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Esta diapositiva está aquí si tuviera una manera de bloquearla, de inmediato puedo preguntar un cuestionario y ver si usted recuerda, así que ¿dónde encontrará la tapa 5 '? Al principio de la UTR. Entonces, ¿cuál será la relación del sitio de inicio de la transcripción con la relación con los exones e intrones? Así que el 5 ' UTR puede muy bien estar empezando en el sitio de inicio de transcripción para que pueda estar en el exón también. Alright, haremos más cuestionarios más adelante sobre esto. Así que ahora mismo, continuaremos con esto, por lo que hoy en día vamos a centrarnos principalmente en las técnicas de biología molecular, algunas de las cuales usted puede haber aprendido en otros cursos, y algunas de ellas pueden ser nuevas. Debido a que algunos de ellos son técnicas basadas en el organismo entero y que usted puede no haber oído en otra parte. Así que esencialmente, el foco principal son las técnicas por las que tratamos de entender la expresión de gen diferencial son. Así que ese va a ser el foco de esta conferencia, así como la próxima. (Consulte el tiempo de la diapositiva: 01:43) Así que esto continúa refrescando nuestra memoria de la estructura genética eucariota. Así que la anterior fue una caricatura; esta es una secuencia real del gen beta-globina. Así que tienes los elementos promotores en sentido ascendente como el cuadro TATA, y esta es la secuencia -70. Así que estos están ahí en la mayoría de los promotores; es por eso que son parte de la estructura central aquí. Así que esta es la secuencia que señala la adición de la tapa. Y los de colores son exones los grises son los intrones. Así que ves que la UTR es un exón y ahí tienes la gorra, comienza el codón ATG, luego el nucleótido real y la secuencia de aminoácidos traducida. Entonces usted tiene el principio de un intrón y el final de un intrón y luego así sucesivamente. Más tarde, al final, tienes el codón de stop, y luego tienes 3 ' UTR. Entonces entonces usted tiene el AATAAAA, esta es una señal de poli-A canónica, pero otras variantes de esto también funcionan como señal de poliadenilación. Así que ayudan en la identificación del sitio de escisión también. Así que en realidad, la maquinaria que hace el escote, aquí el escote significa, el pre-ARNm o transcripción naciente puede ser más largo en el 3 ' que el maduro en el citoplasma que tiene la cola poli-A. Así que en el 3 ' final del escote sucede, por lo que se elimina alguna cantidad del mRNA transcrito, y al resto, se añade la cola poli-A. Así que eso es un gran complejo y altamente regulado; es tan grande como un ribosoma. Otro complejo tan importante es el spliceosoma, la maquinaria de empalme. Así que estos son los principales complejos proteicos que operan. (Consulte el tiempo de la diapositiva: 03:45) Así que, a continuación, estamos mirando la transcripción misma, así que este es el primer paso aquí, así que usted tiene la transcripción. Así que en cuanto salga el ARNm naciente o el ARN nuclear, se le añade la tapa, tapa Trimetil G. En esa etapa, el empalme todavía está por suceder; eso es lo que quiero señalar, estas adiciones ayudan a proteger el ARN. Pero no estoy seguro de por qué ese paso es rápido, pero estas adiciones suceden en ambos extremos antes de que comience el empalme. Así que entonces usted tiene procesamiento, que es esencialmente empalmado. (Consultar tiempo de la diapositiva: 04:28) Entonces usted tiene el ARN mensajero o mRNA maduro, por lo que esto entra en el citoplasma donde se traduce, entonces usted tiene la cadena de proteínas. Y luego eso tiene que someterse a dos cosas; una adecuada plegada a la conformación nativa y también modificación post-traslacional. Así que aquí, por ejemplo, se añade el grupo protésico, se trata de una proteína de cuatro subunidades, es un heterodimer. Así que beta-globina, alfa-globina, cada uno se une para hacer la molécula funcional. Así que todos estos pasos juntos es lo que ustedes llaman expresión genética. Así que no asuma que sólo la transcripción es expresión génica, y esto es algo así como el nivel de proteína, toda la cosa