et d'une autre PCR vous doutant de l'amorce spécifique de l'ADN-T, soit en fonction de l'orientation ou de ce qui est en fonction de l'orientation, soit de l'orientation de cet ADN-T. Alors vous aimeriez utiliser ce jeu d'amorce avec l'amplification, si c'est en sens inverse dans cette orientation, alors votre position d'amorce va changer et ensuite vous voulez vérifier avec ceci, mais ce qui est importanlà-bas. Donc ce groupe, vous n'obtiendrez que si votre copie génomique est de type sauvage et il n'y a pas d'insertion et cette bande que vous allez obtenir seulement s'il y a une insertion de T-DNA vous ne vous obtiendrez pas sur le génome de type sauvage.