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Module 1: Genética molecular del desarrollo de plantas

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Patrón de expresión diferencial

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Bienvenido de vuelta al curso de la Biología del Desarrollo Vegetal.Así que, en la última clase estábamos discutiendo enfoques basados en la genética inversa, que estamos siendo, que estamos tomando, para estudiar el desarrollo.Así que, en esa clase hemos cubierto la identificación y el aislamiento de los genes para los funcionarios del desarrollo.Ahora, comenzamos los enfoques funcionales basados en la genómica. Por lo tanto, en los enfoques basados en la genómica funcional, lo que discutimos el primer paso fue la expresión de la monitoringgene. Y ahora, así que hemos visto cómo comprobar el patrón de expresión de los genes.Ahora, nos enfocaremos sobre todo en los genes globales. ¿Cómo estudiar el patrón de expresión de los genes Globales?¿Y cuál es la manera de estudiar el patrón de expresión?Lo importante aquí es que, de nuevo, se puede solucionar el problema. Así, el objetivo principal de un análisis genómica o global de la expresión génica es, para identificar los genes diferenciales en diferentes condiciones. Puede ser diferentes órganos, puede ser diferentes tejidos, puede ser diferentes etapas, puede ser diferentes condiciones entre un tipo salvaje y mutantes cualquier combinación. Lo que usted puede elegir con respecto al desarrollo y luego tomar los enfoques genomicsbased e identificar todos los genes que son diferencialmente expresados en betweentwo condiciones dos órganos o lo que sea. Y hay muchas maneras de estudiar un Por lo tanto, voy a enumerar algunos de ellos aquí, pero nos enfocaremos sólo en few.Así, estos fueron la manera de estudiar.Primero fue el análisis serial de la expresión génica, SAGE.Aquí la gente empezó obteniendo algunas etiquetas de secuencia corta de un gran número de cDNAclones.Y ellos, entonces estaban secuenciándolo e identificando el patrón de expresión del gen diferencial. Entonces otra manera era la pantalla diferencial RT PCR, aquí lo que la gente solía hacer, la yusa para tomar una población de ARN total, ellos solían hacer cDNA.Se usaron para ejecutar un gel y luego tratar de identificar qué banda en particular está desaparecida en una condición y presente en otra condición o viceversa. Y luego se usaron para cortar esa banda, amplificar el fragmento, clonar, secuenciar e identificar lo que son los genes. Otra forma de hacer fue la hibridación subtractiva, esto fue la amplificación basada en PCR de sólo cDNAfragment que difiere entre dos condiciones. Y por lo tanto, básicamente aquí lo que solía hacer, había dos población del ARN mensajero, usted hace cDNA entonces hacer la resta, restar. Después de la sustracción, usted identifica o aísla sólo a aquellas poblaciones que son diferencialmente expresados y luego específicamente usted puede amplificarlos y luego identificarlos. Entonces la técnica, esta técnica fue muy ampliamente utilizado en la mayoría de la base de la genómica basedexpression, patrón de expresión diferencial, el análisis que era micromatriz.Microarray era la técnica, donde pequeño fragmento o pequeño oligo pequeño oligosfueron vistos en un chip y luego el ARN total tal vez estaba, aislado de una condición particular para identificar la expresión diferencial. Veremos micromatriz de ARN micro en gran detalle, cómo esto se ha utilizado. Y esta es una de las tecnologías más utilizadas en la biología del desarrollo de la planta.Y ahora recientemente la secuenciación de la próxima generación, en realidad ha cambiado todo el escenario. Ahora estamos haciendo mucho de la secuenciación de ARN y esto tiene muchos beneficios sobre la micromatriz.Por lo tanto, estos son los diferentes métodos que se están utilizando para estudiar el patrón diferencialexpresión en diferentes condiciones o procesos de desarrollo diferentes. Por lo tanto, yo antes de ir a la secuenciación de ARN micro y ARN en detalle, daría algunos de los ejemplos típicos de diferentes tecnologías, que se utilizó. Por ejemplo, si usted mira esto, esta investigación aquí el perfil de la transcripción se hizo en forma de semilla de arroz utilizando SAGE como un método. Así, esto fue utilizado y la gente ha identificado la expresión diferencial aquí. Entonces este es un ejemplo, donde la pantalla diferencial RT PCR fue done.Así, esto es Caja MADS que contiene factor de transcripción en el arroz. Y lo que era importante aquí que, este gen que es MADS 1, se expresó en el equivalente. Lo que en el caso del arroz, es lema y palea, pero no se