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Donc, nous avons discuté des différentes cellules de la transformation génétique des cellules végétales, quelles sont les différentes façons dont les cellules végétales peuvent être transformées.Donc, nous avons parlé de ce que les cellules végétales peuvent être transformées. Les Agrobactériums eux-mêmes sont des ingénieurs naturels à trans, ils ont la machinerie pour transformer les cellules végétales à travers une section d'ADN qui est présente dans l'ADN plasmidique qui est appelée T-DNA qui se trouve humblement intégrated.Donc, la façon dont nous avons exploité est que l'ADN-T inhérent à l'ADN-T présent dans le Agrobacterium qui est enlevé, et d'autres vecteurs comme ceux qui ont ce segment de T-DNA,a que l'agrobactérie a la machinerie pour intégrer ce vecteur plasmidique qui a été ajouté de façon exogène à l'agrobactérie pour s'intégrer dans les cellules de la plante. Donc, maintenant quels sont les différents types de vecteurs dont nous avons discuté la dernière fois, les vecteurs les plus couramment utilisés sont des vecteurs binaires. Maintenant, les vecteurs binaires qui sont appelés origine binaire des réplications, ils peuvent se reproduire chez E. coli ainsi que dans l'agrosbactéries. Je parlais aussi d'autres vecteurs qui peuvent être utilisés pour la transformation génétique dans les cellules végétales. Ce sont des vecteurs intermédiaires, comme par exemple le pBR3, deux fois, vous entendrez si vous travaillez dans ce domaine. Ce sont des vecteurs plus petits dans E. coli a, qui contient l'ADN-T et ils sont utilisés pour surmonter les problèmes en raison de la grande taille du plasmide Ti Ti. Donc, comme je disais qu'il y a un plasmide d'auxiliaire présent dans l'agrosbibacterium qui est disarmed.Maintenant, il est appelé le plasmide d'helper, qui aura une virulence Maintenant, ce petit plasmide peut se multiplier dans les E. coli I, puis par le transfert conjugal peut être apporté dans l'agrobactérium.Maintenant, ces plasmides ne peuvent se multiplier, mais ils peuvent être transformé­ils peuvent être utilisés pour transformer les cellules de la plante. Maintenant, co-intégrative, parfois ce qui arrive à cause de la recombination.Maintenant, dans l'agrobactérie, certaines régions de l'ADN-T qui ont été désarmées, mais les autres régions s'il y a une homologie s'il y a une similitude entre ce composant d'ADN et l'ADN qui est présent dans ces vecteurs, alors La transformation aurait lieu, la recombinationaurait lieu, et il y aura un matériel génétique d'échange, un échange de matériel génétique. Et ce T-DNA où votre région MCS est là, où cela s'intègre dans le plasmide unique entireone qui peut alors agir comme un plasmide complet de Ti pour que la transformation se produise dans les cellules végétales, alors il est appelé comme plasmide co-intégrateur. Ensuite, les vecteurs d'aide, les vecteurs d'aide, soit vous avez votre plasmide Ti inhérent qui a été désarmé, désarmé signifie que les régions oncogènes ont été l'ADN-T a été prise. Donc, ou vous avez des plasmides séparés qui aident dans l'événement de transformation qui isthey aura des régions qui sont des régions de transfert qui aideront dans le transport de ce T-DNA de vos petits vectors.Maintenant, ce sont de petits plasmides maintenus dans E. coli, ce sont des plasmides d'aide pour E. coli au transfert de transformation d'E. coli. Ils contiennent des régions de transfert et des régions de mobilisation, ce qui permet le transfert des vecteurs intermédiaires déficientes en conjugaison dans l'agro-alimentaire. Supposons que s'il y a conjugaison qui est absente, tous les vecteurs ne sont pas des vecteurs conjugaux. Donc, si la conjugaison est absente, alors vous avez besoin d'un plasmide auxiliaire qui peut vous aider dans le transfert de ces vecteurs dans l'agrobactérium.Donc, c'est ce que j'ai dit des vecteurs intégratifs où la recombinaison homologue entireone du plasmide co-intégratif à l'intérieur de l'agrobactérie peut être obtenu.Maintenant, quelles sont les différentes techniques de transformation, soit ce que l'on sait utiliser dans les laboratoires est la technique de co-culture l'une est que, et l'autre est directtechniques dans la transformation de planta. Cultures in vitro et à partir des cultures in vitro la régénération est faite pour l'obtention de la plante transformée; sinon, directement les parties de plantes peuvent elles-mêmes se transformer en graines transformées ou en zygote [ ot/ou ]-ou au moment de la floralpollinisation, juste avant la pollinisation lorsque les fleurs sont issues d'une méthode de trempette