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Diseño de imprimación

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Primer Diseño Hola a todo el mundo este es el Dr. Vishal Trivedi del departamento de biociencia y bioingeniería IIT Guwahati. Y en la conferencia anterior hemos hablado de PCR. Entonces, ¿por lo que hemos discutido? Hemos hablado de diferentes aspectos relacionados con la PCR cómo se está desarrollando la PCR y cómo se puede poder realizar las reacciones en cadena de la polimerasa y en la conferencia anterior. También hemos discutido acerca de algunos de los aspectos prácticos en los que le hemos mostrado cómo configurar las reacciones, cómo saber hacer las mezclas de reacción.¿Y cómo realizar la PCR? Cómo se puede analizar la PCR en la electroforesis del agro gel. Así que ahora en la actualidad es conferencia vamos a continuar con nuestra discusión sobre la PCR. Así que vamos a discutir acerca de la PCR.(Consultar el tiempo de la diapositiva: 01:50)Así que como usted recuerda que en nuestra conferencia anterior vamos a discutir acerca de la configuración de las reacciones de PCR y en una reacción de PCR usted tiene los pocos de estos componentes como usted tiene el ADN de la plantilla entonces usted tiene los primers que tiene los dNTPs y entonces usted tiene la taq ADN polimerasa. Así que de estos componentes los primers que son el componente muy, muy importante y para cada gen objetivo que tiene que sintetizar un conjunto de cebadores.(Consultar tiempo de la diapositiva: 02:25)Así que la imprimación es un corto tramo de ADN que sirve como punto de partida para la síntesis de ADN en la PCR que requiere que los dos primers se unan en cada uno de los ADN de cadena única que flanquean la secuencia objetivo a los que se llaman como el delantero, así como los primers inversos. Así que si usted tiene un gen y usted sabe que el gen siempre ha sido notificado como 5 prime a 3 prime y 3 prime a 5 prime, por lo que la imprimación que en realidad va a unirse a este lado porque si usted recuerda que la síntesis de ADN está siempre ocurriendo en la dirección de 5 prime a 3 prime.Así que lo que sucederá es el 5 primo de fin de la imprimación en realidad va a unirse a los 3 primeros extremos del gen objetivo. Y es así como esto continuará en esta dirección. Por lo tanto, esta imprimación se llama como la imprimación delantera, mientras que la imprimación que se enlazará a la hebra inversa se llama como la imprimación inversa. Así que esto se llama como imprimador inverso, esto se llama como los primers hacia adelante. Así que ahora la pregunta es cómo usted puede ser capaz de diseñar el delantero, así como los primers inversos.(Consulte el tiempo de la diapositiva: 03:37)Así que antes de diseñar los primers hay que tener en cuenta muchos parámetros. Y teniendo en cuenta esos parámetros sólo usted puede ser capaz de diseñar los cebadores porque cuando usted diseña la imprimación el propósito es que realmente debe ir a unirse al ADN objetivo. Y ese complejo va a ser reconocido por la polimerasa del ADN taq y entonces en realidad va a iniciar los pasos de elongación y es por eso que en realidad te va a dar las amplificaciones completas.Así que cuando sintetizas los primers o cuando empiezas a diseñar los primers a primera hora lo que tienes que recordar es sobre una longitud de primer PCR. Así que los oligonucleótidos entre 18 a 24 bases es la longitud ideal que es lo suficientemente larga para la especificidad adecuada. Y lo suficientemente corto para que la imprimación se vincule fácilmente a la plantilla a la temperatura de recocido a la longitud de la imprimación de los cebadores muy cortos como si usted tiene un 12 a 16 primers de par base.En realidad va a carecer de la especificidad porque hay una probabilidad de que si usted tiene un muy pequeño tramo de ADN es en realidad podría encontrar múltiples regiones dentro del ADN objetivo o si se supone que se utiliza el ADN genómico correctamente podría haber una posibilidad de que el este cebador en particular podría unirse a múltiples ubicaciones y es como en realidad le va a dar el no un producto deseable, pero en realidad va a le da los productos no específicos o puede que no le dé la amplificación en absoluto.Considerando que si usted da muy largo tramo de ADN para un estiramiento de los primers como si usted toma un cebador de 40 a 45 nucleótidos largo que tendrá un problema de estructuras secundarias en primer lugar porque es un muy, muy largo por lo que en realidad va a formar las estructuras secundarias y es como en realidad no va a unirse al ADN objetivo. En