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Module 1: Genética molecular del desarrollo de plantas

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Herencia de genes, correlación y complementación

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Por lo tanto, supongamos que hemos identificado o hemos aislado un mutante particular que tiene algún defecto de desarrollo o algún fenotipo que es de nuestro interés entonces cómo moveahead.Así, el siguiente paso lo que hacemos o lo que hacemos es que primero analizamos la naturaleza de mutantes. ¿Qué tipo de mutantes es, cuál es su patrón de herencia?Es muy importante que sepamos si la mutación es hereditaria en la naturaleza o no es la primera pregunta. Hay algunas mutaciones que si están en la línea germinal pueden ser heredadas a la siguiente generación, pero si están en los tejidos somáticos si son las mutaciones somáticas desaparecerán en la próxima generación. Pero para que podamos entender más en el detalle para establecer los mutantes adecuados, es importante tener mutantes hereditarios. ¿Lo primero y luego lo segundo lo que hacemos?Tratamos de identificar, si es hereditario cuál es su patrón de herencia, ¿sigue la ley de Mendelians?Por lo tanto, usted habría estudiado en su curso básico de genética que Gregor Johann Mendel ha dado tres leyes de la herencia cómo un determinado genes o mutantes genéticos se están heredando en la próxima generación.Así, si los mutantes son hereditarios de una manera que puede ser justificada o que puede ser explicada por el proceso de Mendel o por la ley mendeliana o si no están siguiendo entonces ese tipo de herencia es la herencia no mendeliana. Estaremos interesados en tener la forma de herencia mendeliana que hace nuestra vida easyto estudiar la biología del desarrollo de la planta.Pero si es hereditario y asumamos que está siguiendo el patrón de Mendel'sheritance, entonces miramos y analizamos cuál es el patrón de la segregación o cuál es el patrón de la heritencia, es el mutante dominante en la naturaleza semi dominante en la naturaleza o la naturaleza recessiana; primero. Cosas siguientes: si usted recuerda la última clase o si usted recuerda la última clase, lo que hemos encontrado que en esta técnica hay una posibilidad de tener mutación.Así, también nos gustaría saber si la mutación o el fenotipo es debido a la mutación de asingle o es debido a una mutación de orden superior que asumamos el doble mutación. Doble mutación significa que hay una posibilidad de que hay dos mutantes en dos independentistas o y el resultado de estos dos mutantes podría dar el fenotipo. Y si este es el caso entonces lo que sucede, cómo se segregan, ¿se segregan independientemente?Por lo tanto, hay una primera posibilidad donde hay una mutación pero tanto el mutante o boththe locus; tanto el loci están segregando independientemente o segregan juntos; co-segregación.Así, en primer lugar nos gustaría descartar toda esta posibilidad con nuestro interés o mutante de interesa.Así, para primera cosa lo que hacemos como dije que heredable o no hereditario. Los mutantes si mutante es hereditario, entonces si usted recoge las semillas de los mutantes y crecer a la próxima generación, en la próxima generación obtendrá el fenotipo, pero si su fenotipo desaparece de la próxima generación entonces su mutación es es Otra cosa importante si tu mutación es heredada en la moda mendeliana, entonces ¿qué esperas?Usted está esperando un resultado dependiendo del hecho de lo que es su mutación inicial, si su mutación inicial es dejar que asumamos heterocigotos. Heterocigotos significa para cada cromosoma que tenemos un par de cromosomas de homoloscromose.Así, si vamos a suponer que este es un gen donde hay una mutación aquí. Por lo tanto, si la mutación está en sólo un alelo o un loci o en el único cromosoma homologo y la mutación no está presente en el lugar correspondiente de otro cromosoma