es la expresión génica. Cuando se habla de gen, la definición de un gen es una función biológica que es el fenotipo, por lo que la proteína es responsable de ello. Así que no distinguimos estos pasos, a partir de las modificaciones de la estructura de la cromatina; como de la heterocromatina a la transformación de la eucromatina que sucede debido a la eliminación de grupos de metilo y la adición de grupos de acetilo y grupos metilo específicos a la cola de H3; a partir de ahí a la proteína activa o inactiva post-translacionalmente modificada. Así que hasta eso, los pasos completos se llaman expresión génica; cada uno es un paso en la expresión génica. Así que ahora sabemos qué es un gen y cuál es su forma funcional final. (Consulte el tiempo de la diapositiva: 06:13) Así que ahora vamos a ver de nuevo que estamos refrescando algunos otros pasos, todavía no estamos entrando en la expresión del gen diferencial. Para eso, queremos familiarizarnos con lo que pasa, para que sepamos dónde pueden pasar las regulaciones. Así que lo primero es que vamos a mirar la iniciación de la transcripción en sí, por lo que la iniciación de la transcripción en esta caricatura va con algunos detalles. Aún así, el resumen es que un conjunto de proteínas tienen que unirse en una secuencia específica para permitir que la ARN polimerasa inicie la transcripción. Así que el montaje inicial y el reclutamiento de la ARN polimerasa para el promotor es lo que usted llama como iniciación de la transcripción. Así que aquí tienes TF2D, factor de transcripción 2D, por lo que primero tiene que unirse, enlaza el cuadro TATA y luego recluta 2A, luego tienes B y H, estas estructuras tipo pinza. (Consulte el tiempo de la diapositiva: 07:14) Añádanse y, a continuación, sólo tiene pol II reclutado, y a la pol II, tiene la E y la F que ya se le unen, y cuando se une a este dominio carboxi-terminal, el CTD desempeña un papel importante en la regulación. Así que eso está unido a la estructura 2D, la molécula principal. (Consulte la hora de la diapositiva: 07:39) Y así es como está, por lo que esto ya está establecido, pero no es ir. Así que requiere fosforilación de CTD. Por lo tanto, el fosforilato o no fosforilato es un paso allí. Si la fosforilación no sucede, entonces la transcripción no se iniciará, aunque todo se ha vinculado. De modo que es un paso en el que a menudo ocurre la regulación. Por lo tanto, ciertos residuos de serina son críticos para la fosforilación. Así que a menudo, los biólogos del desarrollo utilizan esos anticuerpos específicos de serina fosforilados o anticuerpos específicos de CTD fosforilados para medir si la transcripción está sucediendo en un núcleo dado o no. Así que con esos anticuerpos específicos de fosforo o anticuerpos fosforilados específicos de CTD, si usted no detecta una señal probablemente, no hay ninguna transcripción de ARNm sucediendo. Así que recuerda que estamos hablando solo de ARNm porque es pol II anticuerpos específicos, pero podría estar ocurriendo otra transcripción. Así que una vez pol II fosforilado, entonces se libera de TF2D, y está listo para alargarse. Entonces la iniciación entonces elongación, así que este es el paso de iniciación, y esto es elongación. E incluso en el alargamiento, puede ser pausado a veces, por lo que no vamos a entrar en esos detalles, pero esto es lo suficientemente bueno como para saber que este es un paso potencial para la regulación. (Consulte el apartado Hora de la diapositiva: 09:17) Bien, así que ahora se hace con esos elementos básicos. Así que ahora vamos a ver una serie de experimentos que nos ayudan a identificar secuencias en la región promotora y así como en otras partes de la vecindad del gen que podría estar contribuyendo a la transcripción una, y en segundo lugar, también vamos a ver cómo se encuentran los factores de transcripción? Es decir, factores de transacción como las proteínas. La secuencia de ADN se llama Cis porque está en la misma molécula que el marco de lectura abierta y la proteína está codificada en otros lugares, y viene como una molécula diferente diferente de esa pieza de ADN donde se tiene el gen, por lo