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Module 1: Genética molecular del desarrollo de plantas

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Caracterización funcional del gen

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Bienvenido al curso de Biología de Desarrollo de Plantas.Así, en la clase anterior, estábamos discutiendo los enfoques basados en la genética inversa, y ya hemos terminado la forma de analizar o cómo monitorear el patrón de expresión de genes. Y entonces ahora en esta clase, vamos a discutir acerca de cómo funcionalmente característica.Así que, para caracterizar funcionalmente un gen que significa que usted quiere saber qué es una función específica de un gen en un proceso de desarrollo en particular. Entonces, ¿cómo lo sabrá usted?Por lo tanto, un enfoque es siempre saber que algunas de las funciones es la pérdida de funciones. Por lo tanto, si usted de alguna manera altera el gen, y luego ver qué tipo de defecto de desarrollo usted ve cuando usted hace una pérdida de la función de un gen. Y esto dirá que para qué función su gen es necesario.Y luego otro enfoque complementario para validarlo o para entender el funcionariado de un gen es la ganancia de funciona.Así, normalmente asumamos que un gen del desarrollo se expresa en un tejido en particular, pero no se expresa en algún otro tejido. Entonces, si usted toma este gen y ectopicamente se expresa en el tejido donde no estaba presente normalmente, y entonces usted puede ver que el tejido puede reiniciar algún programa de desarrollo. Y si es así, entonces podemos decir que un gen en particular es suficiente con un funciono.Así, estos son los dos principales enfoques que tomamos para entender la función de un Por lo tanto, vamos a tomar uno por one.Así, primero vamos a tomar loss-oforfunción.Y aquí hay dos maneras de hacerlo, ya sea que usted knockout el gen o que se ha puesto de abajo el gen. En knock-out lo que básicamente hace usted totalmente hacer un mutante nulo donde el gen es totalmenteinterrumpido. En el derribo usted está reduciendo la expresión de un gen en particular, pero no es un mutante nulo. Y en el aumento de la función o hay dos maneras de hacer eso, uno que le dije es la sobreexpresión ectópica o la expresión ectópica. Por lo tanto, usted expresa este gen, usted cambia el promotor, usted utiliza un promotor más amplio para expresar este gen en Un tejido en el que normalmente no se expresa, y el segundo método es el etiquetado de activación que veremos más adelante. Por lo tanto, primero tomaremos la pérdida-de-función cómo generar knock-outs.Así, si usted mira los dos primeros enfoques, esto ya lo hemos discutido en los enfoques basados en la genética hacia adelante que es generar líneas de inactivacióninsercional para un gene.Así, una fue la inserción del ADN T, la segunda fue la incorporación mediada por la incorporación. Pero la diferencia entre la genética hacia adelante y la genética inversa es que en los geneticswe no estábamos arreglando el gen, estábamos arreglando el O si estábamos arreglando el fenotipo si estábamos arreglando el proceso biológico, y entonces estamos tratando de buscar las líneas de inserción de T-DNA o transposen las líneas de inserción y luego tratar de mapear ese gen que es. Pero para en la genética inversa, lo que hacemos que ahora sabemos un gen específico ahora sabemos que este es el gen y quiero entender cuál es su función biológica, entonces usted puede específicamente ir para y buscar ese gen es allí algunas líneas de inserción de ADN disponibles para ese gen o transposon líneas disponibles para ese gen o no. Otro método y ahora muy ampliamente utilizado es el genoma editing.Así, aquí usted están básicamente editando en el nivel del genoma el gen, y entonces usted está generatingknock-outs o pérdida-de-función mutants.Así, primero vamos a tomar la inactivación insercional lines.Así, como dije que las personas inicialmente han hecho a un nivel muy global, que han generateda gran número de