segundo lugar, que también tiene un problema que en realidad puede porque una pequeña porción de ese cebador puede unirse a los múltiples lugares y en realidad va a darle el no amplificación o las aplicaciones indeseables.Y es por eso que 18 a 24 par de base es una longitud ideal donde se puede tener la longitud del primer. El tercer punto es si usted está utilizando un cebador muy largo que finalmente va a terminar en ser muy costoso porque la síntesis de imprimación siempre se ha hecho por las empresas y que es como en realidad puede terminar en usted sabe que usted podría estar al final en gastar mucho dinero, pero al final no va a servir al propósito.Debido a que lo que usted puede obtener de 18 a 24 exactamente igual o peor probablemente sería posible si usted está usando los primers de nucleótidos de 40 o 45 pares de base. Entonces usted tiene que considerar también la T m de la imprimación. Por lo tanto, las temperaturas de fusión de imprimación para los cebadores con la temperatura de fusión en el rango de 52-58 grados Celsius generalmente da los mejores resultados el contenido de GC de la secuencia da una indicación justa de la imprimación T m.Los dos cebadores deben ser emparejados de tal manera que su diferencia de T m no debe ser más de 2 grados. De lo contrario, resultará en la pobre eficiencia de recocido cómo usted puede ser capaz de calcular la T m de un imprimador. Así que si usted tiene un imprimador que es de menos de 14 nucleótidos entonces lo que puede hacer es calcular la T m simplemente calculando el número de G y C y el número de A y T.Así que T m es equivalente a 4 grados multiplicado por el número de G y C en el primer más 2 grados multiplicado por el número de A y T en los primers. Ahora la temperatura de fusión de imprimación es un criterio muy importante porque la temperatura de fusión de imprimación sólo va a decidir a qué temperatura va a permitir realmente el recocido de estas temperaturas y es así como se ha encontrado que los 52-58 grados centígrados son ideales.Si usted toma una temperatura muy alta entonces realmente tendrá un problema en términos de recocido. Y si usted toma un número muy bajo entonces realmente va a anneal en múltiples lugares en sitios no específicos. Así que en realidad le va a dar las multiplicaciones no específicas. El segundo punto es que la temperatura de fusión de imprimación o la T m de un imprimador entre las dos imprimaciones como la imprimación delantera y los cebadores inversos.No debería tener una diferencia de más de 2 grados porque lo que va a pasar es si lo he establecido en la primera temperatura anneal de 54 grados centígrados y uno de los primeros tiene una temperatura de fusión de 48, el otro está teniendo un 56. Así que lo que pasará es que un 56 se va a anneal o porque estamos establecimos a 54 grados centígrados. Así que la pared 56 una vez irá y se unirá al ADN objetivo que anneal, pero 48 grados centígrados annealing T m es porque esta temperatura es aún más grande que la temperatura de esta.Así que debido a que no va a anneal por lo que debido a que no habrá ninguna amplificación de su ADN objetivo. Así que si usted tiene un imprimador de menos de 14 pares de base puede utilizar esta secuencia o esta fórmula en particular. Pero si usted tiene una longitud de imprimación que es más de 13 nucleótidos entonces lo que usted puede hacer es usted puede usar calcular la T m por 64.9 + 41 grados Celsius número de GCs en el primer-16.4/N donde N es el número de nucleótido en los primers,Aparte de que usted también tiene que tener en cuenta ya sea de esta fórmula que puede utilizar dependiendo de la longitud de los primers para calcular la T m de la primera y que el valor en realidad va a estar cerca entre el delantero, así como la imprimación inversa. Así que es por eso que usted tiene que diseñar la imprimación de tal manera que debe tener un valor de T m muy cercano para que pueda ser capaz de utilizar muy cómodamente la temperatura de recocido.Así que a ambos los primers realmente entran y en el ADN objetivo. Aparte de que usted también requiere el cebador de temperaturas de recocido por lo que la temperatura de recocido de imprimación demasiado alta temperaturas de recocido de imprimación no proporcionan una adecuada hibridación de plantilla de imprimación que resulta en un bajo rendimiento de PCR, mientras que la temperatura de primer líder demasiado baja del tiempo le dará productos no específicos causados por un alto número de temperaturas de par de base.Y la T m está directa o indirectamente conectada a la T m T a valores o la temperatura de recocido de