Loading
Apuntes
Study Reminders
Support
Text Version

Set your study reminders

We will email you at these times to remind you to study.
  • Monday

    -

    7am

    +

    Tuesday

    -

    7am

    +

    Wednesday

    -

    7am

    +

    Thursday

    -

    7am

    +

    Friday

    -

    7am

    +

    Saturday

    -

    7am

    +

    Sunday

    -

    7am

    +

Instrumentación Así, se trata de un, cicladores térmicos típicos por lo que en un ciclador térmico es el instrumento que lleva a cabo las amplificaciones a través de las reacciones en cadena de la polimerasa el dispositivo tiene un bloque térmico. Así que lo que ves es que tienes un bloque térmico y estos bloques térmicos en realidad están teniendo los agujeros en los que puedes ser capaz de mantener tu eppendorf o los tubos de PCR y esta es la unidad de control en la que puedes ser capaz de configurar estas reacciones de PCR y puedes ser capaz de configurar la desnaturalización inicial.Entonces la desnaturalización, elongaciones, recocido y todo eso y puedes cambiar todos estos parámetros, este es el bloque de calefacción que en realidad se ha utilizado una vez que vas a poner la muestra aquí entonces puedes ir cerrando esto led y tu bloque de calefacción superior en realidad va a estar a 100 grados celsius. De modo que en realidad va a detener la evaporación de la muestra porque lo que va a pasar es que una vez que los tubos van a ser insertados en el bloque de la muestra, en realidad va a ser caliente.Porque 76 grados celsius o 94 grados celsius o 95 grados celsius por lo que durante ese período, el líquido lo que está presente en el eppendorf se va a evaporar y si ese líquido se evapore llegará a la tapa de ese eppendorf particular. Así que si usted no tiene ningún mecanismo, por lo que, que no debe hacer que toda su mezcla de reacción no va a estar presente en este bloque en particular, en realidad estará presente en la parte superior de la tapa.Porque si usted ve eppendorf tiene el eppendorf y este es el límite realmente así, si usted mantiene la mezcla de reacción aquí lo que va a pasar es, va a evaporarse y eventualmente toda la mezcla de reacción se va a acumular aquí en lugar de aquí porque este es el lugar lo que usted está manteniendo dentro del bloque. Por lo tanto, si eso sucede entonces su eppendorf va a estar vacío en lo que respecta al bloque de construcción.Así que sea cual sea la temperatura que mantenga no importa y es por eso que la gente es en realidad las máquinas están teniendo un bloque de calefacción para que mantenga una temperatura de 100 grados, pero cualquier posibilidad de que el agua no va a venir a la parte superior del tubo y va a condensarse porque eso en realidad va a parar que las acciones. Por lo tanto, este dispositivo tiene un bloque térmico que, en realidad sostiene donde el tubo que sostiene la mezcla de reacción puede ser insertado.El ciclador entonces eleva y baja la temperatura del bloque en unos pasos preprogramados discretos. Por lo tanto, una vez que configure las cosas en realidad va a aumentar la temperatura, así como bajar la temperatura.(Consulte el tiempo de la diapositiva: 03:56)Así, cuáles son las cosas que necesita para las reacciones en cadena de la polimerasa que requiere el ADN de la plantilla por lo que tiene que tener una plantilla de ADN de 1 picograma a 1 nanogramos, si es un virus o el ADN corto. Si es un 1 nanogramo a 1 microgramo, si es un ADN genómico entonces usted requiere los primers que requiere los 2 primers uno es el primer delantero y la imprimación inversa porque como usted ha visto que tiene una hebra por lo que va a ser 5 prime a 3 prime y 3 prime a 5 así que requiere los 2 primers.Así que, esta es la hebra que en realidad va a unirse al 3 primer extremo de su ADN objetivo se va a llamar como el primer delantero y la hebra lo que va a ser unirse a su otra hebra se llama como la hebra inversa. Entonces usted requiere el cloruro de magnesio, por lo que el cloruro de magnesio va a hacer un complejo con la ATP y que estará en el 1.5 a 2 millimolar para la polimerasa Taq ADN.Entonces usted requiere los dNTPs o deoxi nucleótidos que en realidad está en el rango de 200 micromoles y luego se requiere la polimerasa Taq ADN que está en el 0.5 a 2 unidades por 50 microlitros.(Consultar tiempo de la diapositiva: 05:09)Así que en cuanto al ADN de la plantilla, usted tiene las múltiples fuentes de ADN de la plantilla, por ejemplo, usted tiene el ADN genómico. Usted tiene los fragmentos de ADN que usted requiere que tiene los plásmidos, usted tiene el ADN viral y luego también tiene la muestra de tejido porque el objetivo final de la PCR es amplificar un ADN en particular y es así como usted puede tener las múltiples reacciones.Si usted recuerda cuando estábamos discutiendo acerca de la electroforesis en uno de los problemas, lo que dijimos es que la gente ha descubierto la vieja muestra de roca y que en realidad tenían muy poca cantidad de ADN de un dinosaurio y estaban realmente interesados en deducir todos los demás tipos de información, pero eso no era posible a partir de un pequeño tramo de ADN y así es como ellos han hecho la PCR para amplificar. Así que es por eso que en realidad utiliza las múltiples fuentes, ya sea que usted puede usar el ADN genómico.Usted puede usar los fragmentos de ADN como por ejemplo estos fragmentos de ADN podrían estar presentes en los bloods como por ejemplo, si usted si la gente ha descubierto o usted sabe aislado una sangre de un sitio del crimen y ellos quieren identificar la sangre la persona a quien la sangre está siendo contaminada o la persona a quien la sangre pertenece. Entonces pueden lo que pueden hacer es simplemente aislar el ADN de esta sangre en particular.Y pueden hacer la PCR para identificar si este ADN en