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Module 1: Adsorption des protéines

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Vidéo:

Bonjour tout le monde, bienvenue à une autre conférence pour l'ingénierie et les principes de la distribution de médicaments. Juste une récapitulation rapide de ce que nous avons appris dans la dernière classe.
(Reportez-vous à l'heure de la diapositive: 00:37)

Donc, on parlait de l'adsorption des protéines-pourquoi nous le faisons c'est parce que nous voulons comprendre ce qui se passe lorsque vous mettez des matières étrangères dans le corps ou en contact avec n'importe quelle sorte de liquide corporel. Disons si c'est mon corps que je mets, et la première chose va entrer en contact avec, bien sûr, le fluide et la majeure partie du fluide dans notre corps n'est essentiellement rien, mais l'eau et ensuite le prochain composant majeur, c'est les protéines.
Ainsi, toutes les protéines présentes dans un fluide vont commencer à interagir avec cette surface particulière et ensuite, selon la façon dont la surface est-qu'elle soit hydrophobe ou hydrophile, ces protéines auront alors tendance à s'adsorber sur différentes zones et une conformation différente sur cette surface et seulement alors les cellules qui se trouvent à nouveau dans le voisinage se présenteront et elles commenceront à interagir avec la surface à travers ces protéines adsorbées.

Donc, les cellules ne voient vraiment pas très bien la surface. Ce qu'ils voient est en fait la couche protéique adsorbée à travers laquelle ils vont commencer à interagir.
Donc, c'est pourquoi il devient très important parce que ce que la cellule voit n'est en fait rien, mais la protéine absorbée. Donc, nous devons étudier ce qu'est réellement cette protéine d'absorption et comment elle peut être modulée pour obtenir cette fonction désirée. Alors nous avons parlé dans le processus de compréhension de ce que l'absorption des protéines est d'abord ce qu'une surface? Alors, qu'est-ce qui définit une surface? Comment savons-nous qu'il s'agit d'une surface, il s'agit d'une interface entre les deux moyens qui lui ont été présentés. Nous avons parlé de ce qui est des agents de surface.
Alors, encore une fois ce qu'il y a de surfactant? Les surfactants ne sont rien, mais les molécules qui ont à la fois des domaines hydrophiles et hydrophobes et ils peuvent éliminer les domaines hydrophiles et hydrophobes et, pour l'essentiel, disons que si je dis que c'est du pétrole, c'est de l'eau, ces surfactants aligneront essentiellement cette interface avec le domaine hydrophobe allant vers la phase d'huile et le domaine hydrophile allant vers la phase aqueuse.
Encore une fois, cela devient important parce que ce que nous disons est que les protéines sont des surfactants doux parce qu'ils contiennent plusieurs acides aminés sur presque toutes les protéines avec de grandes structures auront environ 20 acides aminés, les 20 acides aminés. Et puis ces 20 acides aminés sont hydrophiles, certains sont hydrophobes, même dans la structure de l'acide aminé, il y a des domaines hydrophiles et hydrophobes et parce que ces protéines agissent comme des surfactants doux et que leur structure changera en fonction de ce qu'ils sont. Donc, s'ils trouvent des domaines hydrophobes ou des surfaces hydrophobes, ce qui va se passer, c'est que les domaines hydrophobes vont commencer à sortir et interagir avec ces surfaces hydrophobes.
C'est pourquoi nous avons étudié les surfactants. Puis nous avons parlé du repliement des protéines qui est encore une chose très apparante. Donc, en processus naturel, disons que si nous parlons dans des cellules qui n'est rien, mais un milieu aqueux. Disons que c'est la protéine dépliée. Donc, le repliement des protéines sera de telle façon que tous ces domaines externes seront hydrophiles et la raison en est que ces domaines externes devront interagir avec l'eau qui est présente dans les environs.
Donc, ils aiment interagir avec l'eau. Donc, c'est pourquoi tous ces domaines hydrophiles vont sortir et alors tout ce domaine intérieur sera hydrophobe et à nouveau la même raison que ces domaines ne veulent pas vraiment interagir avec l'eau qui est présente à l'extérieur.
Donc, ils veulent s'enterrer et empêcher toute sorte d'interaction avec l'eau à l'extérieur. Donc, c'est pourquoi le repliement des protéines devient important parce que maintenant ce que nous disons c'est quand ces protéines particulières commencent soudainement à voir une surface hydrophobe, ces domaines auront tendance à sortir et alors ces domaines auront tendance à disparaître et c'est pourquoi le repliement des protéines va changer.
C'est pourquoi nous avons étudié le repliement des protéines. Juste en très brefs termes, je veux dire que le repliement des protéines est lui-même un phénomène très complexe dans tout un cours, mais ce dont nous avons parlé n'est que quelques concepts généraux de la façon dont ces protéines vont se plier.
(Référez-vous à la diapositive: 05:06)