imprimación, por ejemplo, cómo puede ser capaz de calcular una primera temperatura de recocido de 0,3 en T m la imprimación + 0,7 T m del producto -14.9 donde la T m La imprimación es la temperatura de fusión de los cebadores que son los dos cebadores. Y el producto T m es la temperatura de fusión del producto.Así que esta temperatura de recocido de imprimación se va a deducir una vez que se calcula la temperatura de fusión del cebador y se puede calcular la temperatura de fusión de la plantilla, así porque si se da la secuencia de la plantilla en el software va a calcular realmente la plantilla de las temperaturas de fusión y la temperatura de fusión del cebador también. Y esa fórmula que puedes usar ponla en esta la primera temperatura de recocido y es así como en realidad te va a dar la temperatura de recocido. Y esa es la temperatura de recocido que se puede poner en el software en el en la máquina de PCR cuando se están configurando las reacciones de PCR.(Consulte el tiempo de la diapositiva: 11:19)Aparte de que también tiene que considerar el contenido de CG porque la temperatura de fusión del cebador, así como la temperatura de recocido es dependiendo del número de G y C presentes en los cebadores. Y por eso también es muy importante el contenido de GC de la persona. El número de G y C en el primer como un porcentaje de la base total debe estar entre el 40 a 60 par base 60% lo que significa que usted debe tener una cantidad muy alta de contenido de G y C porque si eso realmente proporciona la unión de la imprimación a la plantilla.Debido a que en realidad está alineando muy fuerte la unión de la imprimación a la plantilla y que en realidad proporciona el tiempo suficiente para que la polimerasa del ADN taq para sentarse en este complejo de la plantilla de imprimación y que es como realmente puede iniciar sin problemas la síntesis, mientras que si usted el contenido de GC es muy baja la plantilla de imprimación de recocido va a ser muy muy débil porque si usted recuerda que el G siempre está haciendo 3 par de base con C, mientras que el A siempre está haciendo 2 par de base con T.Así que si usted tiene más de A y más de lo que sabe en la resequencia como por ejemplo lo que va a pasar en algunos de los organismos patógenos como la malaria usted es en realidad el a través de la hibridación de la plantilla de imprimación va a ser muy débil. Así que cuando la enzima se sentará y tratar de saber sintetizar el ADN podría ser posible que durante ese proceso el imprimador en realidad puede desalojar o la imprimación es vinculante a la plantilla, pero la interacción de la hibridación es muy débil.Cualquiera de esa cosa es en realidad va a reducir la eficiencia de las polimerizaciones mediadas por enzimas y en última instancia puede terminar en darle ya sea el producto no específico o la eficiencia menor de la enzima. A continuación, también requiere las abrazaderas de GC para que el GC forme un vínculo más fuerte que el AT el número de contenido de GC añadir que 3 primo de la imprimación no debe ser más de 3 de lo contrario se traducirá en una unión estrecha no específica en la región donde G y C son abundantes.Aparte de eso cuando usted está diseñando un imprimador también tiene que considerar la formación de las estructuras secundarias primarias. Por lo tanto, las estructuras secundarias primarias surgen como resultado de la atracción intra o intermolecular entre la imprimación o con la imprimación con el eventualmente reducir el rendimiento de la amplificación, ya que la disponibilidad de la imprimación de una sola hebra será limitada para la PCR. Los diversos tipos de las estructuras secundarias de imprimación son las siguientes.Las horquillas para el cabello son la estructura de lazo formada por la interacción intermolecular dentro de la imprimación optimamente un peinador de 3 primeros extremos con un delta G de 0.2 kilo de calorías por mol y un peinador interno con una energía libre de 3 kilos de calorías por mol es tolerado en general. Así que los horquillas son como un ADN de doble cadena. Así que cuando los primers tienen la simetría interna o cuando en realidad están teniendo la simetría que van a venir y cerrar juntos.Y que cómo es en realidad le va a dar el peinados como estructuras como una parte del ADN en realidad va a doblar. Así que este es un único primer varado pero en realidad se va a doblar y le dará una horquilla como la estructura. Así que si esto va a suceder en primer lugar, en realidad va a reducir la longitud única varada de la imprimación y para que sea capaz de tener la interacción con el ADN objetivo o el ADN de