que, por lo tanto, se llama Trans. Así que cuando dices factores de transacción, estás hablando de factores que no son una secuencia genética dada que influye en esa expresión génica. Así que este es un Assay muy comúnmente usado; la gente lo usa para múltiples contextos donde se quiere probar la interacción ácido nucleico-proteína. Así que en este momento, estamos buscando la interacción de ADN-proteína para encontrar los elementos promotores que pueden estar involucrados en la interacción con un factor de transcripción específico. Por lo tanto, estos factores de transcripción mostrados en color azul están ayudando en el reclutamiento de la RNA pol II al promotor, y son factores de transcripción, por lo que estos factores se enumeran aquí y nombrados; estos están allí para cada gen. Estos son factores de transcripción del núcleo, y hay factores de transcripción específicos del gen que aprenderemos más adelante, y entonces, ¿cómo probamos si un factor de transacción dado interactúa con un elemento dado de ADN o no? Así que para probar eso es que usamos este experimento llamado ensayo de cambio de gel o ensayo de cambio de movilidad en gel o retardo de gel Assay; hay múltiples nombres para ello. El término más utilizado es el cambio de movilidad electroforético Assay o E M S A o EMSA. Por lo que algunos laboratorios llaman EMSA, o algunos laboratorios llaman E M S A, algunos laboratorios ni siquiera dicen que dicen cambio de movilidad o cambio de gel. Es una técnica directa. Así que lo que estás haciendo es tomarte una versión radiomarcada mostrada aquí en esto, sea cual sea el color que venga en esa pantalla aquí para mí se ve morado. Así que usted toma una versión radiomarcada del fragmento de ADN que desea probar si interactúa con una proteína dada. Luego se incuba el ADN con la proteína; puede ser proteína purificada, o es un lisado celular donde la proteína puede estar presente, por lo que se incuba con ella, y luego se corre sobre un gel. Si la proteína se une a ese fragmento de ADN, el tamaño complejo es mayor que el ácido nucleico individual, por lo que la movilidad se reduce. Ya que en el gel lo ves como un cambio, un turno al alza lo llamas como ensayo de cambio de movilidad en gel o desde que retarda la movilidad del ácido nucleico lo llamas como ensayo de retraso en gel, por lo que todos esos nombres son válidos. Así que así es como lo ves. Así que aquí en este caso en particular, Pax 6 es un factor de transcripción sobre el cual veremos algunos más. Y sin que el ácido nucleico libre lo llamemos una sonda libre, tan libre de sonda por un tiempo dado en una condición dada de gel, por ejemplo, tamaño de poro de gel, etc. Se mueve una cierta distancia, y cuando se añade el factor de transcripción que se une a este fragmento de ADN en particular, su movilidad se desplaza; ya que es radiomarcada, se puede detectar por la autoradiografía por lo que este es un experimento muy versátil y muy útil. En nuestro laboratorio, lo utilizamos principalmente para encontrar proteínas de unión de ARN que interactúan con 3 ' UTR y regulan la traducción. Así que ese es el contexto en el que hemos utilizado, así que por lo tanto es útil para la interacción ácido nucleico-proteína en diferentes ajustes. Así que en el carril 3 se ha añadido Pax6, por lo que se desplaza, y en el carril 4 también se añade Pax6; es un experimento de control. Así que la interpretación aquí tiene dos explicaciones alternativas una tal vez es una proteína que ligaría cualquier ácido nucleico, no específicamente. Puede que no sea específico de la secuencia, para probar que lo que hace es añadir un exceso molar significativo del mismo fragmento de ácido nucleico pero sin radiomarcar. Así que ahora lo que sucederá es dependiendo de lo que sea el exceso molar; digamos que tengo un exceso molar de 10 veces o un exceso molar de 100 veces, entonces esta intensidad bajará aquí. Solo hay uno porque es una caricatura y solo mostrarte el esquema. Pero en un experimento real, tendremos 2 veces, 4 veces, 10 veces, 100 veces más alto que el mismo ácido nucleico no etiquetado. Así que eso también tendría una tendencia igual de