homológicothenesta condición se llama heterozygous. En condición homocigótica lo que sucede que usted puede esperar que la mutación está presente alelo, aquí tan bien como aquí, aquí no hay mutación.Así que, si su mutación es heterocigosa, entonces usted puede ir a la siguiente generación y mirar el patrón de segregación y depende de cuál es la naturaleza de su mutación, si es dominante entonces usted espera una proporción en particular, si es semi dominante entonces usted espera una relación genotípica y fenotípica y si es recesivo entonces usted espera un patrón diferente de la proporción, cuál sería la proporción que vamos a ver a la diapositiva siguiente. Pero otra posibilidad es que si no sigue el patrón mendeliano de la herencia, ¿cuál es el patrón de la herencia?Hay muchos casos que se han encontrado de forma natural, así como la forma inducida que no sigue el patrón de herencia del Mendel. Por ejemplo, si la dominancia no es completa o la dominancia incompleta o si hay una epigenética que no se transmite; que no se hereda a la próxima generación o los loci que son rasgos vinculados al sexo porque el sexo vinculado hay una diferencia de la homocigocityno se mantiene plenamente porque un cromosoma es x y otro cromosoma es y ok.Así, supongamos que el mutante o vamos a estar más interesados o seremos más felices tener un mutante que es siguiendo el patrón mendeliano de la herencia. Si está siguiendo el patrón mendeliano de la herencia, entonces ¿cuál podría ser la naturaleza de los mutantes?Por lo tanto, lo primero es que si su mutante es dominante y si usted tiene un locifor heterocigoso los mutantes usted puede esperar que usted puede esperar un fenotipo incluso en la condición heterocigoussis, pero si su mutación es recesiva en la naturaleza entonces la única interrupción de oneloci no es suficiente para dar el fenotipo. En este caso usted tiene que tener mutación tanto en el loci genético y si este es el caso entonces usted verá el fenotipo. Así, su fenotipo será sólo si usted tiene mutación en ambos el cromosomeo homólogas y esta es la condición llamada homocigous condition.So, ¿qué sucede?Entonces, ¿cómo estudiar esto?Por lo tanto, usted toma esta planta mutante de la planta y va a la siguiente generación. En la próxima generación vamos a asumir que su planta mutante era heterocigoso. Y si es heterocigoso si su mute si la mutación es dominante ya va a tener fenotipo, pero si es recesivo entonces su planta mutante no tendrá fenotipo, butif que va a la próxima generación que va a conseguir el tipo salvaje heterocigoso y homocigopopulación en la proporción de 1 es a 2 es a 1 y si como he dicho si es dominante, usted espera que estos 3 para ser el mutant.Así, su relación fenotípica va a ser 3 mutantes y 1 tipo salvaje, pero si su mutación es recesiva en la naturaleza entonces sólo este homocigoso que es como el 25 por ciento de la población total va a tener el fenotipo mutante. Por lo tanto, si se mira el patrón de segregación y si se cuantifica el número de mutantes en la generación de ext se puede decir si su mutante es dominante o recesivo en la naturaleza. Otra condición lo que sucede es el semi dominant.Así, en condición mutante semi dominante lo que sucede que usted tiene tipo salvaje, heterocigousand homocigous.Ahora, los heterocigotos y homocigotos en el caso de mutante dominante mutante dominante tienen un mismo fenotipo. tienen un fenotipo, pero en el caso de los mutantes semidomantes los heterocigotos y homocigotos tendrán un fenotipo, pero la gravedad del fenotipo será más en el caso de un homocigoso que el heterocigo.Así, usted tiene una gama de fenotipo en este caso. Otro caso cómo descartar: Supongamos que su planta original o el mutante plantar homocigous. Si es homocigoso, lo que significa que tanto el loci es mutado. Si ambos loci son mutados, entonces la próxima generación si usted va a la próxima generación todas las plantas van a dar el