la plantilla.El segundo es porque tiene una estructura como la estructura. Así que si la enzima está sentada aquí y tratando de hacer las amplificaciones, en realidad no va a pasar este peinados en particular y como resultado deel peinador en realidad va a desalojar el ADN que la ADN polimerasa o no va a permitir que la ADN polimerasa vaya para en la fase de elongación, como regla de pulgar si usted tiene un lazo de horquilla que tiene un delta G de -2 o -3.Eso es bien tolerado porque usted va a tener la horquilla que se va a formar cuando usted está poniendo los sitios de restricción de la enzima de restricción en la imprimación y ese sitio de restricción es siempre el palíndromo. Así que en realidad le va a dar la horquilla, pero que el pelo es lo suficientemente bueno para ir a ser roto por un cuando se está poniendo en una temperatura donde van a anneal, pero que la temperatura es lo suficientemente buena para romper este tipo de interacciones.Entonces usted va a tener los dímeros un primer dímero es una estructura formada por una estructura doble varada que se forma por la interacción intermolecular entre los dos primers si la interacción se forma entre los 2 homólogas o el mismo primer sentido se llama auto dímero, mientras que si la interacción se forma entre los 2 primers diferentes se llama como la cruz dimer óptimamente un 3 prime con un delta G de 5 kilo de calorías por mole o un auto interno de 6 kilos de calorías se tolera generalmente.Así que lo que es decir por dímero es que usted tiene este es el primer número uno y este es su primer número uno. Así que si es a la vez la secuencia está realmente teniendo el algún tipo de homología o simetría, entonces realmente van a formar un ADN de doble hebra, lo que significa que ya no están disponibles como un único cebador varado. que esto podría ser debido a eso o podría ser como uno está haciendo un ADN de doble cadena con la segunda hebra, lo que significa que uno o bien hacer un par con uno o uno haciendo un par con 2 cualquiera de estas cosas, o bien podría ser un homodimer o podría ser un heterodímero cualquiera que el caso en realidad va a sub secuestrador de los cebadores de una sola varada, pero usted no tiene que preocuparse por los dímeros.Si el Delta G que es la energía libre de este primer dímero está en el rango de -5 a -6 porque eso es lo suficientemente bueno que la energía es Se va a romper una vez que se mantiene este primers a una temperatura de annealingporque eso es lo suficientemente bueno porque cuando se calcula la temperatura de recocido se van a considerar todos estos parámetros. Y es así como usted mantendrá la temperatura de recocido de tal manera que la imprimación real realmente va a ser todavía capaz de anneal con la plantilla, pero no va a ser anneal con la siguiente molécula de la imprimación para formar los dimmers.Entonces usted va a tener las repeticiones y las carreras para las repeticiones son la aparición constitutiva del di-nucleótido mientras que las carreras son el estiramiento continuo un único nucleótido varado un número máximo de repeticiones y la ejecución aceptada es un 4 di-nucleótidos o el par de 4 base respectivamente entonces usted tiene la plantilla de imprimación homología para el cebador debe ser diseñado en de tal manera que no debe haber una homología dentro de la plantilla que no sea el sitio de destino esto dará como resultado un enlace no específico y amplificaciones.(Consulte el tiempo de la diapositiva: 19:18)Así que estas son algunas de las estructuras secundarias de imprimación lo que puede ver estas son las así que si usted tiene este tipo particular de secuencia como este es un 2 primers y usted puede tener los bucles de horquilla. Así que usted puede tener el peinpin como se ha formado y esto, pero usted puede ver que este peinados tiene un delta G de 0.16 y que es lo suficientemente bueno cuando usted realmente va a golpear hacia arriba y cuando usted está trayendo este parámetro a temperaturas de recocido.Entonces este es un ejemplo del primer dímero donde una secuencia de la imprimación está haciendo una interacción con la segunda secuencia, mientras que lo que usted ve es en realidad un carmeros no aceptables como en este caso lo que usted ve es que sólo esta región donde sólo los 3 nucleótidos están haciendo una interacción con los nucleótidos presentes en la otra secuencia y luego descansar todos estas secuencias son una interacción muy débil.Así que esto se va a romper realmente porque tienes un delta G que es -2.9, mientras que lo que ves aquí es en realidad una unión muy fuerte de la participación de casi 