de fleurs ou de la méthode de floralpendage par laquelle l'agrobactérie peut se rendre dans la plante, et après la pollinisation peut transformer le zygote, de ce fait dans la descendance, vous verrez la transformation. Nous utilisons l'agrobactérie comme un outil de transfert ou d'indirectgene de méthodes de transfert, par exemple, le fusil à gène qui est, je pense, vous devez avoir du cœur. Et il y a d'autres méthodes que nous allons chercher. Donc, les méthodes médiées par l'agrobactérie, ce qui est fait sont les prérequis pour le transfert de gènes d'origine agrobactérien, il implique les explants, les explants doivent produire de l'acétosyringone. Qu'est-ce que l'acétosyringone?. Donc, l'acétosyringone, donc le type d'explants, l'âge de l'explant arrive aussi parfois pour les transformations.Donc, il faut produire ces molécules de signalisation qui peuvent attirer l'agrobactériumet la réduction de la proximité entre l'agrobactérie et les cellules végétales. Maintenant, l'explant doit produire de l'acétosyringone ou d'autres composés actifs autres composés phénoliques pour induire les gènes de virulence, puis l'agrosbactéries doit avoir accès aux cellules qui sont compétentes pour Parfois elle est observée bien que la transformation soit faite, mais la régénération ne se produit pas. Pour que la régénération se produise, il faut des cellules compétentes pour la transformation, puis le totipotencyto doit être maintenu dans les cellules transformées de façon à atteindre l'usine de régénération, ce qui est une tâche difficile qui n'est pas facile.Donc, maintenant pour l'agrobactérie, la transformation réussie de l'accès aux cellules compétentes est nécessaire, toutes les cellules ne seront pas compétentes dans la nature. Parfois, vous verrez que la même méthode, mais vous ne répérez que certains d'entre eux sont réussis, les autres ne peuvent pas à cause de toutes ces régions, toutes les cellules du thalle ne seront pas de la même nature biochimique. Ensuite, les explants utilisés pour la transformation thetype d'explant l'âge des explants.Maintenant, on préfère généralement qu'ils se divisent activement quand la transformation doit être done.Pourquoi, les jeunes explants sont préférés, pas vieux, pourquoi pensez-vous?. Même pour la transformation, la régénération est l'étape de l'économie. Pour réussir la transformation, il est préférable de travailler avec des jeunes qui se divisent rapidement si vous travaillez avec des cultures cellulaires. Alors, mais laissez-nous .. Faisons une comparaison entre la suspension de cellophane mûri et la paroi cellulaire secondaire lorsque l'organogenèse et elle est dans le tissu présent n'est pas .. Il peut y avoir une probabilité élevée de ce que else.Donc, les cellules mûres sont là une différence majeure entre les cellules mûres andimmaturité. L'Ifyou se rappelle que j'ai dit dans les classes précédentes que les cellules plus jeunes les vacuolesprésentes sont petites, le cytoplasme est plus dense, donc la probabilité est plus élevée. Dans les cellules matures, les vacuoles deviennent grandes le cytoplasme est moins dense.Donc, le plus dense est le cytoplasme plus élevé est la probabilité de transformation. Ainsi, et les moreovervacuoles contiennent des enzymes qui peuvent dégrader rapidement l'ADN extracellulaire. Dans la littérature, vous findrez les cellules qui sont utilisées ou les tissus utilisés varient de callus, toutes sortes de cultures in vitro peuvent être transformées, les callus, les cellules de suspension, les protoplastes, puis les tissus entiers de l'organe entier, de sorte que s'il y a un large range.Maintenant, après que les explants ont été co-cultivés avec l'agrobactérie, comment on peut détecter que les cellules de ce type ont été transformées avec succès ou non. Le milieu de sélection d'un antibiotique ou d'un antibiotique peut être utilisé pour augmenter la probabilité que les cellules transformées avec succès se transforment avec succès en sous-cultures. A l'exception du marqueur ou de l'agent sélectif, l'agrobactérie inhibant la croissance inhibitingcomposés d'autres antibiotiques comme le pluviolessivat salin de carbone est une serviette sensible. Pourquoi pensez-vous et quand est-ce que c'est utilisé ou quand il doit être utilisé?Pour la transformation, que faites-vous, vous amenez l'agrosbactérie en contact étroit avec les cellules, mais en fin de compte, que voulez-vous transformer les cellules végétales, vous ne pouvez pas garder l'agrobactérie en croissance parce qu'elle croira à la suite de la croissance qui, par la suite, entraînera la viabilité des cellules et de la