líneas de inserción de T-DNA o transposen líneas de inserción, y esos lineshan sido depositados en algunas bases de datos. Así, por ejemplo, ya hay tantas bases de datos o tantos laboratorios o tan manyprojects que han generado un gran número de líneas de inserción de T-DNA o transposon insertionlines. Y esto todos los mutantes ha sido Y lo que usted puede hacer eso, usted puede elegir cualquiera de la mutante, usted puede solicitar, usted puede pedir, y usted obtendrá directamente esos mutantes para su análisis funcional detallado. Así, hay muchos muchos gran número de este tipo de colección de mutantes están disponibles. Voy a tomar uno de los exámenes. Así, por ejemplo, este T-DNA express o este es un Instituto Salk que han generado largenumber de la línea de inserción de T-DNA. Lo que simplemente tienes que hacer este sitio web está disponible, usted acaba de elegir su gen, poner el ID del gen, buscar con el gen, buscar con el cromosoma, buscar con los algunos de thename o cualquier cosa, y luego mostrarán una lista de las líneas de inserción disponibles para ese gen en particular, y usted puede elegir. En algún momento lo que sucede que usted puede tener más de una línea de inserción en su gen. Y entonces usted puede ver usted puede definir dónde usted quiere tener la inserción, por ejemplo, si usted mira este gen que usted puede tener tanta inserción que usted puede elegir que quiero una línea de inserción en el exon 1, quiero una línea de inserción en el exon 2.Y entonces usted sólo toma estos números y la solicitud de la base de datos, y estas semillas las semillas de mutantArabidopsis estarán disponibles para usted, y entonces usted puede conseguir este mutante o knock-esbos para su caracterización funcional detallada. Y lo primero que usted hace, si usted consigue este tipo de línea de inserción, primero que establece que realmente hay inserción primero cosa. Segunda cosa es que lo que es el patrón genético es la inserción es homocigoso, tanto los allelesare interrumpido o es heterocigous sólo un alelos se interrumpen. ¿Cómo se puede hacer?Esto es muy fácil ya que usted conoce el sitio de inserción predicho sitio de la inserción, usted sabe la secuencia de T-DNA, usted sabe su gen de gen que usted conoce esencialmente la secuencia de su gen, usted puede diseñar un primer manual aquí, una imprimación inversa aquí y un primeryou puede diseñar en el T-DNA y entonces usted puede hacer un poco de PCR.Si usted hace con este ADN genómico hacia adelante y la imprimación inversa, si hay inserción, ifthere es la inserción, la línea de inserción no le dará porque el tamaño del fragmento es verybig, usted no conseguirá la amplificación.Así, si usted tiene una línea homocigosa, en la línea homocigosa es básicamente su tanto el A continuación, si utiliza LP y RP juntos no obtendrá una banda aquí. Pero si es de tipo salvaje o heterocigoso, en un locus heterocigoso tiene la inserción, otro locus no tiene inserción. Entonces, desde el locus donde usted no tiene la inserción usted obtendrá esta banda.Así, básicamente su tipo salvaje y heterocigoso ambos darán banda con el LP y RP.Entonces usted elige su LP con este o RP con esto dependiendo de en qué orientación su ADN es, y entonces si usted tiene un heterocigoso usted tendrá una especie de banda aquí. Y entonces si es de tipo salvaje, usted no tendrá esta banda específica de ADN. es muy importante para usted para establecer que lo que es el estado de inserción de este ADN en su gen. Entonces otra cosa importante lo que tratamos de hacer es que siempre de vuelta cruzada, ya que desde que todo esto se ha generado a través de una inserción aleatoria, hay una posibilidad de que en su planta hay más T-DNA de inserción site.Así, usted podría tener una inserción en su gen, pero podría haber algunas otras inserciones en otros genes. Y que usted puede eliminar tomando estas líneas cruzando con el tipo salvaje y luego goingto la generación F2 y otra vez la pantalla para homocigous. Y luego una vez que usted