Donc, après avoir fait tout cela et avoir établi que ces surfaces peuvent moduler le repliement des protéines et l'adsorption des protéines, un autre concept qui est maintenant utilisé dans le domaine beaucoup est la pré-adsorption de ces protéines sur les surfaces et pourquoi vous devez faire ça? Alors, disons que si j'ai une surface et que je veux que cette surface signe les cellules d'une certaine façon. Donc, je veux dire si j'ai une cellule qui va interagir avec elle et je veux que cette surface particulière interagisse avec le ligand cellulaire, x.

Donc, pour que cela se produise, je veux m'assurer que toutes les protéines enrobées à la surface ont une certaine affinité pour ce ligand x ou ce récepteur x. Donc, c'est un récepteur et disons que je mets quelques ligands sur la surface.
Donc, je vais peut-être mettre des ligands, mais pour l'essentiel je veux que cette surface interagisse avec les cellules à travers ce x. Donc, une des stratégies que l'on utilise pour cela est de pré-adsorber des protéines que nous savons va interagir avec ce récepteur x et c'est une façon que je peux contrôler la signalisation qui va se passer à travers la surface. Voir la raison de cela, parce qu'une fois que je l'ai mis dans le corps ou une fois que je l'ai mis en contact avec le liquide du corps il y a toutes sortes de protéines dans le liquide du corps, je veux dire que nous parlons de milliers et de milliers d'entre eux et donc la probabilité qui nous laisse dire une certaine protéine va venir et s'adsorber à elle est relativement faible.
Donc, pour éviter ce que nous faisons c'est d'abord la traiter avec une solution qui ne contient que ce ligand L et qui fera en sorte qu'au moins une partie du ligand L reste sur la surface et puisse interagir avec la cellule. Donc, certaines des protéines qui sont très largement utilisées sont la fibronectine, le fibrinogène, la vitronectine et ces protéines ne sont rien, mais ce sont des protéines qui contiennent des sites adhésifs.
Et si j'ai intubé mon biomatériau avec ces protéines pendant un certain temps, ce qui va se passer est que ces protéines recouvront la surface complètement et ensuite je peux mettre cet implant avec des cellules ou dans le corps. Et ces protéines pourraient encore s'éteindre et elles allaient en parler dans les prochaines diapos, mais cela augmente la probabilité qu'une de ces protéines commence à interagir avec ce récepteur cellulaire x et donne la signalisation que je veux que cette surface donne.

(Référez-vous à la diapositive: 07:33)

Donc, alors que le pré-adsorbant avec un adhésif non-cellulaire il peut aussi être utilisé. Alors, disons si je veux mettre un implant que je ne veux pas vraiment interagir avec la cellule. Disons que j'ai un implant qui porte un médicament D et tout ce que je veux faire de cet implant c'est pour qu'il libère constamment le médicament et qu'il n'ait aucune sorte de protéines inconnues venir et absorbant rendre une couche qui cause cette diffusion du médicament difficile à partir de cet implant. Donc, nous savons que les protéines s'adsorberont sur nous, nous ne pouvons pas l'éviter. Alors, pourquoi ne pas nous laisser absorber quelque chose qui n'interagit pas avec les cellules.
Alors, dis-nous si j'ai directement implanté ce qui va se passer? Toutes sortes de protéines aléatoires vont venir et s'adsorber essentiellement sur la surface et une fois qu'elles le font, je ne suis pas sûr que ce signal à la cellule, qu'il provoque une couche de cellules massives sur la surface, puis qui peut à nouveau conduire à une cascade d'événements qui peuvent interagir avec une autre cellule et faire une grosse couche.
Donc, c'est la dernière chose que je veux si je veux que le médicament D soit libéré dans le système parce que maintenant ce qui se passe n'est pas seulement le médicament doit se diffuser à partir d'une matrice, mais maintenant il doit diffuser à travers cette couche de protéines et à travers de multiples couches de cellules qui va être très difficile et c'est quelque chose que je ne peux pas contrôler. Parce que j'ai initialement conçu cela nous disons de libérer x milligramme par minute ou quelque chose, mais maintenant une fois que ce type de couche de cellules et de couche de protéines a été formé, je ne sais pas s'il va libérer x milligramme par minute peut-être qu'il va descendre à X par 2, peut-être est-il x par 4.
Donc, en tant que clinicien, je suis très inquiet maintenant parce que je ne sais pas combien de doses je donne. Donc, pour éviter que ce que vous pouvez faire, vous pouvez essentiellement l'enduit d'une protéine connue que vous savez ne va pas interagir avec les cellules. Donc, même si vous avez une couche de protéines maintenant, ce que vous faites, c'est empêcher les cellules d'entrer et d'y être adsorbés. Donc, de cette façon au moins je sais que ce qui est la diffusion de ce médicament de cette matrice à travers cette couche protéique et de cette façon, j'ai une bonne idée de la quantité de drogue libérée par unité de temps ou par jour ou de tout ce qu'elle pourrait être.