fenotipo; todos los mutantes. Aquí es muy difícil de decir cuál es la naturaleza de su mutantes, ya sea que sea dominante o recesivo no importa porque tanto el loci son mutados, por lo que no segregate.Así, para descartar la posibilidad de que usted tendrá que hacer una cruz de atrás para generar heterocigous.Así, usted tomará esta planta mutante homocigosa cruz con la planta de tipo salvaje y generatea F 1 que tendrá sólo un locus mutó otro locus como un tipo salvaje. Esta es una planta heterocigosa y luego tomar esta planta heterocigosa para la próxima generación y mirar el fenotipo. Si es dominante, si su mutación es dominante usted espera 3 es a 1, 3 mutante 1 tipo silvestre, si es recesivo entonces usted espera la misma proporción 3 es a 1, pero aquí el mutante será 1 y dominantmutante será 3, pero si es un caso semi dominante que usted está esperando 1 es a 2 es a 1.Así, 1 será puro tipo salvaje absolutamente normal, 2 tendrá algún fenotipo, pero 1 fraccionaria va a ser más grave que esta one.Así, esencialmente esta población tendrá el fenotipo, pero la gravedad será diferente. Así, mire aquí este es un caso de semi dominante mutantes.Así, esto es de tipo salvaje y esto es homocigoso. Si usted compara el tipo salvaje y homocigoso mirar la gravedad fenotípica esta planta es verysmall, las hojas son muy pequeñas forma son muy defecto, Pero si se mira la población de F1, que es básicamente heterocigosa; heterocigotos es la gravedad del fenotipo es intermedia.Así que, es menos que el tipo salvaje, el crecimiento es menor que el tipo salvaje, pero más de lo mutante.Así, esto es una especie de fenotipo mutante semi dominante. Por lo tanto, lo siguiente lo que analizaríamos con este mutante es si la mutación es la mutación singlesita o la mutación multisitio. ¿Cómo podemos hacer eso?Podemos hacer esto por simple hacer el cruce de Mendelian. Por lo tanto, supongamos que usted tiene dos mutaciones; uno es un y otros mutantes es b en el geneb y usted tendrá el tipo salvaje y luego usted tiene mutante. Supongamos que el fenotipo es debido al doble fenotipo mutante y usted si usted hace este tipo de cruz ir a la generación de F1 y mirar el fenotipo. Así, esto es de tipo salvaje esto es un mutante y ve las plantas de F1, esto tellan idea de si su mutante es dominante o recesivo. Si sus plantas de F1 ya tienen el fenotipo que significa que sus mutantes son dominantes, si su planta de F1 no muestra ninguna fenotipo que significa que sus mutantes son recesivos. Y entonces usted va y hace una cruz ir a la generación F2 y ahora depende de lo que es el patrón de factor de segregación de ambos el loci. Si la segregación de ambos loci son totalmente independientes y si la mutación es debido a la interrupción de ambos el loci debido a la mutación en el loci, entonces usted espera una proporción típica 3; 9 es a 3 es a 3 es a 1, la proporción fenotípica que siempre obtenemos cuando se hace una cruz dihíbrida; Mendelian dihybrid cross. Y en este caso esta población el 1 esta es la población que será homo doublehomozygous; doble homocigous para el mutant.Así, esto será un pequeño pequeño; un pequeño b; pequeño b.Así, si obtenemos 1 de 16 como un mutante en la generación de F2, esto dice que su esto es un aspecto del doble mutante, tanto los mutantes son recesivos en la naturaleza y no son co segregatingellos están básicamente segregando independientemente por eso tenemos esta proporción en particular. Pero si están genéticamente vinculados, si están co segregando la proporción será totalmychanged dependiendo de la fuerza del enlace ok.Así, este es el análisis genético preliminar uno puede hacer justo después de identificar los mutantes. Entonces el siguiente paso será que usted tiene Se ha identificado el mutante, se sabe cuál es el patrón de su segregación, ahora lo siguiente importante es identificar cuáles son los loci genéticos asociados a este mutantes, lo que significa que