tiene establecida esta línea, usted puede tomar estas líneas para la caracterización detallada de la función o estudiar el defecto del desarrollo en este T-DNA o el análisis de la función. Otro método que es el genoma editing.Así, en la edición del genoma, hay muchas técnicas disponibles que usted puede utilizar para editar la genomZFN, entonces SE HABLA, pero recientemente CRISPR Cas 9 se ha utilizado muy ampliamente y muy extensivelyestos días.Así, veremos cómo se está usando esto para editar el gene.Así, esencialmente, ¿qué es este CRISPR Cas 9 basado en la edición del genoma tool.Así que, aquí lo que estamos usando?Estamos usingenucleasas bacterianas que son endonucleasas guiadas de ARN que es Cas 9.Así, y entonces usted lo que usted hace simplemente usted produce un ARN guía y usted produce proteína Cas 9 en la planta. Este ARN guía usted puede apuntar a su secuencia dondequiera que usted want.Así, usted puede diseñar una guía muy dirigida RNA.Y entonces aquí cuando usted expresa el ARN guía junto con la proteína Cas 9, por lo que puede ser que la voluntad clara aquí. Por lo tanto, lo que usted hace supongamos que este es su gen y usted quiere editar este gen, usted quiere interrumpir este gen, lo que usted puede hacer usted puede, usted puede elegir una secuencia objetivo typicallyhere. Y hay un requisito que es Así, usted puede apuntar a su región que está cerca de la secuencia PAM, y usted puede generateguía de ARN que es específico para esta secuencia. Y entonces usted clone esta guía de ARN en un vector y el mismo vector que puede clonar Cas 9 y la proteína de endonucleasa. Y entonces cuando usted toma esto y hacer una planta transgénica tanto los dos socios expresará allí. Entonces lo que va a pasar esto es un ARN guía, esta es la proteína Cas 9, cuando la proteína Cas 9 se une con el ARN guía, el ARN guía se dirige a estos endonucleasas en la forma de secuencia.Y cuando este endonucleasas se recluta en el genómico copia, hará una doble interrupción en la copia genómica, y entonces que este descanso ha sido considerado como un DNA.Y el mecanismo endógeno dañado que se llama el mecanismo de unión final no homólogo será activado en la planta y se llenará este vacío, se reparará aquí. Pero durante el proceso de este es el mecanismo de unión final hay una posibilidad de que usted puede generar una eliminación, usted puede generar una inserción, usted puede interrumpir la región de codificación, y es como usted tendrá una interrupción genómica de un gene.Así, esto es algo del método que se está utilizando para hacer el knock-out Otro mecanismo lo que estamos usando para estudiar la pérdida-de-función es el derribo o la minimización.Así, aquí no estamos interrumpiendo la copia genómica, pero estamos regulando después de la transcripción.Así, estamos reduciendo el nivel de expresión ya sea a nivel de proteína o a nivel de transcripción.Y hay algunas de las técnicas que se están utilizando para esta función; una es la tecnología de ARN anti-sentido, esta fue una de la técnica pionera que se ha utilizado, pero en estos días hay muchas más tecniques.Así, el segundo método es la interferencia de ARN de doble cadena o micro RNA.So artificial, en el ARN anti-sentido lo que sucede que si usted tiene un gen y usted sabe la secuencia genética, usted acaba de tomar el mismo gen o el gen específico fragmento del gen y clon en el anti-senseorientation.Entonces, qué es usted esperting.Así, si es una copia genómica de su gen, que transcribirá en esta dirección, pero ahora usted ha generado otra transcripción que es complementaria a este endogenousestranscript porque es anti-sentido orientado y entonces esta transcripción irá y se vinculará con la transcripción endógena, y entonces esta transcripción o se degradará o se inhibirá para la síntesis de proteínas y usted tendrá el fenotipo. Este es un ejemplo de que hay pocos genes ha sido blanco a través de ARN anti-sentido, se puede ver, este es el promotor y los genes ha sido y la región específica