Donc, c'est une application que je vous donne il pourrait y avoir plusieurs autres applications-peut-être que l'implant est tel que nous ne voulons pas que les cellules immunitaires interagissent, peut-être qu'il porte des cellules à l'intérieur et nous ne voulons pas que les cellules immunitaires entrent et sorte de tuer ces cellules. Donc, ce sont plusieurs applications que vous pouvez imaginer dans cette direction, puis plusieurs autres stratégies à l'exception des protéines pré-adsorbantes et tout cela dont nous allons parler dans les classes futures dans ce cours, mais ce n'est qu'un exemple que je vous donne.
Donc, ce sont des choses que vous pouvez jouer avec la protéine l'adsorption elle-même pour obtenir le résultat souhaité. Et ensuite, c'est que souvent tu devrais définir la signalisation du matériel in vivo aussi. Donc, vous pouvez empêcher l'adsorption de protéines non spécifiques. Donc, une chose est d'empêcher la cellule et une autre chose est d'empêcher tout type de protéine d'y adsorber.
Alors, disons que si certaines enzymes absorbent sur mes surfaces et qu'elles commencent à dégrader ces surfaces, ou qu'elles commencent à dégrader le médicament lui-même. Donc, encore une fois, vous pouvez contrôler cela en préadsorbant sous les protéines et cela peut quelque peu retarder ou au moins supprimer complètement tout ce processus de se produire.

(Référez-vous à la diapositive: 11:15)

Alors, parlons de la cinétique de l'adsorption des protéines. Donc, j'ai d'abord dit dans l'introduction de cette classe que la première chose que l'implant va interagir avec est l'eau parce que c'est le fluide le plus abondant autour et que le suivant va être des protéines et que les cellules vont interagir avec cette protéine. Alors, pourquoi et alors la raison de cela est que l'adsorption des protéines est un phénomène très rapide. Donc, la seule chose qui limite l'adsorption des protéines est la diffusion de la protéine du fluide à la surface de votre implant. Donc, ce qui signifie essentiellement, c'est que si je mets un implant et que je regarde l'implant après quelques secondes ou quelques minutes qu'implant à ce point, je crois, serait complètement enduit de vos protéines qui sont présentes dans les médias environnants.
Alors, disons que c'est votre milieu environnant, vous avez des protéines. La seule limitation de l'adsorption des protéines est essentiellement la diffusion de cette protéine pour atteindre la surface. Une fois qu'il atteint la surface, nous parlons de moins de millisecondes pour que ces protéines soient adsorbés sur la surface. Et puis ce qui va se passer est une fois que les protéines sont arrivées et adsorbées, la couche initiale de la protéine, puis nous disons qu'une autre protéine essaye de venir-cette protéine n'a pas d'espace pour interagir directement avec cette surface particulière, elle peut commencer à interagir avec les protéines qui sont enrobées à la surface parce que ces protéines peuvent aussi avoir des domaines qui sont maintenant exposés qui n'étaient pas présents plus tôt, mais cette protéine particulière qui arrive en retard ou la phase plus lente devra soit enlever ces protéines de la surface, soit ne pas pouvoir interagir directement avec la surface. Et nous aurons à interagir avec la couche déjà enduit. Donc, ils trouveront l'emplacement vide peut-être ces protéines sont grandes et il y a une petite protéine qui peut se diffuser dans ces fentes vides.
Donc, ceux qui seront en mesure d'entrer, mais finalement toute la surface seront couverts assez rapidement et il sera très difficile pour toute nouvelle protéine de venir interagir avec elle.
(Référez-vous à la diapositive: 13:29)