mapear las mutaciones cartografiando el gen. ¿Cómo hacerlo?Por lo tanto, hay dos enfoques dependiendo de lo que es que el tipo de mutantes que ha generado, si usted ha generado la mutación de punto por ejemplo, por EMS entonces normalmente tomamos el mapa basado en enfoques basados en la clonación y si usted ha generado mutación a través de la mutación insercional usando T-DNA o transposón, entonces usted puede hacer el mapeo de genes por el gen tagging.Así, ahora vamos a tomar el primer enfoque mapa basado en cloning.Así, esto es hecho por algún marker.Así, esto es muy importante para que usted entienda y lo que sucede aquí lo hacemos por cromosomete.Así, hay ciertas cosas, por lo que hay marcadores moleculares Para el análisis rápido preferimos el marcador basado en la PCR, ya que es muy rápido y luego lo que wedo, tratamos de analizar el patrón de vinculación y segregación entre estos marcadores, los marcadores moleculares y el fenotipo ok. Un marcador muy importante que se utiliza preferentemente son los marcadores INDEL. Estos marcadores se producen en el sitio de la inserción y la deleción. Por lo tanto, básicamente en los marcadores se puede tener dos tipos de marcadores; uno se llama de nuevo marcadores dominantes y otro son marcas dominante.Así, codominante marcador; por lo que en caso de marcador dominante lo que sucede que este marcador dará un patrón en un fondo genético particular y no dará una banda en otro fondo genético. Por ejemplo, si usted está utilizando PCR basado, pero en co dominante en la condición o en el fondo genético, dará una banda, pero el tamaño de las bandas será diferente. Por lo tanto, para nuestro uso o para lo más importante de los marcadores dominantes son muy buenos markersporque en caso de marcador dominante cuando se ve la banda usted está seguro de que esto es presente, pero si usted no ve la banda usted no está 100 por ciento seguro de que la ausencia de banda es realmente porque esto es un marcador, podría ser simplemente un problema técnico del PCR.Así, esto es por eso que en los marcadores dominantes se ve tanto las bandas en la condición, pero en base a este tamaño diferente se puede decir claramente este es este fondo genético, esto es que el fondo genético ok.Así, por ejemplo, en la mayoría de las plantas estos marcadores ha sido bien identificado, bien establecido y ahora la gente sabe si usted toma algún ejemplo de arabidopsis thaliana model plants.Así, este es el cromosoma número III de Arabidopsis thaliana estas son diferentes variedades de Arabidopsis Columbia, Landsberg todo este tipo de C 24.Así, diferente variedad y lo que la gente ha tratado de identificar, ¿cuáles son los marcadores?Los marcadores son básicamente los elementos genéticos que son diferentes en dos variedades.Así, por ejemplo, si usted mira esto es Columbia, por lo que Columbia se ha tomado como un referenciebackground y si usted mira que LER, así que, aquí si usted mira esto es, así que hay una diferencia diferente. Así, Columbia tiene una diferencia diferente en el loci genético con el LER y usted puede elegir esta región y si usted diseña un cebador específico para esta región, entonces ese primer realmente puede distinguir si es el fondo del Columbia o es el fondo del LER y esa clase de marcadores que usted podría utilizar para identificar si una región en particular de un cromosomeis del fondo del Columbia o del fondo del LER. Estos son algunos nombres de estos Por ejemplo, si usted mira debido a alguna inserción algunas supresiones hay una diferencia, por lo que esto es NGA59.Así, este es el nombre de un marcador en este caso usted ha identificado una región donde hay una diferencia. Así, por ejemplo, en esta región si usted compara esto y esto es base pair.So, esto es 110, esto es 141, así que la diferencia es 30 nucleótido que significa que en Columbiao hay una eliminación de 30 nucleótidos en esta región en particular o en Ws4 por