expresó en el órgano interno. Pero cuando el gen fue mutado, cuando este gen fue silenciado, el efecto también fue visto en los órganos internos, los órganos florales internos, por ejemplo, lodicules, estampados. Entonces, esta fue la pregunta de que, si el gen no está presente en este tejido, ¿cómo se está regulando?Por lo tanto, una de las posibilidades era que, tal vez se está activando porque en una etapa muy temprana, se expresó a lo largo de la primidia.Así, se planteó la hipótesis de que tal vez, está activando algunos reguladores tempranos en la etapa muy temprana, cuya expresión es básicamente allí en los órganos florales internos y regulándolo. Para identificar tal tipo de gen, la pantalla diferencial RT PCR fue tomada y entonces uno de estos genes fue identificado que era OsMGH3.Y se demostró que en realidad OsMGH3 se expresó en los florales, organs.Así, esto es de nuevo si usted mira, esto es el blot norte y si usted mira el expresión patternof OsMGH3, se puede ver que en el tipo silvestre, la vaina de la hoja no se expresa mientras que, en la panícula joven, la panícula es la inflorescencia en el caso del arroz, tiene un nivel muy alto de expresión. Pero si usted se ve una panícula que es la panícula mutante, donde MADS1 está regulado, la expresión de OsMGH3 también desaparece. Lo que significa que primero que, hay un órgano específico o la regulación específica del tejido de este gen. El gen sólo se expresa en la panícula, no en la vaina de la hoja y es la expressiono es la activación depende del MADS1.Así, este es un ejemplo de la pantalla diferencial RT PCR.A continuación, se utilizó la hibridación subtractiva en este estudio.Donde han hecho un análisis comparativo de la transcripción de la expresión génica entre la variedad de semillas y su tipo salvaje durante el desarrollo y el órgano floral y no voy a entrar en detalle. Entonces la técnica que, de la que iba a hablar es la micromatriz.Así que, como dije que la micromatriz es una especie de chip.Así, este tipo de chip se generó y esto fue muy ampliamente utilizado en la era post genómica, antes de la secuenciación de ARN. Una vez que el genoma fue secuenciado, identificamos los genes, identificamos la secuencia de todos los genes. Entonces esos genes, las sondas para esos genes fueron diseñados y estas sondas fueron potestedina estos chips.Así, para cada gen que teníamos una especie de sonda. Y entonces había dos formas de identificar la expresión diferencial, uno era los dos colorway y una forma de color.Así que, de una manera de color lo que tienes que hacer, supongamos que, usted quiere probar una muestra de tipo salvaje que es su prueba o sample.Así, usted quiere identificar los genes que son expresados diferencialmente entre este tipo salvaje y este mutante. Y lo que usted puede hacer, usted puede extraer el ARN total del tipo salvaje, el ARN total de los themutants entonces usted etiqueta este RNA.Y una forma de etiquetado era, la biotina etiquetada de la síntesis de ARNm, ambos fueron básicamente labeled.Así, toda la población de ARN en estas dos condiciones, fueron etiquetados y luego esto etiquetado como ARNm se reutilizó para hacer la hibridación en los chips. Así que ahora, estos chips contiene, genes globales todos los genes representados en una cantidad igual. Ahora, ya que vamos a suponer que, hay un gen A, que es más en caso de tipo salvaje, butit se está bajando regulado en caso de mutante. Entonces usted está esperando más de ARNm en tipo salvaje, menos ARNm en mutante. Y cuando usted se hibridiza en el chip, usted está esperando más señal para esa sonda en caso de tipo salvaje, mientras que, menos señal en caso de mutante. Y entonces si usted compara la intensidad de la señal, usted hace la exploración de adquisición de datos y si calcula el valor absoluto de la hibridación, usted puede identificar la diferencia en el patrón de expresión del gen A entre la naturaleza Y luego, otra forma de análisis fue que supongamos, el caso similar que tiene el ARN del tipo salvaje, usted tiene ARN mutante y entonces usted toma el ARN total de ambos la muestra. Y entonces usted los etiqueta con dos diferentes tintes por ejemplo, esto es cy5, esto es cy3,cy5 dará color rojo, cy3 dará color verde y entonces usted toma igual cantidad de totalcRNA e hibridze en el mismo chip.Así, básicamente la diferencia entre estos dos métodos era, aquí tanto los cRNAs, wecrecNAs fueron etiquetados con la misma etiqueta, mientras que están etiquetados con las etiquetas diferentes. Aquí fueron sonados, fueron Por lo tanto, supongamos que si hay un chip que es para el gen A. Ahora normalmente si el nivel de expresión de A es el mismo en