del gen se ha clonado en la orientación anti-sentido. Y cuando usted tiene la unidad de estos genes, usted puede básicamente suprimir el gen endógeno usingeste método como usted puede ver el fenotipo. Así, esto es control, cuando los genes se ha suprimido, hay muchos defectos de desarrollo. Y cuando se comprueba el nivel de ARN o el nivel de transcripción, se puede ver claramente que como comparedto los controles en esta línea anti-sentido, allí es una reducción significativa del nivel de la transcriptasa. Pero hay algo importante si usted mira esta línea, aquí almostdown regulado, pero estas líneas son parciales abajo regulation.Así, esto no es una especie de mutante nulo, pero esto es una especie de regulación.Así, usted puede tener aquí un gradiente o usted puede tener algunas líneas donde usted tiene cerca del fenotipo de la ulgull, pero algunas líneas que usted podría tener que son líneas débiles, allí la regulación hacia abajo no es tan eficiente.Esta tecnología se desarrolló a partir de los mecanismos endógenos. Por lo tanto, en las plantas el siRNA y los micro RNAs se conocen como un mecanismo de regulación del pozo. Hay un gran número de ARNs pequeños, y están regulando la expresión de muchos manyimportante gene.Así, si usted mira un mecanismo general, hay dos maneras, o usted tiene un doble estrandedRNA o ARN del pelo, esto será sometido al proceso de procesamiento a través de DICER o procesamiento AGOmediado, a continuación, la carga. Esto no voy a entrar en el detalle; Estoy seguro de que usted ya habría estudiado. Y entonces se genera un muy pequeño de 21 a 24 de un solo estándar de nucleótido RNA antisentido. Y estos ARN pueden ir y emparejar con ARN mensajero endógeno, y entonces ellos o bien targetque el ARN mensajero para la degradación o pueden inhibir la síntesis de proteínas o la regulación epigenética de cualquier tipo de regulación es posible.Así, para hacer eso, si usted quiere utilizar esta tecnología, así que lo que usted puede hacer usted puede generar su construcción de interferencia de ownRNA para un determinado genes.Usted tiene que simplemente imitar esta generación de peinados, cómo puede hacer, puede hacer usted puede hacer un fragmento de gen específico y clonar en la orientación de sentido, y luego poner una secuencia no específica aquí o fragmentos de relleno aquí, fragmento de linker, y luego se toma el mismo el samefragment y clonar en sentido descendente, pero en la orientación opuesta. Si esto es en la orientación de sentido, esto se pone en la orientación antisentido y el promotor de puta aquí, conducir este lazo de perno de pelo. Entonces, ¿qué va a pasar?Este ARN mensajero que hará que hará un este tipo de una estructura. Por lo tanto, esta región y esta región se emparejarán aquí. Y generará una estructura de horquilla, y esto se procesará de forma endógena y luego generará siRNA.Y este siRNA específicamente se dirige al ARN endógeno o ARN mensajero contra el wichit ha sido diseñado, y entonces se va a abajo regular la expresión de esos genes. Hay un montón de ejemplos de interferencia de ARN se ha utilizado para regular el gen. Algunos de ellos voy a mostrar aquí. Por lo tanto, si usted mira aquí dos de los genes se ha regulado por el enfoque basedapproach de interferencia de ARN. Usted puede mirar aquí esto es el blot norte en el control hay alto nivel de expresión, pero en la línea de interferencia de ARN el nivel ha disminuido significativamente. Y usted puede ver el fenotipo de la panícula fenotype.Del mismo modo, este es un factor de transcripción muy importante MADS 1.Y cuando la línea de interferencia de ARN se generó para el MADS1 usted puede ver esto es el norte blotagain. En tipo salvaje, usted tiene un nivel muy alto de expresión, pero en ARN de interferencia de la línea de la expresión endógena es casi nulo. Mientras que usted puede detectar la estructura del pin del pelo que es básicamente más grande del tamaño. No sólo que si usted va y hacer un blot norte muy espacial, usted puede