unirse; es más como un inhibidor competitivo. Así que ahora tienes la banda ahí, pero eso no es tener radiactividad, por lo que no lo detectas. Así pues, otro control que no se muestra aquí es que se añade un exceso molar similar de un número similar de nucleótidos de la misma longitud del ácido nucleico, pero una secuencia no específica. Y eso no competirá si es una unión específica de secuencia, la misma secuencia no etiquetada competirá por el radiolabel allí, pero una secuencia diferente no competirá. Así que incluso es exceso, esta proteína seguirá enlazándola a esa secuencia en particular. (Vea el tiempo de la diapositiva: 15:41) Muy bien, así que el siguiente es la protección de DNase Assay, por lo que esta imagen si usted ve, ya no estamos haciendo la secuenciación del ADN por este método, pero de otro modo supongamos como cuando yo era un estudiante este es un gel de rutina, por lo que este tipo de imagen que vemos todos los días si estamos haciendo la secuenciación del ADN. Así que en esos días, no hicimos mucho en biología del desarrollo. Así que estos experimentos de biología molecular son lo que la mayoría de la gente hizo, así que así es como haces la secuenciación del ADN. Así que tienes oligo radiomarcado para empezar, y en cada reacción, tienes dideoxi de ese nucleótido, por lo que tendrás cuatro carriles vas a correr cuatro carriles en un gel. Y luego ves en qué carril tienes el fragmento más pequeño, y de ahí progresivamente, contás hacia arriba, y así es como obtienes la secuencia del ADN. Por lo tanto, este es uno de estos gel de secuenciación de ADN, pero aquí usted no está secuenciando el ADN mismo. Así que en cambio, el ADN se incuba con una proteína que se une a alguna región del ADN, por lo que este es realmente un fragmento grande en comparación con lo que se usa en el ensayo de cambio de gel. Así que aquí están tratando de encontrar qué secuencia en la secuencia más grande del ADN, se une a la proteína. Luego, una vez que la proteína se une al ADN, se agrega una nucleasa, se hace un tratamiento de nucleasa controlado. Así que ahora el fragmento que está protegido por la primera proteína que está unida al ADN, protege esa secuencia, y el resto de ella se escinde. Y cuando se corre un gel, ya que se controla la digestión y se tiene una digestión parcial por cada longitud de nucleótido. Así que, en el carril de control, se ven bandas para toda la longitud porque en cada lugar que se podría digerir. Pero si se mira esta porción en estos dos carriles y luego aquí, se ven las bandas que faltan al añadir Pax6. Por lo tanto, si se comparan los dos primeros carriles con el carril de control que no tiene pax-6, indicar que pax6 se une a esa región, principalmente se está probando qué porción del ADN está protegida por su proteína a partir del escote de nucleasa. Por lo tanto, esto también se hace con la protección de RNAse para encontrar parte del ARN donde se une la proteína de unión de ARN. Por lo tanto, se trata de un ensayo de protección DNAse, que también se denomina ensayo de huella porque es como una huella, la huella de la proteína s. (Consultar Tiempo de Slide: 18:32) Así que antes de entrar en el siguiente conjunto de técnicas, vamos a mirar una parte del gen que es un elemento regulador, no pertenecen a la parte de codificación del gen, y puede ser en cualquier lugar en realidad no necesita estar siempre en la región promotora, puede ser a una distancia considerable, puede ser aguas abajo del sitio de iniciación de la transcripción también. Así que eso es lo que vamos a mirar, y se llaman potenciadores. Entonces, ¿qué son los potenciadores? El primer punto le dice que controlan la eficiencia y la tasa de transcripción. Por lo tanto, pueden aumentar la tasa, o en algunos lugares, especifican muy estrictamente la expresión espacial o temporal de un gen, de modo que se muestra aquí en esto. En la caricatura del promotor Pax6, estas barras o bandas de color naranja, son los exones. Este rojo es el promotor en sí, entonces este verde es el potenciador, y usted ve potenciador presente aquí cuatro fragmentos o cuatro partes, y uno de ellos es en realidad en