Donc, il y a plusieurs modèles qui sont utilisés pour l'étude de cette adsorption de protéine. Donc, on est un modèle monocouche qui est un modèle assez simple et ce qu'il suppose avec l'adsorption des protéines est limité à une monocouche. Donc, ce qu'il dit est, disons, c'est-si j'ai une surface. Donc, ce que ce modèle de monocouche suppose est de dire s'il y a des protéines dans le voisinage ces protéines s'adsorberont sur la surface et s'il y a une autre protéine qui doit venir nous laisser dire que j'ai une autre protéine qui veut venir et s'adsorber sur la surface, elle ne peut venir et s'adsorber sur la surface.
Donc, ce n'est pas et la seule chose qui peut arriver c'est qu'il y arrive, enlève l'une des unités protéiques, puis va et commence à interagir avec cet espace vide qui est créé. Donc, c'est un modèle monocouche simple et si vous allez par là ce que vous dites, c'est que vous nous avez laissé dire qu'une certaine concentration de protéines était adsorbée. Donc, au fur et à mesure que vous augmentez la concentration protéique, la quantité de protéines adsorbées va augmenter et nous en parlerons pour expliquer pourquoi cela va augmenter et pourquoi cela ne sera pas constant et ne portera que sur moi pour quelques diapositives.
(Heure de la diapositive: 14:58)

Ensuite, il y a un autre concept qui est des protéines dures et molles. Donc, ce que cela signifie, c'est-à-dire que certaines protéines pourraient être assez dures, ce qui signifie qu'elles ne sont pas très flexibles. Donc, certains de ces exemples sont donnés ici ribonucléase, lysozyme et autres protéines, ils sont considérés comme très durs. Donc, ils ont une stabilité interne très élevée, ce qui signifie qu'ils ne changeront pas vraiment la structure tout un lot ils continueront d'interagir avec votre surface, mais la structure de la protéine va encore rester et il ne va vraiment pas changer beaucoup de ce que la structure initiale était. Et puis l'autre est la protéine douce et qui, comme son nom l'indique, n'est rien, mais leur très faible stabilité interne qui signifie que s'ils trouvent une nouvelle surface, la structure peut changer beaucoup en fonction de la contribution de l'hydrophobicité et de l'hydrophilicité de surface.
Donc, certains de ces exemples sont IgG, la bêta-caséine, l'hémoglobine et plusieurs autres exemples en fait la plupart des protéines seront des protéines molles et leurs structures vont facilement changer.

(Heure de la diapositive: 16:01)