6 a 7 nucleótidos y lo que ves es el delta G es muy alto que es como -9.74. Así que es por eso que esta imprimación cuando usted está sintetizando este imprimador no va a ser útil porque va a ser terminado en darle a ustedes los cebadores de la imprimación.Y así es como realmente lo va a saber y esta energía libre en particular es muy alta. Así que en realidad le va a dar las interacciones no específicas o este primer no le dará la amplificación en absoluto. Así que este es un breve resumen sobre cómo diseñar los iniciadores así que para explicarte cómo utilizar el software ’ s porque cuando se quiere diseñar los primers se puede utilizar el software ’ s para el análisis de los múltiples aspectos como si se está formando una horquilla si se está formando un dímero lo que será una energía libre y todo eso.Así que la gente está utilizando diferentes tipos de software para todos los dos para el diseño de los cebadores, así como para el análisis de los cebadores. Así que déjame llevarte a mi laboratorio y donde los estudiantes te van a explicar los diferentes aspectos de la imprimación diseñando y cómo puedes ser capaz de analizar esas secuencias para decidir si tu imprimación es mala frente a primaria pura porque eso es muy importante porque la primaria es la que conoces la corteza de toda la historia si estás diseñando una cartilla mala no vas a conseguir la amplificación.Porque eso en realidad va a ser que tú sabes darte el punto de partida para que tu enzima vaya y te sientas e inicie la síntesis. Así que es por eso que el primer diseño es un muy, muy crucial y muy, muy importante de entender. Hola a todos, en este vídeo voy a mostrar cómo diseñar los cebadores y analizarlos.(Consulte el tiempo de la diapositiva: 22:19)Así que para el diseño de los primers primero hay que identificar la región de interés de su región de interés que desea amplificar desde cualquier vector o cualquier secuencia. Así que en el segundo paso usted ayuda a identificar a los no cortadores hay varios software disponibles, pero podemos utilizar New England Biolabs NEB cortador versión 2.O. Después de identificar a los no cortadores hay que seleccionar un vector adecuado en el que desea integrar esta región amplificada y sitios de restricción adecuados que obtendrá sitios de restricción adecuados de no cortadores después de que usted puede ir para el diseño de la imprimación delantera.(Consulte el tiempo de la diapositiva: 23:14)Así que para entender el propósito que di esta secuencia, así que estoy usando esta secuencia voy a utilizar esta secuencia para diseñar los cebadores y analizar los cebadores. Así que esta es la secuencia completa, pero no quiero amplificar la región de retención quiero amplificar las letras la secuencia que se destaca enverde. Así que quiero amplificar empezando de aquí a aquí. Así que ahora surge la pregunta cuáles son los no cortadores. Así que quieres amplificar esta región e integrarte en otro vector para que tengas que identificar cuáles son las enzimas de restricción no cortantes. Entonces, ¿qué voy a hacer? Copiaré esta secuencia en el cortador NEB e identificaré lo que son los no cortadores.(Video Starts: 24:20)Así que sólo copia la pasta de secuencia aquí y me someteré a la última vez. Así que analizará la secuencia y la cola no cortadora estas son las enzimas que cortan dentro de la secuencia. Pero estamos interesados en que no son cortadores por lo que significa que usted puede ver aquí no cortadores. Tan sólo haga clic aquí. Dará el número de enzimas que no cortarán dentro de la secuencia. Así que una vez que obtengamos esta lista tenemos que identificar en qué vector quieres integrar tu región amplificada.Así que para ese propósito así que he seleccionado para facilitar el entendimiento he seleccionado el vector pET 23a. Así que puedes ver esto es ese mapa vectorial. Así que este es el 5 lado principal, este es el 3 terminal N del lado principal y este es el lado de la terminal C. N terminal significa primer delantero, C terminal significa primer reverso para que pueda utilizar BamH1 en primer delantero y Xho1 en primer reverso este son los detalles. Así que he identificado 2 enzimas de restricción que son BamH1 y Xho1.Así que puedo usar estas enzimas en la imprimación delantera y la imprimación inversa. Así que después de identificar las enzimas de restricción y el vector irá para diseñar la imprimación delantera. Así que voy a tomar esta secuencia que quiero amplificar de aquí a aquí. Así que voy a copiar la secuencia aquí así que para diseñar la imprimación delantera es muy fácil que usted tiene que tomar la secuencia