lo tanto esta inserción de 30 nucleotíde.Así que, si usted mira aquí, entonces, ¿qué pasa?Si usted toma el genoma del Columbia así, hay una región aquí y si usted toma el genoma de la correspondiente Ws4 aquí es una región, pero hay una pequeña inserción.Así que, si usted diseña un imprimador aquí, si usted diseña un imprimador aquí y si usted dice el primer aquí y aquí, ¿qué va a obtener del fondo del Columbia?Usted va a conseguir este tamaño de banda que es 111 y de este fondo usted está de goingto get this.Así, esto es 111 más esta inserción de 30 nucleótidos que es 141.Así, si usted toma estos y si usted ejecuta el gel, lo que puede esperar?Otra cosa importante que usted puede esperar aquí. Por lo tanto, supongamos si un loci genético es sólo Columbia, entonces si el uso de este marcador se va a obtener 111 banda de pares de base. Si este loci es heterocigoso un loci es Columbia y un loci es Ws y si usted utiliza aquí thenwhat are you going from the Columbia loci you are going to get a band of 111 from thisWs4 loci you are going to get a band of 41 and if you have a genetic loci which is forthis region which is homocigous for Ws4 and if use the same primer you are only goingto get a band of 141 nucleotide.Así, si se ejecuta en el gell se puede ver claramente este tipo de patrón, si es homocigousfor Columbia entonces usted va a conseguir una banda de este tamaño, si es heterocigoso para Columbiaand Ws4 que va a conseguir una banda de este tamaño y una banda de este size.Así, esto viene de un lugar, esto viene de otro lugar, pero si es homocigouspara Ws4 entonces usted va a obtener sólo una banda de 141 base pair.Así, sólo mirando este patrón de banding y mirando este conjunto de primers se puede distinguir claramente cuál es el loci genético en el cromosoma número 3 o en algún lugar aquí donde este marcador está localizado. Así, este marcador, por ejemplo, se encuentra en el cromosome.Así, de esta manera todo el mapa genético ha sido preparado para todos los cromosomas y el largenumber de los marcadores moleculares ha sido identificado. Si tenemos que mapear un gen, entonces lo que usted puede hacer?Usted puede simplemente elegir estos genes y mostrar asociación y mirar su patrón de segregación con su mutant.Entonces, ¿qué hace básicamente?Supongamos que tengo una planta mutante que está en el fondo del Columbia y tengo que saber que esta planta este mutante es recesiva en la naturaleza, sigue el patrón de la segregación de Mendelian que significa que si tomo heterocigotos de esto y voy a la generación siguiente en la generaciónF2 estoy esperando que 3 es a 1 razón y 1 esta proporción 25 percents plantas van a ser mutant.Así, si tomo esta planta y planta mutante y la cruz con el tipo salvaje, mutante es Columbiabackground si tomo Ws4 background. Y si los cruzo lo que voy a esperar?En la generación de F1 estoy generando heterocigotos. Heterocigotos significa que la mitad de los genomas vienen de un segundo plano de Columbia otra mitad de los genomas vienen de los antecedentes de Ws4 esto es heterocigoso. Y entonces si les permito para selffing y para ir a la siguiente generación habrá una lotería de cruce en algún cromosoma 1, algún cromosoma 2 y básicamente lo que es doingque hay fusión de la genoma.Así, si usted va a la generación siguiente y va a la generación F2 los genomas de Columbiaand Ws4 será totalmente fusión y usted puede encontrar una región diferente clase de posibilidadusted puede encontrar un cromosoma como Esto, usted puede encontrar el cromosoma como este. Por lo tanto, cualquier posibilidad que usted pueda imaginar que usted puede encontrar aquí en la generación F2, pero una cosa que estamos haciendo eso, entonces tomamos esta planta.Así, supongamos que he tomado 100 plantas de aquí de la población F2 y aquí también; así que de esta población F2. Así, el 25 por ciento de la planta que será como vamos a dejar que aproximadamente 25 plantsellos serán el mutante, ellos mostrarán el fenotipo. Así, lo que significa que para este mutante desde mi mutación viene de la espalda del Columbia y esta mutación está totalmente ausente en el fondo de Ws4 que significa que en estas 25plantas el locus donde esta mutación es será homocigoso para Columbia.