un intrón. Así, 1, 2, 3, 4, 5, 5a, 6, 7, son exón y entre esos son intrones, por lo que uno de los potenciadores es parte de un intrón también. Por lo tanto, todos estos potenciadores, como mencioné, controlan la eficiencia y la tasa y, a veces, la regulación temporal y espacial estricta. Y aquí vemos tal información de regulación espacial, por ejemplo, este potenciador entre exón 4 y 5 confiere expresión de Pax6 en la retina y este exón particular aquí justo antes de que el inicio de la transcripción sea un potenciador del tubo neural que se asegura de que esta proteína se exprese en tubos neurales. Y la otra lente y córnea, si no la tienes, no se va a expresar allí y la otra la más arriba la mayoría es específica del páncreas. Por lo tanto, cada uno de estos cuatro tiene cuatro diferentes expresiones específicas del tejido de este gen. Por lo tanto, es posible que tenga el principal promotor, el factor de transcripción central todo, pero usted no va a tener una transcripción, si usted no tiene estos potenciadores y esos factores de transcripción específicos potenciador. Así que, los veremos uno a uno. Por lo tanto, esta secuencia real le dice en una parte de esta secuencia de potenciador pancreático donde se ven sitios de enlace para dos diferentes factores de transcripción. (Consulte el tiempo de la diapositiva: 21:28) Por lo tanto, un poco más de detalle sobre eso veremos en dos diapositivas más adelante. Hay muchas maneras por las que uno identifica a los potenciadores, y una técnica fácil de entender y muy potente es la trampa potenciador. Por lo tanto, involucra tener un promotor central que impulsa un gen reportero, todo ello incrustado en un elemento transposable. Por lo tanto, esta técnica es útil en un organismo en donde existen elementos transposables endógenos naturales. Estos elementos saltan y saltan dependiendo del contexto, donde están activos o no; dependiendo de eso, se moverán alrededor del genoma. Y por lo general, para que los elementos transposables se inserten, necesitan secuencias repetitivas, y dondequiera que esté ahí irán. Así que si utilizas los elementos transposables como vehículo para llevar a este reportero con el promotor central, sin ningún elemento regulatorio como ningún potenciador ni nada y si aportas el contexto en el que los elementos transposables están activos, por un periodo determinado y si lo miras encontrarás diferentes inserciones. Se trata de una especie de mutagénesis utilizando elementos transposables, en lugar de algún otro mutágeno. Por lo tanto, en un organismo dado, el elemento transposable estará presente en diferentes partes del genoma. Si este reportero transcripcional se inserta en la vecindad de un potenciador como se ve en esta imagen aquí. Si este potenciador influye en la expresión de este reportero, esto se expresa donde un gen se expresa generalmente, y entonces usted puede detectarlo de esta manera en la imagen. Este es un embrión de drosophila en la imagen, así que donde se ve el patrón de expresión. Así que esencialmente, usted está atrapando un potenciador con la ayuda de un gen reportero. Por lo tanto, el gen reportero tiene un promotor débil; sólo tiene el núcleo básico uno, y no va a expresar por sí mismo sin venir bajo la influencia del potenciador. Por lo tanto, cuando usted hace una inserción aleatoria, si el reportero se inserta cerca de un potenciador, y si el reportero expresa donde el potenciador activa la transcripción de un gen, por lo general, muestra que este mejorador funciona en este tejido en particular. Así que más adelante que puede ser verificado por otros métodos también, el gen reportero aquí es LacZ. Por lo tanto, esto se hace en una era mucho antes de que se descubriera GFP. Para que te enteres por secuenciar la región de flanqueo, eso no será difícil, pero el punto es que has atrapado un potenciador. Por lo tanto, el objetivo principal de nuevo es que estos procesos de pensamiento vienen de la genética; en la genética, usted no se preocupa por la molécula. Primero, ves si golpeas una molécula que es responsable de una función, entonces puedes buscar y encontrar la molécula; eso es