lo que sea que se está llegando hasta 15 a 20 base que puede tomar como este.Así que si usted quiere insertar una enzima de restricción suponga que quiero insertar una enzima de restricción esta es la secuencia tal como se da a partir de toda esta secuencia por lo que quiero insertar la enzima de restricción que es BamH1. Así que esta es la secuencia para BamH1 aquí se corta, así que puedo usar esta secuencia aquí. Así que esta es la enzima de restricción aquí que va a cortar. Así que no podemos simplemente hacer cola como esta para que haya algo más base extra base que tenemos que añadir en el lado 5.Así que voy a utilizar así que esta secuencia que voy a utilizar. Así que ahora este es 5 prime a 3 primeros lados. Así que este es nuestro primer delantero está listo. Así que después de diseñar este primer manual tenemos que analizar esta secuencia. Así que este primer tan lo que voy a hacer es sólo copiar esta secuencia y voy a utilizar el software de OligoAnalyzer que está especialmente diseñado para este propósito sólo voy a pegar la secuencia sólo preguntar analizar.Así que aquí también se puede ver que hay tantas opciones que hay como que puede analizar los bucles de horquilla, el auto dímero, hetero dímero. Así que estos son los detalles generales cuál es la longitud y contenido de GC temperatura de fusión, peso molecular. Así que estos son detalles normales voy a ir para el lazo de horquilla es allí cualquier lazo de horquilla. Así que podemos ver que hay un número de bucles de horquilla podemos ver diferentes estructuras diferentes previstas por el software.Así que si quieres explorar esta cosa puedes explorar sólo 2 bases, 2 bases que está realizando y el valor delta G es de -0,43 kilo de calorías por mol. Así que esto está bien hasta -10 kilo calorías por mole está bien. Esos bucles de horquilla rotos durante el proceso de amplificación pero por encima de -10 kilo de calorías por mole no se pueden romper. Así que en ese caso lo que haremos o bien rediseñamos los primers vamos a añadir 5% 1% B10 o 5% es DMS forma estos son estos productos químicos interrumpen estos bucles para que la amplificación vaya a estar bien.Así que a continuación analizaré para autodímero ¿Hay algún autodímero y cuál es el máximo delta G. Así que esto se está formando continuamente 5 bases Es por los sitios de restricción. Así que esos son sitio de restricción en aquellos homodimers que se forman debido a la restricción del sitio se puede romper no hay problema, pero aparte de que esto es también debido a la restricción del sitio, pero aparte de eso tenemos que mirar con cuidado. Así que hay cualquier cultivo continuo de 4 o 5 bases este homodimer entonces es muy difícil estas interacciones se pueden romper fácilmente.Así que aquí están algunos de los pares de base consecutivos estos son una interacción muy débil para que se puedan romper. Por lo tanto, aparte de que no hay un autorreductor significativo. Por lo que esta secuencia se puede utilizar y para la predicción de heterodimer heterodimer que necesita una secuencia complementaria con el primer primario inverso inversa que necesita. De modo que discutiremos más adelante, así que tenemos nuestro primer manual aquí. Así que es muy fácil generar la imprimación delantera.Pero en caso de la imprimación inversa es algo difícil porque no en términos de predecir las cosas es algo complicado. Así que lo que estoy diciendo es que tenemos secuencia. Así que en el caso del primer delantero sólo tomamos un como es la secuencia de 15 a 20 base como estos de las secuencias, pero aquí tenemos que tomar la secuencia de cortesía no 3 prime a 5 prime o 5 prime a 3 prime secuencia tenemos que tomar de forma complementaria a este.Di que esta es la secuencia que tenemos de aquí. Entonces, ¿cuál es el complementario a este? Así que sólo voy a añadir aquí. Así que este es el complementario a esta secuencia en particular. Así que como se puede ver esto es que tenemos que mantener de esta dirección 5 prime a 3 prime. Así que voy a tomar así así que lo que tenemos que hacer es que queremos insertar un sitio de restricción aquí. Así que podemos insertar un sitio de restricción aquí directamente. Así que en la imprimación inversa queríamos insertar el sitio Xho1.Así que este es el sitio de restricción como de costumbre podemos utilizar el cómo insertar TAA aquí. Así que este es el sitio de restricción que hemos añadido podemos añadir regiones de flanqueo entre una base de flanqueo antes de este sitio de restricción. Así que ahora tenemos nuestra imprimación inversa por lo que tenemos que pasar por el mismo procedimiento como