detectar pequeños siRNAsas well.Así, estos son los siRNAs pequeños que no está presente en el tipo salvaje, pero que es presentin el ARN de interferencia line.Así, esto ha sido muy ampliamente utilizado para abajo Entonces el tercer método que se ha utilizado para hacer mutantes en cadena de derribo son microRNA.So artificiales, ya que dije que el micro ARN es un ARN pequeño natural presente en el genoma de las plantas, que se procesan a través de dicer y hace un mecanismo mutado. Y entonces este micro ARN, que van y apuntan específicamente a algunos de los genes, y la regulación de su expresión en el nivel diferente, transcripcionalmente, post transcripcionalmente, translacionalmente, epigenética.Y entonces esta técnica fue tomada y luego utilizada para generar un micro RNA.So artificial, básicamente lo que usted hace que si usted toma una estructura de horquilla natural o el lazo del micro ARN natural existente, y si usted puede reemplazar este núcleo secuencias de las secuencias de microARN que es básicamente mostrando la complementariedad con el gen. Y si usted reemplaza con su propio gen de interés, puede usted abajo regular. Y entonces esto puede ser fácilmente hecho por la combinación de múltiples PCR.Así, por ejemplo, si esta es su construcción aquí usted puede utilizar un conjunto diferente de primersyou puede amplificar esta región de aquí a aquí, entonces Usted puede ampliar esta región de aquí a aquí, y usted puede amplificar esta región de aquí a aquí. Por lo tanto, básicamente este rojo es su secuencia de micro ARN artificial. Entonces si usted utiliza estos tres como una plantilla juntos y utilizar estos dos primers, así que usted puede combinarlos de esta manera.Y luego este micro ARN artificial, usted puede clonar bajo promotor y luego generar una línea de eliminación. Y si usted ve aquí esto ha sido bastante utilizado con éxito en algunos de los estudios.Por ejemplo, si usted toma este ejemplo de Arabidopsis, en Arabidopsis, esto es leafymutantes, por lo que esto es básicamente un mutant.Así que, si usted mira LEAFY12, esto tiene un fenotipo significativo en comparación con el tipo salvaje. Pero si usted apunta a este FRONDOSO a través de micro ARN artificial contra el FRONDOSO, usted puede imitar el fenotipo. Así, su micro ARN artificial aquí es tan fuerte como los otros mutantes. Similar es el caso si usted mira ft mutant.Así, el mutante de ft, si usted mira el tipo salvaje, la planta ya está floreada se ha alcanzado la etapa reproductiva, mientras que, este mutante de pies tiene una floración muy retrasada. Pero si usted generar de nuevo micro ARN artificial contra el FT, se puede ver que se está mostrando un fenotipo grave como el otro mutant.Así, esto dice que el ARN micro artificial es uno de la manera muy eficiente de la baja regulategenes en Arabidopsis.Y similar tipo de cosas se ha utilizado en otras especies de plantas. Por ejemplo, si usted toma el caso de la rice.Así, aquí se ha generado micro ARN artificial para un par de genes.Así, esto es el SPL11, y este es el gen PDS. Y usted puede ver claramente este es el control y este es el ARN o micro RNAline artificial y se puede ver el fenotipo claro en las líneas de micro ARN artificial. Por lo tanto, básicamente; así que a través de este estudio, ya sea que usted va a través del estudio basado en knock-out o pasar por el estudio basado en la cadena de derribo.Lo que usted concluye que usted puede generar una pérdida de mutantes funcionales y usted concluye que estos genes son necesarios para esta función en particular. Otra forma complementaria como dije que es ganancia de funciona.Así, en primer lugar que podemos generar ectopic sobre la expresión o la construcción de la expresión ectópica. Aquí lo que usted hace, usted utiliza algún promotor más amplio o un promotor que se expresa en el nivel alto. Y usted puede utilizar cualquiera de los tejidos promotor específico para el tejido donde su gen endogenouslyno expresa o usted puede utilizar una especie de promotor 