el tipo salvaje y mutante, entonces usted está esperando la misma cantidad de cRNA de 5label y cARN de nivel cy 3 para ir e hibridar con este particular probe.Así, usted está esperando la misma cantidad de señal roja, la misma cantidad de señal verde y el resultado será señal amarilla aquí. Pero si alguno de ellos son diferencialmente presentes por ejemplo, si la expresión es más en el tipo salvaje entonces usted está esperando más señal roja que el verde y entonces el color de estos puntos cambiará, será más hacia el rojo. Si el gen está abajo regulado entonces será más hacia el green.Así, con base en este color y luego la cuantificación usted puede realmente calcular el cambio de pliegue entre el tipo salvaje y mutante para todos estos genes. Estas técnicas que usted también puede utilizar para las diferentes etapas, no es sólo en el tipo salvaje y mutante. Por ejemplo, si usted toma este caso particular. Por ejemplo, ¿dónde lo que la gente ha estudiado?La gente ha estudiado los genes que son expresados diferencialmente, en el desarrollo diferente del desarrollo del cultivo del arroz o el desarrollo de la flor. Así, por ejemplo, si usted toma estas etapas, esta es la etapa 0 que es básicamente la fase vegetativa y este es su rodaje apical meristem. Extracto el ARN total de la fase vegetativa y luego usted esta es una transición de la fase reproductiva de la fase reproductiva. Luego, después de la transición, esta inflorescencia está experimentando una etapa diferente del desarrollo. Así, lo que la gente ha hecho, han tomado ARN de aquí de todas estas diferentes etapas y han realizado el análisis de microarray en gran detalle. Y esto cómo ellos realmente podrían identificar varias cosas, lo primero que podrían identificar el gen que está presente en una etapa de desarrollo particular, pero ausente en la etapa de desarrollo diferente del desarrollo. O un gen particular, cómo es el patrón de expresión dinámica se encuentra a través del desarrollo. Por ejemplo, algunos genes pueden ser 0 aquí y luego se activan de repente y se mantienen O se activan en este dominio del desarrollo y luego se van abajo. Por lo tanto, este es un patrón de expresión básicamente dinámico que puede analizar, usando esta tecnología.Y esto todo, lo estamos haciendo a nivel global y podemos identificar.Por ejemplo, si, el alguno de los genes, se ha probado aquí. Por lo tanto, usted puede comprobar esto es RT análisis PCR. Si usted ve el gen LAX, el gen LAX es muy bajo en 0 etapa, pero a través de las etapas 1 2 34 5 el nivel de expresión está aumentando, mientras que si usted toma este FZP que es FRIZZY PANICLE, esta es la expresión comienza o se activa sólo desde la etapa 4 en adelante y continua la etapa 5.No está presente en la etapa inicial, mientras que este MADS3 se está activando en stage5.Así, así es como esa micromatriz fue extremadamente útil, en el estudio de este tipo de análisis de la expresión diferencial del genoma. ejemplo de un microarray que fue usado y aquí usted puede mirar aquí que, ellos han centrado su estudio en la caja del MADS que contiene los genes. ¿Por qué me estoy enfocando más en la caja del MADS que contiene el gen?Debido a que esta era la clase, que está bien establecida para regular una gran cantidad de procesos de desarrollo, son muy importantes con respecto al desarrollo de la planta. Y aquí han tomado gran cantidad de tejidos de hoja madura, raíces, 7 días de semillero y luego esta panícula, diferente tamaño de la panícula. Diferente tamaño de la panícula o inflorescencia significa diferentes etapas de desarrollo en caso de este. Y entonces han comprobado el patrón de expresión, a través de análisis de microarray. Y lo que pueden identificar, hay muchos genes.Así, si usted mira la expresión es aquí. Así, si el verde es menos Y luego usted puede ver que un gen en particular, si usted va a través de los diferentes órganos que usted puede ver su expresión. Cómo los patrones de expresión están cambiando de una etapa de desarrollo a otra etapa de desarrollo o un tejido a otro tejido. Así que esto, este fue un estudio importante.Hoy en día es la secuenciación de ARN, esta es la secuenciación de próxima generación es muy barato y muy fácilmente disponible.Así, ahora, la gente está haciendo la secuenciación de ARN y la secuenciación de ARN tiene algunas ventajas sobre la matriz.Primera ventaja es que, para la micromatriz para generar los chips hay que tener la información de secuestro, lo que significa que los genomas del organismo tiene que ser secuencia, entonces y sólo entonces, usted puede definir sondas para el chip. Pero en la secuenciación de ARN, el genoma incluso el genoma no está