lo que he mostrado en el caso de los primeros 5 primers. Así que sólo voy a copiar la pasta aquí y analizar la imprimación inversa.Así que hay cualquier horquilla de pelo bucles sólo un lazo de horquilla que está dentro del rango de delta G. Así que no hay problema y el propio dímero. Así que podemos ver aquí continuamente 4 bases se están formando en este caso tenemos que o bien cambiar la secuencia o eliminar las algunas de las bases que podemos ignorar esas restricciones que la agricultura de dímeros a través de sitio de restricción. Así que el próximo heterodímero que tenemos que analizar para el heterodimer que necesitamos primer copiar sólo copiar aquí.Y calcular que va a dar Es allí cualquier heterodimers esto es debido a la restricción del sitio, esto es también debido a la restricción del sitio esto se puede romper los que están al final de la secuencia que se pueden romper, pero que es si esas bases son medios Es muy difícil interrumpir esas interacciones y nuestra amplificación no será buena. Así que no hay amplificación, literalmente, otros tipos de interacciones se romperán fácilmente estas son interacciones rápidas. Así es como podemos preparar el diseño de los cebadores y analizar los cebadores. Hemos hecho todos estos procesos para el diseño de los cebadores hacia adelante y hacia atrás.(Video Ends: 38:55)(Consulte el tiempo de la diapositiva: 38:56)Pero en lugar de hacer manualmente quién puede hacerlo en línea, sólo tenemos que enviar la secuencia y devolverá la premisa hacia adelante y hacia atrás. Estas son algunas de las herramientas disponibles en línea para libremente. Pero hay herramientas comerciales también disponibles como Olio 7, Vector NTI, primer premier. Así que si usted está interesado en este software ’ s o usted puede simplemente pasar a través de estos sitios y enviar su secuencia usted recibirá sus primers.Así que en esta demostración en particular los estudiantes han discutido diferentes aspectos relacionados con el diseño del primer diseño y espero que usted podría haber entendido muchos aspectos donde las precauciones que usted tiene que tomar y cuáles son las cosas que debe evitar mientras que está diseñando los primers.(Consulte el tiempo de la diapositiva: 39:54)Así que esto es como usted sabe el ejemplo clásico donde tengo que hemos sintetizado 2 primers en la imprimación inversa, así como los primers hacia adelante. Así que cuando quieras sintetizar el traje de imprimación adelante lo que tienes que hacer es y este es este es un primer lo que hemos sintetizado para la clonación del gen en particular. Por lo que los cebadores de clonacion son diferentes de los cebadores de secuenciacion. Así que en la imprimación de la clonación lo que tienes que hacer es la composición es muy importante que tomas pocos nucleótidos que en realidad van a ser sólo para un sitio para que la enzima se siente.Y entonces usted va a poner el sitio de restricción y entonces usted va a enfrentar la secuencia complementaria como la secuencia lo que ha sido idéntico al sitio inicial como este derecho. Así que la síntesis de imprimación delantera de nuestro imprimador es muy simple porque usted puede simplemente tomar la secuencia si I prime final usted agrega el lado de restricción en este lado y luego usted agrega algunas secuencias más y eso está listo para los cebadores delantero.Mientras que en los primers inversos lo que tienes que hacer es que sólo tienes que tomar esta secuencia que lo haces inverso y luego agregas el reverso de los sitios de restricción y entonces puedes ser capaz de añadir algunas secuencias más. De modo que el que proporcionará el sitio de atraque para que la enzima se siente de tal manera que, en última instancia, el usted va a utilizar estos primers para hacer un gen y entonces usted va a digerir esto con las líneas de restricción.Así que estas son las secuencias adicionales lo que usted está poniendo para que los sitios de restricción se van a sentar en esta enzima sobre este objetivo en particular como el ADN amplificado y podría ser capaz de masticar hay varias cosas que el estudiante podría haber discutido cómo analizar y cómo verificar y todo eso. Así que todo esto se trata del diseño del primer diseño y de cómo usted puede ser capaz de sintetizar o diseñar los primers utilizando los diferentes software.Y espero que usted podría haber entendido todo el proceso y que en realidad va a ayudarle en el diseño de los primers en su laboratorio. Y con esto me gustaría concluir mi conferencia aquí en la segunda conferencia posterior vamos a discutir algunas aplicaciones más de la PCR. Gracias.