35S general o promoción de Ubiquitin para conducir su gen en el sentido Y entonces usted puede tener alto nivel de expresión en el tejido donde usted no espera que su gen endógenamente presente. Y si usted mira los casos en este mutante, usted puede ver claramente que este es su nivel de base de expresión, pero cuando usted tiene sobre expresado bajo el promotor de 35S, usted puede ver que en la mayoría de las líneas el nivel de expresión es muy alto en comparación con el control. Y usted puede ver aquí la expresión relativa y entonces esto es co relacionado con el fenotipo. Por lo tanto, esto es y entonces si usted puede ir a la siguiente generación, usted puede ver claramente esto es una de la línea se ha probado en la próxima generación, así que puede estar aquí la linesis segregando. Si usted mira esta planta, no está mostrando fenotipo, pero estas dos plantas están showel fenotipo. Y si usted va y comprobar el nivel de expresión sobre, claramente co relate.Así, esta planta que no tiene fenotipo no muestra la expresión sobre también. Pero estas dos plantas que muestran la sobreexpresión, muestran el fenotipo. Tipo similar de análisis se ha hecho para el factor de transcripción MADS1.Y usted puede ver claramente cuando MADS1 fue ectopicamente sobre expresado en arroz transgénico, usted puede ver un fenotipo muy significativo en la arquitectura del panículo y en el Y si usted ve el nivel de expresión, puede ver claramente que en el control usted hace la expresión de nothave en este tejido, pero estas líneas que tienen un nivel muy alto de expresion.Así, otra manera de generar un mutante de ganancia de función es el etiquetado de la activación. En la activación de etiquetado básicamente lo que usted hace tomar T-ADN construcción, y usted sólo putque copia múltiple de elementos potenciador. Aquí usted puede tomar 4 x copia del elemento potenciador 35S. Y luego lanzar al azar en el genoma y se va e integrar, pero lo que sucede que si viene en una proximidad con algunos de los promotores basales o algunos de los promotores que normalmente se expresa en el nivel muy bajo o normalmente no se expresa. Pero ahora el promotor tiene algo del elemento potenciador en la proximidad cercana y entonces el promotor iniciará la actividad que comenzará muy fuerte expresión. Y en ese caso, lo que sucederá que usted verá un fenotipo que podría ser el resultado de la ganancia del fenotipo de la función. Estos son algunos de los ejemplos. Por lo tanto, si usted mira aquí, hay una inserción de elementos potenciador aquí. Y si usted mira el resultado de esto es que si usted mira este gen, este gen es más expressedin las líneas de inserción de líneas que el Por lo tanto, si usted mira aquí, y entonces usted puede ver esto hay algo del fenotipo de esta línea. Por lo tanto, básicamente esto se llama etiquetado potenciador, usted puede buscar muchos más genes e identificar más líneas de etiquetado de activación y usted puede llevarlos para el estudio de la función. Por lo tanto, esta es una forma típica de estudiar funcionalmente el gen en planta, pero hay algún problema. Por lo tanto, supongamos que si usted quiere estudiar la función de algunos de los genes esenciales, los cuales, si usted hace un knock-out o si usted hace un knock-down, si el gen es esencial youface un problema de letalidad.Si es letal, si la pérdida de función es letal o el aumento de la función es letal, usted no tendrá planta transgénica o no tendrá una planta para estudiar.En ese caso, ¿cómo resolver el tema?Algunos de los genes son muy importantes en una fase muy temprana durante el desarrollo del embrión. Por lo tanto, podrían ser letales embrionarios algunos del gen podría ser no embrionario letal, pero podrían ser letales en la etapa de semillero o en cualquier etapa que completen su crecimiento vegetativo, pero no pueden entrar en la fase reproductiva. Por lo tanto, básicamente no harán una flor fértil, no harán semillas que no pueden ir a la próxima generación.Así que, si usted quiere