secuenciado, se puede estudiarlo a través de la secuenciación de ARN. Segunda cosa importante, un proceso muy importante en el organismo eucariota es alternativeARN splicing. Alternativa de RNA es como, si un gen tiene múltiples intrones.Así, supongamos que esto es intron 1, intron 2, intron 3.Así, hay un gran número de regulación de genes se produce en el nivel de empalme. Por lo tanto, el empalme alternativo esencialmente proporciona, una oportunidad para generar más de un tipo de proteína a partir de un solo gen, sólo por alternar alternativamente los diferentes intrones. Por ejemplo en un ARN mensajero, usted puede generar desde aquí si se empalman todos los intrones. Entonces usted puede generar un ARN mensajero, donde usted no empalmes intron 1 o usted no spliceintron 2 o usted no empalmes intron 3 o se empalme individuo, usted puede incluso saltarse los intrones, usted puede empalar este exón junto con el intron.Así, esto proporciona un gran número de diferentes transcripciones del mismo gen. Y es muy difícil o es muy difícil mantener las sondas para toda la variante de empalme en la cadera, en el experimento de microarray. Por lo tanto, fue muy difícil porque si usted no sabe, cuántas variantes de empalme existen para un gen en particular, es muy difícil. Porque normalmente cuando usted está diseñando el chip, usted solía mantener uno o tal vez dos o tal vez tres chips para un particular tres oligos para un gen en particular. Pero si hay algún intrón aquí, usted no tendrá intrón o variante de la variante de un especfichips. Pero en caso de la secuenciación de ARN, básicamente puede capturar todas las variantes.Así, si usted mira la técnica ¿Cómo funcionan las secuencias dePor lo tanto, básicamente lo que hacemos en la secuenciación de ARN, usted extrae el ARN mensajero total y luego usted puede eliminar específicamente el ARN mensajero del RNA.total ¿Cómo puede hacer eso?Todos ustedes saben que el ARN mensajero que tienen la cola de poli A en los tres primeros extremos y thenyou puede usar oligo dT etiquetado con algún tipo de cuentas. Y usando este sistema, usted puede específicamente eliminar el ARN mensajero de la población total de ARN. Y entonces usted utiliza este ARN y usted puede hacer el fraccionamiento usted puede hacer una pequeña fragmentación de ARN y luego utilizar algunos cebadores aleatorios. Los cebadores aleatorios son básicamente pequeños seis nucleótido largo de nucleótido primario con diferentes secuencias.Así, puede ir al azar y enlazar diferentes lugares y entonces usted puede hacer el primer strandcDNA, síntesis de la segunda hebra de síntesis de ADNc. Así, básicamente usted están generando un cDNA de fragmentos pequeños diferentes y diferentes y es un ADNc de doble tamaño.Y entonces una cosa importante, lo que usted puede hacer, usted puede poner el fosfato, normalmente los cebadores que no tienen fosfato en su end.Así, entonces usted puede poner proporcionar fosfato porque si usted tiene que usar esto para el proceso de ligadura adicional, si no tienen fosfato en su extremo, entonces no pueden hacer una fosfodiesterbond.Así, usted puede hacer la reparación final poner el fosfato. Y otra cosa lo que usted puede hacer, usted puede agregar flanking A, esto usted puede hacer usando la polimerasa de la poliA y luego si usted agrega esto Una cola, esto le proporcionará para tomar este fragmenta y agregar algún adaptador así, usted puede ligate adaptador. Este adaptador puede tener un estiramiento de T. Así, T y A, ellos irán y ellos se annealto entre sí y luego usted puede realizar una reacción de ligadura. Así, esencialmente lo que está generando, usted está generando doble cadena de ADN varadas con el adaptador en ambos el extremo. Y entonces usted sabe la secuencia de este adaptador usted puede utilizar esta secuencia de adaptador y usted puede tomar y secuenciar toda esta población de ADNc. Esto es muy ampliamente utilizado estos días y esto se puede utilizar para identificar.Por lo tanto, si usted toma dos poblaciones diferentes de ARN, dos poblaciones diferentes de entonces usted puede generar dos diferentes poblaciones de ADNc fragmentadas.Y si usted las secuencian y las comparan, usted puede identificar el nivel de expresión diferencial de diferentes RNA.Así, de nuevo voy a dar algunos de los ejemplos, donde la secuencia de ARN se utilizó para identificar el patrón de expresión diferencial. Por ejemplo, si usted toma esto. Por lo tanto, aquí diferentes frutos de etapa fueron tomados y el total de ARN fueron extraídos y el ARN secuestringwas hecho. Y usted puede ver claramente diferentes genes y su patrón de expresión. Por ejemplo, si usted mira aquí. Así, si