Donc, la prochaine chose dont je parlais au départ était cette orientation protéique et ce qui est essentiellement, ça veut dire, c'est là quelques exemples ici. Donc, vous pouvez avoir une protéine globulaire qui signifie essentiellement une sorte d'une grosse protéine de grande taille avec une structure sphérique qui vient et il y a un changement dans la structure de ceci comme vous pouvez voir ces sphères sont maintenant plus comme ellipse et elle couche sur une surface que l'autre modèle pourrait être-selon la concentration que vous avez utilisée, disons que cette protéine de forme elliptique vient dans vous peut avoir une configuration où très peu de protéine comme adsorbé, mais couvre toujours la surface par rapport à une orientation où beaucoup de protéines ont adsorbé et sur la surface. Donc, ce que vous trouvez généralement dans la littérature est et pendant les expériences c'est que cela continue à varier en fonction de la concentration que vous utilisez.
Alors, disons que si j'ai une surface et que je viens avec un microgramme par ml de concentration d'une protéine et donc ce qui va se passer, c'est parce que je parle de très faibles concentrations de protéines dans la solution, c'est une sorte de limitation de diffusion quant à la quantité de protéines qui peut entrer et s'adsorber sur la surface. Ce que vous trouverez, c'est que j'ai une protéine qui a cette structure 8. Donc, il arrivera qu'il va commencer à interagir avec lui et ce qui se passera avec le temps, c'est qu'il va commencer à s'étendre sur lui parce qu'il peut trouver plus d'espace. Donc, cette structure 8 est allongée et allongée.
La structure a donc changé un peu plus une seule protéine occupe un espace assez grand. Maintenant, considérons un cas avec le même exemple où, au lieu de 1 microgramme par ml, je viens avec 100 microgrammes par ml, maintenant sur cette surface particulière. Donc, maintenant, ce qui va se passer maintenant, j'ai beaucoup plus de concentration de protéines dans les environs. La fusion ne sera donc pas aussi limitée. Donc, les protéines vont arriver assez rapidement.
Alors, disons qu'une protéine est adsorbée. Il est capable de changer la surface un peu parce qu'il a encore un peu plus d'espace auquel il peut absorber, mais au moment où il va à cette configuration, tout le reste des sites sont occupés parce qu'il y a une très forte concentration de protéines présentes dans le voisinage. Donc, tous viennent et occupent essentiellement la surface. Il ne peut vraiment pas s'étendre à quelque chose comme cet état qui n'est pas en train de se produire et la même chose se produira si je vais à une concentration encore plus élevée.
Donc, ce que vous trouverez non seulement l'adsorption des protéines dépend du type de protéines présentes dans le milieu, elle dépend aussi de la concentration, parce que la concentration peut modifier l'orientation de l'orientation des protéines ainsi que la structure de la protéine. Donc, si vous regardez cette structure, c'est différent de la structure qui est ici, même si vous utilisez la même protéine pour commencer avec, mais à différentes concentrations. Et maintenant si je retourne à deux diapos plus tôt ce que je disais. Alors, disons que si j'ai maintenant une protéine à une concentration de 0,5 mg par ml.
Donc, la quantité de protéine qui va absorber sera différente de nous laisser dire à 2 mg par ml ou 3 mg par ml et la raison de cela est que les protéines qui viennent s'adsorber sur la surface ont le temps de changer leur orientation et d'occuper encore plus d'espace.
Donc, vous aurez un scénario où ce que vous obtiendrez est essentiellement à des concentrations plus faibles, vous avez une petite protéine à la surface, alors que, à une concentration plus élevée, vous avez peut-être un peu de protéine qui se fait adsorbée parce qu'il y a assez de protéines dans le voisinage et qu'il n'y a pas assez de temps pour que la protéine change d'orientation.
Donc, c'est pour ça que vous voyez une courbe comme celle-ci, même si c'est la même protéine, le fibrinogène, qui a été donné à la surface, mais en fonction de la concentration initiale vous obtenez ce genre d'augmentation et une fois que vous avez atteint une concentration de saturation où la diffusion n'est plus une limitation, il y a assez de molécules dans le voisinage qui satureront complètement la surface, alors ça n'a pas d'importance. Donc, dans ce cas particulier, il est montré qu'il y en a plus à environ 2 mg par ml qui vont à la différence pour chaque protéine avec laquelle vous manipulez, mais toutes les protéines montreront typiquement une structure comme celle-ci et ceci bien sûr, c'est une supposition avec un modèle monocouche et nous parlerons également d'autres modèles dans ce cas.
(Référez-vous à la diapositive: 21:04)

Alors, qu'en est-il de l'effet de la mouillabilité? Donc, les tendances générales si vous présurez ce modèle sur l'adsorption des protéines, c'est que les protéines s'adsorberont fortement et fortement sur les surfaces hydrophobes et c'est très évident. Parce que si j'ai une surface assez hydrophobe, alors les protéines peuvent changer la structure un peu sur ça.

Disons que c'est une protéine qui est venue et a commencé à interagir et il y a beaucoup d'interactions de van-der waals qui vont se produire entre la protéine et la surface et il n'y a vraiment pas de force concurrente pour cette surface hydrophobe parce que partout dans le milieu, le fluide contient de l'eau et c'est hydrophile.
Donc, ces domaines hydrophobes seront très heureux d'interagir avec cette surface hydrophobe et ils ne veulent pas vraiment changer quelque soit la structure parce que le milieu est hydrophile. En général, ce qui est observé, c'est l'interaction très étroite et très étroite des protéines avec les surfaces hydrophobes. La conformation et l'étendue de la dénaturation dépendront également de la mouillabilité de l'eau, tout d'abord, si la protéine est molle ou dure.
Donc, typiquement les protéines dures ne changeront pas la structure, les protéines molles vont changer la structure, mais assez un peu, puis plus hydrophobe est la surface plus le changement de structure et ensuite la raison est très similaire parce que plus tôt les protéines étaient situées dans l'eau et tout ce sont des domaines hydrophiles étaient à l'extérieur alors que, pour interagir avec la surface hydrophobe, leur structure a presque à aller à une refonte complète où tous les domaines hydrophobes intérieurs vont sortir et commencer à extraire l'interaction avec la surface.
Donc, vous verrez que c'est un peu de changement qui se produira dans cette structure. Et là encore, comme je l'ai dit, il est très énergétiquement favorable pour eux de déplacer l'eau du point de vue de surface aussi bien la surface ne veut pas vraiment interagir avec l'eau. Donc, la surface est aussi très heureuse quand elle vient en contact avec ces domaines hydrophobes. Donc, nous nous arrêterons ici dans cette conférence et nous continuerons dans la prochaine classe.