mucho más fácil que tener una hebilla de moléculas como puedes tomar cualquier organismo y aplastarlo y enviarlo a una empresa. Y te darán todas las proteínas producidas allí, todo el mRNA producido allí, pero ¿qué harás con él sin conectarte a la función? Por lo tanto, solemos llamar a esa gran lista de lavandería, pero no sabes qué hacer con ella, muchas de esas listas están dando vueltas durante los últimos 20 años sin que la gente haya hecho progreso, esto no es una menosprecia la utilidad de eso. Esto es sólo para resaltar la importancia de conectarse directamente al fenotipo porque es sencillo hacer una PCR inversa y secuenciar la secuencia vecina. Ya que usted conoce la secuencia, por lo que puede digerir con enzimas de restricción, y algunos podrían cortar en algún lugar aquí y allá. Bajo una condición muy diluida, si la liegan, la ligadura intramolecular sucederá. Por lo tanto, se circulará, entonces usted toma la secuencia que usted sabe entonces usted utiliza los primers yendo en la dirección opuesta, entonces estos primers PCR amplifica la región de flanqueo y finalmente usted secuencia, y usted sabrá dónde está. Entonces, así es como se identifica, pero el objetivo principal aquí es encontrar, ¿voy a obtener una activación específica del tejido? Así que eso significa que estoy en la vecindad de un potenciador potencial, así que ese es el objetivo de esto. Por lo tanto, estos se hicieron a mediados de los años 80 a finales de los años 80. (Consultar Tiempo de Slide: 26:25) Así que el siguiente es la misma cosa pero te ayuda a determinar, como por ejemplo si conoces un potenciador, y luego quieres averiguar cuáles son todos los diferentes lugares, donde funciona ese potenciador, Así puedes hacer reporteros bajo el control de potenciador y mirarlo. Por lo tanto, este es un método de ensayo más antiguo donde es LacZ, y entonces usted ve su expresión para principalmente en usted conoce el sistema nervioso central aquí y la expresión específica del músculo. Y aquí, lo que están viendo es la lente cristalizada en el potenciador, y usted ve donde se expresa, así que esta es la imagen que me gusta particularmente porque le muestra el control específico del tejido tan claramente. Por lo tanto, hay muchas cosas de este tipo ayer en el laboratorio que teníamos algunas imágenes donde el gen ’ s GFP se expresa sólo en los núcleos de un conjunto particular de células a lo largo de la longitud del gusano. Por lo tanto, el gusano tiene algo llamado la costura, una estructura horizontal que proporciona refuerzo estructural para el cuerpo. Y eso está formado por 16 pares de células, y este gen en particular se expresa sólo en esas 16 células; el resto de las 959 células son todas oscuras, y solo éstas están brillando en verde. Por lo tanto, era demasiado tarde, así que no hice una foto que pudiera ser mostrada aquí hoy. Así que, pero esto está haciendo el mismo trabajo por lo que lo ves solo en la lente ni siquiera en el resto del ojo. Debido a que usted no quiere cristalin expresado en otra parte, usted quiere sólo en la lente. Así que ahora, usted está recibiendo una idea de lo que es la expresión del gen diferencial. (Consulte el tiempo de la diapositiva: 28:09) Así que ahora, deje que los ’ s vean las aplicaciones de potenciador. Por lo tanto, son beneficiosos en dos contextos diferentes. Vamos a ver dos ejemplos diversos. Una de ellas es, a menudo se utiliza en el ratón donde se quiere tener un nocaut condicional. Digamos que un gen tiene un papel crucial en la etapa de escisión del embrión, y si usted acaba de golpearlo y crear un alelo nulo, entonces va a ser letal embrionario. Imagina que ese gen tenía una función en el hígado, y quieres saber específicamente qué hace en el hígado; nunca lo sabrás. Por lo tanto, por lo tanto, cuando la gente quiere encontrar la función específica del tejido o específica del órgano de un gen, ellos quieren tener nocauts condicionales, lo que significa la eliminación condicional. Knockout es un nuevo nombre, básicamente, lo que dices es la eliminación de un gen, eso es lo que los no genetistas llamaron inicialmente un nocaut. Ahora los genetistas