¿ Por qué esto será homocigoso para Columbia?Porque si va a ser homocigoso entonces y sólo entonces tendrá el fenotipo. Puesto que tiene un fenotipo significa que es un homocigoso; homocigoto para la mutación. Y ya que la mutación sólo viene de la Columbia que significa que la región donde hay una mutación será sólo de la Columbia y no habrá región de las Ws inthat one.Ahora, si usted toma todas estas 25 plantas mutantes con el fenotipo mutante y comprobar para su cromosoma diferente, vamos a suponer que hay 5 cromosomas típicamente en Arabidopsisy si mido un cromosoma aquí un marcador aquí; un marcador aquí; un marcador aquí Marcador molecular basado en PCR para diferentes regiones. Y supongamos que mi sitio de mutación está en algún lugar aquí entonces lo que estoy esperando?Si tomo esta planta de 25, por lo que mis mutantes son arreglados aquí. Así, este locus es homocigoso para Columbia en estas 25 plantas que no estoy hablando de 75 plantas restantes podría haber algo diferente, pero en esta 25 plantas que claramente muestra el fenotipo este locus es homocigoso para Columbia.Ahora, si miro; así que en estas 25 plantas esta será esta región será Columbia, pero toda la otra región puede ser cualquier cosa según la pattern.Así, si miro esta región o si compruebo esta región en esta planta de 25, ¿qué voy a esperar?Voy a esperar un patrón de esto.Así, de estas 25 plantas 25 por ciento de esta población será de tipo salvaje para Columbia; 25 por ciento de este podría ser de tipo salvaje para Ws y 50 por ciento de estos pueden ser heterocigouspara Columbia y Ws, este es un patrón típico Mendelian patrón aquí.Compruebo diferentes regiones del cromosoma y si me he encontrado en el cromosoma, assumeon el número 1 del cromosoma 1 todos los tres marcadores muestran un surtido independiente con respecto al fenotipo, si están dando 1 es a 2 es a 1 razón para estos marcadores lo que significa que mi mutación no está presente en este gen en este cromosa.Del mismo modo, se descarta este cromosoma; se descarta este cromosoma; se descarta este cromosoma; se descarta este cromosoma. Pero una vez que se llega a este cromosoma y si su mutación está aquí, si lookea aquí un marcador que está presente aquí ya que está lejos del sitio de la mutación Sin embargo, una vez que empiece a mover esto se llama el cromosoma caminar, si usted comprueba para aquí podría ser que el muerto 1 es a 2 es a 1 segregación para este marcador en esta 25 plantas, pero una vez que usted va más cerca del sitio de la mutación ya sea de esta dirección o de esta dirección, lo que usted está esperando. El tipo salvaje Ws empezar a disminuir, entonces heterocigoso o homocigoso Columbia comenzará a aumentar. Así, entonces habrá una desviación que no puede esperar 1 es a 2 es a 1 y luego si comecloser; más cerca; más cerca y vamos a asumir si usted mira este marcador esto podría estar presente muy cerca o muy cerca de la vista de la mutación. En todos estos 25 por ciento existe la posibilidad de que puede ser sólo heterocigousor sólo homocigoto para el Columbia y luego si usted desciende; bajar habrá un punto en el que todas las plantas tendrán sólo Columbia genome.Así, entonces usted podría obtener una condición donde 100 por ciento de estas 25 plantas tendrán homocigousColumbia y no tienen ningún genotipo para Ws esto se llama su ventana de mapeo. Por lo que, ahora, hacemos de esta dirección que seguimos en el mapa y encontramos que aquí es un markerque es 100 por ciento de Columbia, aquí es el marcador que es 100 por ciento de Columbia, ahora es mi window.Ahora, sé que la mutación está en algún lugar en esta