croissance. Ainsi, après une transformation réussie, il faut retirer la culture successive de l'agrobactérium; après 48 heures, en général 48 heures, la chronologie de l'exposition à l'agrobactérie, et ensuite elle est maintenue à la concentration élevée de solution saline ou de tout antibiotique où Agrobactériumis sensible à. Ainsi, par la suite, avec une réduction de la concentration de l'antibiotique, l'antibiotique est retiré du milieu, parce que l'antibiotique peut être inhibiteur de la croissance des cellules végétales que vous n'aimeriez pas avoir pour les cellules transformées. En général, les cellules transformées, parce que nous les avons manipulées génétiquement, de sorte que leurs taux de croissance sont compromis. Spécifique, l'antibiotique concentrationest spécifique à une espèce, donc il faut l'optimized.Donc, c'est tout le protocole C'est pour votre référence le protocole théorique de la façon dont il est done.Donc, ce qui est fait, c'est que vous choisissez un explant approprié, puis stérilisez les explants en surface, les explants sont amenés à l'agrobacterium en suspension pendant 24 heures. Vous recherchez la phase de croissance parce que les cultures de l'agrobactérie sont active.Donc, les cultures de phase logarithmes sont préférentielles.Une fois que l'agrobactérie a grandi, il y a différentes souches d'agrobacterium whichare qui sont présentes et qui sont virulentà infecter les cellules végétales, mais c'est très hautement spéciesdependent.So, if one Agrobacterium comme par exemple, agrobacterium LBA 4404 ou 9402.Donc, il s'agit de souches différentes qui sont connues pour être très virulentes, mais il n'est pas nécessaire que, parce qu'elle a travaillé avec une espèce de plante, elle fonctionne de façon égale avec l'autre.Donc, vous devez choisir la souche de l'agrobactérie en phase active, les cellules de la phase logarithmique sont utilisées, puis même pour exposer les cellules, vous pouvez utiliser différentes techniques. Garder le formore de 15 ou 10 minutes.Donc, généralement de 10 à 15 minutes, vous le gardez exposé, alors vous devez le laver, donc la croissance excessive de l'agrobactérie ne se produit pas lorsque vous la gardrez dans l'incubationpour 48 heures.Donc, vous avez besoin de varier le temps de l'exposition le temps d'exposition, vous canvarier la concentration d'auto-suspension de l'agrobactérie. Vous pouvez faire varier le type d'explant qui peut être différent. Ensuite, je parlais des blessures qui peuvent être créées par différentes voies. Donc, les gens ont découvert que l'utilisation d'une seringue remplie de la suspension de l'agrobactérie, vous faites des blessures sur la nervure médiane des explants de feuilles et qui a donné lieu à une efficacité accrue de la transformation, puis les gens utilisent une méthode simple de trempage, où ils exposent l'explant blessé par une bladeou en contournant des trous dans les feuilles ou les explants, puis Donc, il y a des facteurs différents qui doivent être optimisés. Il semble facile, mais il y a un certain nombre de facteurs qui doivent être optimisés pour obtenir une culture réussie. Ensuite, dans la transformation de planta, on utilise généralement la méthode de trempette florale dans laquelle le fleuron est trempé dans la suspension de l'agrobactérie, puis il est maintenu pour une période d'incubation pour un certain temps qu'il réside, soit que les graines elles-mêmes peuvent être stérilisées en surface et trempée dans la suspension de façon à ce que l'agrobactérie cantransforme les graines, et qu'une fois qu'elles se régénèrent ou que le semis s'en sort, théyinfecter Les tissus, les parties aériennes ou les régions de la partie sol. Ou quand les graines, lorsque les fleurs sont trempés avec l'agrobactérie ou introduites en contact avec l'agrosbactérie juste avant la pollinisation, la duringpollinisation ou après la pollinisation, la bactérie présente à l'intérieur peut infecter le zygote ou infecter directement les cellules germinales impliquées dans la formation du zygote. Par la suite, des méthodes de transformation génétique directe, l'électroporation est une technique bien connue, qui est utilisée même pour les transformations bactériennes, puis les deux types d'électroporation qui Il a été constaté que les méthodes à impulsions courtes à haute tension fonctionnent mieux que les méthodes à impulsions de haute tension qui fonctionnent mieux que les méthodes à faible voltage becausethe dommages à l'ADN est moindre dans cette case.Maintenant, ce qui est fait la tension optimale, ce qui peut être optimisé la tension qui utilise le temps pour lequel elle est