también lo usan, entonces algunas personas llaman al knock-in, y entonces la gente dice derribo, un agotamiento parcial que llaman derribo. Simplemente no me gusta esa palabra porque eso no transmite el significado; no dice lo que dice el agotamiento. Y de manera similar, el significado de la inserción transgene. Así que ahora estamos viendo el nocaut condicional, lo que significa que no lo estamos borrando en el núcleo zigótico, vamos a noquear en un tejido somático particular. Entonces, ¿cómo hacer eso? ¿Cómo ayudan los potenciadores? Así que ahora tienes una cepa del ratón, donde tienes un bacteriofago recombinase. Por lo tanto, te diré un poco sobre el bacteriófago. No estoy seguro de cuántos de ustedes han aprendido el ciclo de vida bacteriófago. ¿Alguien aprendió lambda phage lysogeny y ciclos líticos? ¿Qué hace el bacteriófago para su vida? ¿Cómo sobreviven? Por lo tanto, se integran en la célula huésped, y entonces cuando las condiciones favorables vienen, pueden hacer varias copias y salir de la célula huésped. Lo hacen utilizando recombinación específica del sitio, y eso se explota aquí porque si digo recombinase y si no sabías qué es la recombinasa entonces no tiene sentido seguir adelante. Así que cre es una tal recombinasa, por lo que usted expresa esa proteína en este ejemplo particular bajo el control de un mejorador para la albúmina. Por lo tanto, usted tiene una cepa del ratón que tiene Cre recombinasa bajo el potenciador de la albúmina como un transgen. Por lo tanto, sólo se expresará en el hígado donde se producirá albúmina; sólo se producirá Cre recombinasa. Ahora tienes otra cepa del ratón donde tu gen de interés, por ejemplo, en este caso, el factor de transcripción HNF4 alfa, su exón 2 está flanqueado por la secuencia reconocida por la Cre recombinase. Así es como funciona la recombinación específica del sitio. Por lo tanto, el sitio para el Cre se llama bacteriofago p1, y eso se llama sitios loxp. Por lo tanto, el sitio de loxp flancos exon 2, normalmente la gente lo llama como floxed, flanqueado por lox tan flotado. Por lo tanto, usted flox el gen de interés este exón 2 no va a ser eliminado en esa cepa en cualquier lugar porque no hay recombinasa generalmente en el ratón que reconocerá loxp. Así que eso va a ser saludable, y simplemente expresar Cre recombinasa en el hígado no va a causar ningún problema para esa cepa porque funcionará sólo si hay un loxp; de lo contrario, está produciendo una proteína que no es ni tóxica ni tiene ninguna interferencia funcional. Pero si usted cruza estos dos ratones y genera un doble mutante, el ratón que lleva ambos en su hígado, usted tendrá ambos elementos funcionales reunidos. Usted tendrá Cre recombinasa producida porque todo el potenciador de la albúmina hace que se exprese sólo en el hígado y en ningún otro lugar y también es necesario recordar esto es la flotación de la línea germinal. Por lo tanto, en esta cepa del ratón, el genoma de todas las células tendrá esta secuencia. Ya conocemos la equivalencia del genoma y eso no importa. Sólo en el hígado donde se tiene la Cre recombinase se reconocerá el sitio loxp y lo tratará como genoma bacteriófago y se va a aplicar. Y luego no tendrás exón 2, por lo que se trata de un nocaut condicional. Así que, así es como las personas usan potenciadores. Así que ahora en un club de diario o en un seminario, si alguien dice nocaut condicional y he flotado este gen, usted entiende inmediatamente lo que es, por lo que es esencial saber esto. (Consulte el apartado Tiempo de la diapositiva: 34:04) Y el segundo se utiliza principalmente en Drosophila. Aún así, es convincente y se les ocurrió esto por mucho tiempo atrás. Sólo recientemente, la gente lo ha estado haciendo con éxito en C. elegans, probablemente cuando la gente no encontró un contexto crítico donde lo necesitaban o perezosos para desarrollar una herramienta o lo que fuera. Pero recientemente han demostrado que funciona, pero en Drosophila esto ha sido muy bien explotado, y ustedes saben que este ejemplo es lo suficientemente bueno para entender lo poderoso que es esto. Por lo tanto, este es el sistema GAL4-UAS muy