ventana. Si usted quiere ir más lejos y afinar esta cartografía, entonces usted tendrá que aumentar el número de plantas mutantes esto no es posible con 25 plantas, usted puede ir 1000 plantas más, más.Y entonces usted puede hacer la cartografía fina y usted puede hacer, pero estos días desde que estamos en la era post genómica, la mayoría de las plantas de modelo de planta su genoma completo ha sido secuenciado, ahora en las diferentes variedades de esos genomas de plantas se ha dado secuenciado y ahora el secuestro ya no es muy costoso o muy tiempo procesador.Así, nosotros puede tomar este mutante e ir y secuenciar la secuenciación del genoma completo. Y entonces por qué hemos hecho esto se llama la cartografía áspera, por qué hemos hecho este mapa áspero porque toda esta planta fue expuesta con el EMS.Así, hay una posibilidad de que hay una gran cantidad de punto de mutación en el genoma, pero tenemos que averiguar qué mutación es realmente responsable del fenotipo, la almutación puede no ser responsable del fenotipo. Y entonces si ya hemos definido esta ventana, entonces sólo podemos mirar lo que son la mutación de esta ventana y luego uno por uno usted puede descartar dependiendo de su conocimiento si Del mismo modo, se puede señalar y se puede encontrar una mutación de un punto o una mutación de dos puntos en este gen que podría tener el fenotipo relevante. Entonces podemos tomar en el siguiente paso y validar que en realidad este mutante es responsable del fenotipo. Por lo tanto, esto es mapear una mutación de punto, mientras que el mapeo del sitio de inserción de ADN es relativeleasy y se ha hecho con la varias maneras.Una forma de hacerlo que a esto se le llama TAIL PCR.En TAIL PCR ¿qué haces?Puesto que, esta región T-DNA que usted ha diseñado, por lo que, usted sabe la secuencia, usted puede designalgunos primers para este T-DNA.Por ejemplo, SP 1 primer, SP 2 primer, SP 3 primer y nos deja asumir que esto es integrado en el genoma y este podría ser el genoma de la planta y entonces usted puede diseñar un arbitraje de arbitraje aquí. Por lo tanto, este primer básicamente esto no es muy específico esto es más tipo de primeros.Así, puede unirse en un muy o usted tiene una especie de piscina de primos.Así, usted podría encontrar un cebador que podría unirse aquí y este primer primaryPCR con SP 1 usted puede enriquecer esta amplificación, entonces usted usa otra imprimación Y si usted hace una combinación de imprimación que podría amplificar esta región, la región de aquí a aquí. Y entonces usted toma este PCR productos amplificados, clone en un vector cómo hacer la clonación que usted habría estudiado en alguna parte, tomar este fragmento de la PCR y clonar en un vector de clonación y ahora si usted ha clonado en un vector de clonación este es su fragmento, en el fragmento tiene algunas regiones de ADN genómico de la planta y alguna región de T-DNA.Ahora, usted tiene algún sitio de enlace primario aquí secuencia de aquí e identificar qué nucleotidesequence viene de la planta y entonces usted puede hacer, usted puede comprobar esto ir a la página web probar cuál es la secuencia y dónde se coloca esto en la planta de esta manera usted puede mapear que cuál es el sitio de la inserción. Otra forma de mapeo es el rescate del plásmido. Aquí lo que usted hace?Cuando usted está ingeniando su T-DNA usted pone un origen de replicación para las bacterias. Usted sabe que si el origen de la replicación está presente, entonces este ADN si es de naturaleza circular puede propagarse en la bacteria que puede replicarse en la bacteria. Tomemos esto supongamos que este T-DNA está integrado en el genoma de la planta utilizar algunas enzimas.Así, déjenos, pero asegúrese de que este sitio de la enzima no está cortando en el T-DNA.Así que, si usted utiliza un sitio de restricción que podría venir aquí; aquí; aquí; aquí en cualquier lugar en el genoma de la planta y entonces cuando