appliquée est optimisée. Addingyour peg. Pourquoi penses-tu que ça aide?Avez-vous entendu parler des cellules compétentes?Comment sont-ils compétents?Les cellules compétentes signifient qu'elles deviennent plus sensibles à l'absorption de la DNA.How extracellulaire sont-elles rendues sensibles?Ha, tous les divalents, même le magnésium, peuvent être utilisés, comment le rendre vulnérable?Donc, augmentant ainsi la proximité entre l'ADN extracellulaire et réduisant la répulsion, parce que les deux sont chargés négativement pour que c'est le chemin.Et qu'en est-il du PEG, alors ce qu'il fait? Donc, qu'est-ce que ça fait, tout le monde facilite maintenant l'absorption, le polyéthylène glycol est aussi très fréquemment utilisé .. DMSO, polyéthylène glycol oui, il réduit le. Alors, ce qui est fait est dans les méthodsas chimiques que nous parlions des cellules sont d'abord fabriqués avec compétence. Donc, les ions divalents peuvent être utilisés pour réduire la répulsion de charge comme pour augmenter ou augmenter la proximité entre les deux DNA.L' autre chose est qu'il y a une utilisation des gens manipuler le pH, les gens addpolyethylene glycolin le milieu et la concentration de l'ADN est aussi manipulé pour améliorer l'efficacité de la transformation.Maintenant, certaines de ces méthodes que vous devez retourner et vérifier ce qu'ils font est, ils essaient de condensé l'ADN ou de concentrer la DNA.Et concentrer la réduction de l'ADN La proximité entre l'ADN extracellulaire et la membrane de la plantule augmenterait la probabilité de succès, de sorte que c'est ce que ces choses do.Maintenant, les lipo infectionelles sont alsothe, l'absorption cellulaire supplémentaire de l'ADN peut être improvedante les encapsuler sous forme de liposomes.Maintenant, l'ingestion de liposomes est un phénomène bien connu dans cells.Donc, ils vont non seulement augmenter l'absorption de l'ADN, mais ils vont aussi protéger l'ADN des nucléases, donc aussi ce sont des liposomes, j'espère que vous savez ce qui sont des liposomes, ils sont semblables, ils ont à la fois des extrémités hydrophobes hydrophiles. Avoir une double couche. Comme la bicouche phospholipidique, ils encapsulent l'ADN à l'in.Maintenant, ils peuvent être induits à fusionner avec les cellules ou le protoploploploploploploploplopulan; ils peuvent être utilisés pour le transfert de gènes. Ensuite, il y a plusieurs avantages de ce que tous les différents avantages avec l'infection à lipo, la faible toxicité cellulaire, la stabilité et le stockage de l'acide nucléique peuvent être améliorés par encapsulation, puis un haut degré de reproductibilité et l'endocytose est un phénomène bien connu déjà presentin la cellule, de sorte que l'on peut facilement l'utiliser par les celles.Maintenant, les précipitations de phosphate de calcium une autre méthode le chlorure de calcium est en train d'être Il se condense l'ADN précipite, l'ADN de telle sorte qu'il est condensé, réduit ou permet à la cellule de se rapprocher beaucoup plus près de la membrane cellulaire, augmentant ainsi la probabilité d'absorption de la DNA.Microinjection, c'est le transfert directgène dans lequel est utilisé une micro-injection. Ce n'est pas si facile, uh sous le microscope, que vous maintenez la cellule bien en utilisant ou en congelingit sur une diapositive, en utilisant la poly lysine. Et puis à travers cette micro-injection, l'ADN est essayé soit directement à travers la membrane cellulaire dans le cytoplasme, soit dans le noyau de la cellule végétale. Maintenant, ce que d'autres méthodes directes peuvent être utilisées est dans la littérature, vous verrez que les gens ont utilisé la distribution d'ADN médiée par la fibre dans laquelle de très petites fibres de nano sont utilisées, les siliconfibres sont utilisées avec une grande vitesse, afin qu'elles puissent imprégner la membrane plasmique dans la valve de thecell et l'ADN est livré dans le cytoplasme. La seringue dont nous parlions, où elle peut être injectée directement dans le cytoplasme ou dans le noyau, puis micro projectile qui est votre méthode de canon génétique à très haute vitesse, elle est livrée aux cellules de la plante ou aux explants sous une atmosphère inerte avec un héliumgas. Et la vapeur d'eau à haute tension, les gouttelettes d'eau à grande vitesse sont créées, et elle porte l'ADN extracellulaire enduit de matériaux inertes de tungstène ou de nanoparticules d'or, qui peuvent être injectés sous haute direction dans les explants.I stop ici. Et puis la classe suivante Nous commenterons avec les bioréacteurs de la cellule végétale qui constituent la dernière partie du cours.