estudiar este tipo de genes a través de la genética inversa basada en la forma de hacerlo. En ese caso, lo que tiene que hacer usted tiene que utilizar un gen regulado Así, no se puede tomar un gen o se puede regular todo el tiempo o se puede regular de forma regular o se puede sobre express constitutivamente.Si usted hace eso, usted no será capaz de estudiar.Entonces lo que puedes hacer, puedes generar un constructo o puedes hacer una estrategia donde puedes regular de manera específica un gen siempre que quieras o puedes tener una especie de regulación de base temporal y espacial más temporal de tu gen silenciador o sobreexpresión. Por lo tanto, hay tres maneras en que puedes regular el gen típicamente uno es el regulatedconstructo.Así, lo que puedes hacer que en lugar de sobre expresar un gen en todos los tejidos, te metas la sobreexpresión en un poco del tejido donde sientes que podría no ser tan dañino que la itwill tendrá letalidad.Para este tipo de cosas usted puede utilizar algunos promotores específicos del tejido o el promotor conocido que se expresa en un órgano en particular, por ejemplo, usted puede comprobar en la hoja y usted puede ser el promotor específico de la hoja de la hoja, y expresar una flor en la hoja y mirar puede iniciar parte del programa de desarrollo específico de la flor en la hoja. Segundo modo de regulación lo que usted puede hacer es la construcción de regulación temporal. Aquí lo que usted puede hacer usted quiere expresar o abajo regular un gen en un stagenot particular antes de eso. Por ejemplo, supongamos que la regulación de un gen X es letal embrionario, que si usted baja En ese caso, lo que usted puede hacer, y si usted quiere estudiar el papel de este gen maybein el desarrollo vegetativo o tal vez en el desarrollo reproductivo, entonces usted no necesita para abajo regular o el silencio o sobre expresar este gen durante el proceso de embriogenesis.Así, lo que usted puede hacer, en ese caso usted puede ser un promotor específico de la etapa para la construcción de la construcción de la construcción de RNAi construir o cualquier construcción. Y entonces lo que usted puede hacer puede saltarse su etapa temprana de embriogenesis.Así, la embriogénesis se producirá En segundo lugar, se puede incluso combinar ambos y se puede generar un constructo donde se puede juntar ambos juntos. Por lo tanto, se puede regular un gen o una construcción sobre la expresión, RNAi construir temporalmente, así como espacialmente.¿Cómo puedes hacerlo?Por ejemplo, si usted está estudiando un factor de transcripción, hay un sistema que está siendo ampliamente utilizado es un sistema basado en el receptor de glucocorticoides. Por lo tanto, sabemos que los factores de transcripción, que tienen que entrar dentro del núcleo para activar la expresión génica. Y si de alguna manera los retiene en el núcleo y si usted puede regular su translocaciónentre el citoplasma y el núcleo, usted puede regular su actividad y que se está haciendo fusingsu factor de transcripción con una rata o ratón glucocorticoide receptor.Así, glucocorticoide básicamente es un esteroide hormona en los animales y lo que sucede que los receptores glucocorticoides que normalmente están presentes en el citoplasma, cuando reciben a través de las hormonas, entonces lo que sucedió que sólo entonces entran dentro del nucleusand go y activan sus genes.Así, si tomo un gen aquí es el ejemplo de MADS 1; si tomo MADS1 gen y fusible withdelta GR y sobre-sobre-prensa bajo cualquier promotor amplio no importa aquí, 35S promotor. Entonces lo que va a pasar en condiciones normales, tengo un alto nivel de MADS1 expresado, proteinis ya se hizo la proteína de fusión, MADS1 delta GR, la proteína de fusión ya está hecha es listo, pero sólo está presente en el citoplasmoDesde, MADS1 es un factor de transcripción hasta y a menos que entrará dentro del núcleo, no puede realizar la función. Entonces si tomo esta planta e inducir con la hormona que estamos usando aquí la dexametasona, entonces