se digiere utilizar este fragmento y usted puede volver a ligate it.So, re ligation generará un este tipo de Desde entonces, usted tiene el origen de la replicación es una especie de su plásmido que se transforma a la bacteria E. coli bacterias y en las bacterias que puede propagar, extraer el plásmido y la secuencia utilizando el primer ADN específico de T-DNA y luego se puede identificar cuáles son las secuencias que están simplemente flanqueando el T-DNA y usted puede básicamente la posición o usted puede identificar el locus de la información. Tercera manera de hacer la identificación del sitio de la inserción es inversa PCR.En la PCR inversa lo que usted hace?Básicamente usted elige un sitio de restricción del sitio que corte por lo menos una vez en el T-DNA y en algún lugar en el DNA.genómico. Cuando usted lo digiere usted sabe la secuencia donde se corta, usted ha diseñado un primer wichis específico para el T-DNA otro primer que es específico de esta región y luego usted re-ligateit; cuando usted vuelve a liar este will.Así, usted tiene una imprimación posicionada aquí; usted tiene una imprimación posicionada aquí hacer el PCR.Y esto amplificará esta región y clonar esta región en una clonación particular vectorsequence ellos e identificar lo que son la secuencia de flanqueo en el T-DNA.En otra técnica que somos utilizar para mapear el sitio de una inserción es adaptador PCR.Adaptor PCR es bastante similar, pero lo que hacemos que se digiere con la restricción de la enzima y luego al final lo que usted hace llenar este fin dependiendo de qué tipo de enzima que usted está utilizando son el uso de la enzima de extremo romo, la enzima pegajosa, pero luego, además, lo que usted hace?Usted añade algunas moléculas de adaptador en los dos extremos de estas moléculas. Y cuando se añaden estas moléculas de adaptador ya que se sabe la secuencia del adaptador se puede tener un primer específico de la secuencia del adaptador, se sabe la secuencia de ADN, se puede designar otro conjunto de imprimaciones y se puede hacer la amplificación de PCR, tomar este fragmento, clonar y secuencia.Así, se puede identificar qué secuencia es y depende en función de esto se puede posicionarlo en el genoma; en el genoma de la planta. Como dije que esto ha sido muy ampliamente utilizado y muchas líneas transgénicas se ha generado en Arabidopsis se deposita en el database.Ahora, simplemente basado en su fenotipo mutante o si usted quiere identificar genes o si usted conoce los genes que desea identificar el fenotipo que simplemente ordena esos mutantes y si ordena a los mutantes que usted sabe que hay una mutación y usted sabe que hay una inserción de AD-DNA, usted puede simplemente ir y hacer el genotipado y validar que actualmente hay inserción.Entonces, ¿qué hace para hacer esto?Por lo tanto, supongamos que este es el gene de interés y usted sabe que el sitio de la inserción ya está establecido, secuenciado, mapeado, todo es done.Ahora, usted diseña una imprimación en el gen, la imprimación delantera y la imprimación inversa justo fuera de la región de flanqueo del T-DNA y utiliza otro imprimador en el T-DNA y si usted hace la combinación de PCR.Así, una PCR que usted hace usando el gen específico hacia adelante y el primer reverso y otra PCR que usted dousing T-DNA específico primer. O con esto dependiendo de la orientación o esto con el, depende de la orientación de este T-DNA se insertó. Si T-DNA se inserta en este Entonces usted quisiera utilizar este primer lugar con esto para tener amplificación, si es en orientación opuesta en esta orientación entonces su posición de imprimación cambiará y entonces usted le gustaría comprobar con esto, pero lo que es importanallí. Así esta banda usted va a obtener sólo si su copia genómica es de tipo salvaje y no hay inserción y esta banda usted va a obtener sólo si hay una inserción de T-DNA usted no conseguirá en el genoma del tipo salvaje.