usted mira este gen, o cualquiera de este gen, esto tiene una expresión muy baja en esta etapa, pero si usted viene aquí al final de esta etapa el nivel de expresión Así, esto nos dice, que hay una expresión diferencial de diferentes tipos de genes. Y aquí se puede ver que, este es el mapa de calor de los datos de secuenciación de ARN que implica el desarrollo del hoot.Así, allí han tomado diferentes tipos de brotes aquí los brotes secundarios, los brotes primarios, entonces hay algunos, algo llamado la variante madre brotes. Y han extraído el ARN total y han realizado la secuenciación de ARN, a través de los diferentes tipos de brotes y han identificado diferentes genes específicos del tejido que se presentan aquí. Este es otro ejemplo, donde el ARN comparativo El análisis de la secuenciación se realizó para la transcripción de la ynamics durante el desarrollo pétalo en Rose.Uno del miembro de Rosaceae y donde se puede ver que han tomado diferentes etapas de los pétalos de la etapa de desarrollo diferente y han realizado el análisis de secuenciamiento de ARN, y pueden identificar un patrón de expresión del genoma diferente. Y usted puede ver, ellos pueden identificar aquí todos estos diferentes tipos de factor de transcripción. Dependiendo de sus estudios, usted puede centrarse en el factor de transcripción. Por lo tanto, usted puede identificar todos los factores de transcripción que son diferencialmente expressedor cualquier cosa cualquier otro tipo de factor de transcripción. Otra manera si usted toma este tipo de secuenciación de ARN en la secuenciación de ARN se puede combinar con una técnica diferente. Por lo tanto, no es autónomo técnica y luego se puede realizar una forma más específica o más definida para generar datos de secuenciación de ARN. Por ejemplo, si usted tiene algún tipo de etapas de desarrollo tal vez voy a dibujar aquí. Así, por ejemplo, si usted quiere estudiar una etapa de desarrollo en un particular, vamos a suponer que usted quiere estudiar la etapa de desarrollo de raíz y usted sabe que el desarrollo de la raíz ocurre a través de diferentes etapas del desarrollo. La primera etapa en la raíz lateral, la ramificación es que la especificación de algunos, algunas células.Así, estas son las células maduras, ahora están tomando la propiedad de células madre y luego estas células madre la división celular. Se someten al proceso de división celular y generan algún tipo de primordia wichichis llamado raíz primordia. Y entonces esta raíz, raíz primordia se someten al proceso de diferenciación celular. Se inicia el programa de diferenciación de raíz específico y luego finalmente, la primordia es emergingout.Ahora, si usted quiere identificar realmente los genes, usted puede recoger este tejido muy específicamente.Hay muchas técnicas disponibles, una de la técnica que se llama la capturemicrodisección láser. Se puede utilizar y se puede recoger todas estas primordia y luego extraer el ARN total de este primordia y luego se puede identificar.O usted puede tomar alguna muestra de tipo silvestre y la muestra mutante, fueron un factor de transcripción en particular que falta un gen en particular. Y usted quiere identificar cuáles son los genes, que son, cuyas expresiones se están afectando, cuando usted muta un gen en particular. Entonces usted puede tomar ARN total, usted puede hacer la extracción de ARN específica del tejido, total. Y luego realizar la secuenciación de ARN para identificar los genes diferenciales que están presentes en estas dos condiciones particulares o dos mutantes.Así, esto es analizar el patrón de expresión, donde hemos tratado de estudiar hoy cómo identificar la expresión diferencial patrón. Ahora para hacer análisis de patrón de expresión espacial y temporal, hay varios métodos, que vamos a discutir más en la siguiente clase. Pero para presentarlos brevemente, una forma de hacer es que estudiar la localización de ARN, que vamos a hacer por ARN-ARN in situ hibridación. Entonces usted puede hacer la localización de proteínas, puede utilizar algún anticuerpo específico y localizeyou puede estudiar su localización específica en todos los tejidos. Y entonces usted puede hacer una especie de trampeo de promotor, donde se puede utilizar una especie de promotor del gen de leslreporter. Y usted puede identificar si un promotor o usted puede hacer transcripcional fusión, usted puede dotranslational fusion.Así, tal vez vamos a detener esta clase aquí. Y en la próxima clase discutiremos en detalle, cómo estudiar el patrón de expresión espacial y temporal y la caracterización funcional del gen a través de enfoques basados en la genética inversa. Muchas gracias.