qué pasará entrará en el núcleo y puede activar el gen. Y esto es técnica muy importante, que usted puede utilizar para distinguir incluso entre directgenes que son regulados directamente por el MADS1 o el gen que son consecuencia de la inducción MADS1. Por lo tanto, si usted combina este tratamiento con dexametasona con la síntesis de proteínas inhibidores de cicloheximida.Así, supongamos si este es ejemplo de OsMGH3; OsMGH3 como he dicho anteriormente que este es uno de los genes que se regula por MADS1.Y lo que sucede, cuando se trata con la dexametasona se puede ver en un punto en particular el nivel de expresión de OsMGH3 está subiendo, lo que significa que MADS1 es suficiente para activar la expresión de OsMGH3.Pero cuando se trata con el cicloheximida, por lo que básicamente cicloheximida es un sintetizador de proteínas. Por lo tanto, no permitirá que la nueva proteína se sintetiza, en ese caso, cualquier proteína MADS1 es la proteína delta GR. que entrarán dentro del núcleo y que activarán genes inmediatos, pero aquellos genes que se están activando a nivel de transcripciónesos ARN no harán proteínas, porque hay proteína de cicloheximida. Y si no se hace proteína, no se activará el objetivo. Por lo tanto, el objetivo indirecto MADS1 no se activará, pero el objetivo directo se activará y es como se puede ver aquí, cuando tratamos la dexametasona y el cicloheximida juntos no se puede ver la activación de OsMGH3.Esto dice que OsMGH3 no está regulado directamente por MADS1, pero está regulado indirectamente por MADS.Y luego si usted mira este constructo, esta es otra construcción muy importante. Por lo tanto, este es un caso cuando usted abajo regula el gen MADS1 lo que sucede que todos los órganos florales son defectuosos, usted no hará una semilla fértil. Usted puede ver aquí esto son los órganos florales, todos se están convirtiendo en likestrutura de la hoja o tipo de lema palea como la estructura y usted no tendrá organo.Así, es muy difícil para la próxima generación es casi imposible. En ese caso lo que usted puede hacer?Usted puede hacer una fusión MADS1 delta GR, así como micro ARN artificial y luego lo que usted hace, normalmente este micro ARN artificial suprimirá el gen que tiene el fenotipo, pero si usted crece en presencia de dexametasona este delta GR irá andit complementará el fenotipo. Por lo tanto, este constructo tiene sobre la expresión, así como el ARN micro artificial, pero importantthing aquí es que este micro ARN artificial está diseñado para apuntar a 3 prime untranslatedregion de la MADS1 y que 3 prime no traducido región no está presente aquí. Aquí hemos tomado MADS1, lo siento aquí hemos tomado MADS1 sólo hasta el codon stop, untranslatedregion no está presente por qué, si tomamos esa región, entonces este micro ARN artificial irá y silenciará este gen como bien. Por lo tanto, en este constructo este micro RNA silenciará específicamente la copia endógena del gen, pero no silenciará la copia transgénica y de esta manera usted puede usar un análisis basado en la complementariedad y hacer lo que sea, el análisis fenotípico o usted puede ir incluso identificar el downstreamtarget, el objetivo directo aguas abajo para estudiar.Usted puede ver aquí, cuando usted induce con la proteína de dexametasona se está localizando al núcleo, pero cuando usted no induce, usted no ve la proteína dentro del núcleo. Otra manera muy importante, la técnica que se está usando para regular tanto el aswell temporal como la expresión espacial, simultáneamente es el sistema de las bases de XVE o el receptor de estrógeno-basedsystem.So, aquí básicamente lo que ha sido done.Así, un factor de transcripción quimérico se había generado, así que este XVE; XVE es un factor de la transcripción de la quimerica, aquí hay tres componentes uno es X, V y E. X es un dominio del ADN de la proteína de LexA, LexA es de Y luego V es el dominio de activación trans de la proteína VP16 que es de virus. Y entonces E es el receptor de estrógeno humano.