similar en principio al anterior. Usted tendrá dos cepas diferentes; aquí una cepa está bajo el potenciador de un disco imaginal particular. No sé cuántos de ustedes saben lo que es el disco de imagen, por lo que el disco de imagen vuelve a la metamorfosis. Dado que el Drosophila es un insecto, tiene una etapa de oruga similar al gusano de este; la mosca sale, por lo que hay metamorfosis. Por lo tanto, en esa etapa de gusano, tiene el primordium para todas las etapas adultas, y estos primordios se llaman discos de imagen. Por lo tanto, el ala primidia significa el disco de la imagen del ala, lo que significa las células primordiales que están presentes en la oruga que eventualmente se expandirá en el ala en el adulto y por lo tanto estos son los discos de imagen. Usted usa ese potenciador para controlar la expresión de un factor de transcripción de levadura GAL4. Así que GAL4 vuelve a tener una secuencia corta particular que se utiliza para reconocer y activar la transcripción. Por lo tanto, usted tiene ese factor de transcripción producido en una cepa de Drosophila bajo este potenciador específico del disco de imagen. Ahora tienes otra cepa donde tienes la corriente arriba de tu gen de interés, o el gen en sí es un transgen, por ejemplo, Pax6. Estás tomando del sistema de mamíferos y poniéndolo aquí, así que tratas de expresar esto bajo el control del promotor donde se une GAL4. Por lo tanto, esto se denomina secuencia de activación en sentido ascendente, por lo tanto, UAS. Por lo tanto, la UAS aquí es GAL4-UAS, y es para Pax6, y en la otra, digamos que el disco de imagen específico del ojo. Así que ahora, cuando cruzas ambos y haces un doble mutante, vas a producir proteína pax6, donde por lo general, esto impulsará la expresión GAL4. Así, en este caso particular, no es el ojo; es otra estructura en el tórax o en la región de la cabeza donde al conducir pax-6, pudieron inducir la formación del ojo en el lugar de la antena. Por lo tanto, lo que te dice aquí es pax-6 actúa como un regulador maestro del desarrollo de los ojos. Así que una vez que usted proporciona pax-6, entonces parece que todo lo demás ya está allí en ese tejido en particular para impulsar la formación del ojo. Por lo tanto, veremos similar una formación completa de órganos en el lugar equivocado en más ejemplos más adelante a medida que atravesamos. Un buen grupo de genes llamados genes HOX o las mutaciones homeóticas donde usted tiene un órgano reemplazado por otro órgano simplemente porque usted cambió el regulador maestro allí. Así que, te da versatilidad como, por ejemplo, puedo tener esta línea, y cruzarla con otra línea donde está presente la UAS para otro gen. Te da esa flexibilidad, así que puedo tener una biblioteca como un conjunto de gen conductor, y conjunto de UAS, así que así, puedo tener, y luego juntándolos, puedo activar, por lo que esa es la razón principal. En la anterior también es lo mismo, por lo que es porque quieres saber en qué disco imaginal; si activo pax-6, voy a ver este fenotipo o en cambio si expreso pax-6 en diferentes discos imaginales ¿qué pasa? Entonces, ¿quieres saber dos cosas aquí; una es qué hace esta proteína si se pone en un contexto biológico particular? Otro es qué disco de imagen puede desarrollar qué tipo de estructuras. Digamos, por ejemplo, que normalmente forma antena, pero puede hacer el ojo también si usted proporciona un factor de transcripción específico del ojo. Por lo tanto, esto ha sido ampliamente explotado por los biólogos del desarrollo de Drosophila usted encontrará gran cantidad de documentos, usted difícilmente encontrará un papel donde no utilizan este método. (Consulte la hora de la diapositiva: 40:15) Bien, para que esto termine, pero no hemos terminado. Tenemos otra conferencia que podemos comenzar, que es una continuación de la misma, estamos volviendo a la misma región promotora de pax-6. Así que, ayudaría si recordabas esto, estoy hablando del promotor pax-6. Por lo tanto, donde la expresión pax-6 y cómo se regula es el enfoque. Por lo tanto, estamos viendo su potenciador, y a su vez, Pax-6 es un factor de transcripción también, de modo que