particular es perteneciente a esa persona en particular o no lo mismo es cierto para los plásmidos. Por ejemplo, en algunos casos si ha generado plásmidos recombinantes puede ser capaz de verificar con la ayuda de los primers PCR. Entonces usted puede usar una muestra de tejido por ejemplo, si una persona tiene el por ejemplo si usted ha descubierto una muestra de tejido de un paciente de cáncer o supongamos que alguna muestra de tejido está presente de la hepatitis.Y usted quiere saber si el virus de la hepatitis está presente o no así en esos casos lo que usted puede hacer es simplemente aislar el ADN de esas muestras de hepatitis y entonces usted puede hacer la PCR para el virus en particular. Del mismo modo puedes hacer una muestra viral por sí misma por ejemplo si tienes una muestra viral y quieres identificar el virus. Luego se puede hacer la PCR y así dependiendo de la plantilla hay que tomar la cantidad por ejemplo si es un viral o el ADN pequeño se puede llevar el hasta el nivel de nanogramos pero si es un ADN más grande entonces hay que llevarlo a un nivel de microgramo(Consulte Slide Time: 07:40)Entonces se requieren los primers por lo que el cebador es un ADN corto, hebra que sirve como punto de partida para la síntesis de ADN en PCR. Usted requirió de los 2 primers que en realidad van a unirse al ADN único varado para requerir una imprimación delantera, así como un cebador inverso. Así que ellos impriman tienen una secuencia que es complementaria a la secuencia en el ADN de la plantilla donde se supone que deben comenzar la síntesis. Así que el diseño de los cebadores, así como el análisis de imprimación de cómo diseñar los buenos cebadores de todos modos vamos a discutir más adelante.Así que los primers son como las hebras complementarias y lo que se puede ver es que un 5 prime a 3 prime si este es el ADN de la plantilla. Así que lo que puedes hacer es simplemente tomar el pequeño tramo de este ADN y que en realidad va a servir como la imprimación delantera y si tomas este tramo, en realidad te va a dar los primers inversos. Por lo tanto, los primers inversos en realidad van a las direcciones inversas de la cadena de síntesis, mientras que a, la imprimación delantera va en las mismas direcciones.(Consulte el tiempo de la diapositiva: 08:52)Entonces usted requiere las enzimas así que usted puede tener los diferentes tipos de enzimas que la gente normalmente ha comenzado con la polimerasa Taq DNA. Así que la polimerasa Taq DNA está aislada del Thermus aquaticus, que se encuentra en los 170 grados centígrados Fahrenheit de los manantiales calientes del Bosque Nacional de la Piedra Amarilla. Así que la ADN polimerasa Taq o el ADN Taq es una polimerasa de ADN estable en una temperatura alta y actúa en presencia de magnesio. La temperatura óptima para la polimerasa de ADN Taq es de 72 grados celsius.(Consultar tiempo de la diapositiva: 09:28)La polimerasa Taq ADN carece de la actividad correctora de 3 a 5 principales exonerucleasas y es por eso que en realidad se encuentra comúnmente en otras polimerasas. Así que lo que pasó es que cuando se tiene la actividad de 3 primeros a 5 de exculpuclease prima, en realidad es una actividad correctora. Por ejemplo, cuando usted está leyendo una frase en realidad puede hacer una revisión que realmente puede pedir a alguien más para hacer una revisión por ejemplo si usted está escribiendo un manuscrito y usted puede pedir a alguien que haga una revisión.Así que, lo que el otro tipo hará es que en realidad va a leer sus artículos de manera similar las muchas enzimas tienen las actividades de revisión. Por lo tanto, en este caso es una actividad de 3 a 5 mejores correctores que significa que la enzima en realidad se remonta y comprobar si he añadido los nucleótidos correctos o no, por ejemplo, si usted tiene una hebra si tiene un A en la plantilla y entonces la enzima va a añadir la T porque es la complementaria de los nucleótidos.Pero lo que va a pasar es suponer que usted tiene el G después de que va a añadir la C pero antes de que vaya a la G va a volver atrás 1 nucleótido de nuevo y luego va a comprobar de nuevo si la T se está adjuntando en contra a A o no y eso es lo que realmente sigue haciendo y eso es lo que es llamadas como una actividad de corrección. Por ejemplo por casualidad si añadía el C por ejemplo en lugar de T añadía el C.Entonces lo que es la enzima va a hacer es si se vuelve atrás y comprobar que no es T es C en realidad entonces la enzima va primero a corregir el error y entonces solo seguirá adelante. Así que es por eso que la actividad de revisión es muy importante si usted quiere sintetizar un ADN sin errores en eso debido a que el Taq mal incorporar 1 base está en cada 10 a la potencia 4 bases que significa si usted tiene un objetivo de par de 400 base.En realidad va a tener un error 33% de la molécula después del ciclo 20 que significa si usted tiene un par de 400 base de ADN objetivo 33% de las moléculas lo que se va a sintetizar después de 20 ciclos va a tener realmente algunos errores si usted está utilizando la polimerasa Taq ADN que significa que se va a distribuir a lo largo de la secuencia porque va a ser Así que en alguna secuencia el error está siendo incorporado en un 10 nucleótido las 10ª posiciones en algunos lugares son las 100 posiciones en algunos. Entonces lo que es decir es que si usted tiene una hebra como esta y en realidad está comenzando a generar las mutaciones porque donde quiera que tenga la A y si usted pone la C en realidad que en realidad va a cambiar la secuencia porque la secuencia de su hija ahora se está cambiando.Así que una vez que la nueva secuencia se va a generar, el ADN va a añadir el G en lugar de C en realidad porque esto va a ser una plantilla más adelante. Entonces eso realmente va a generarel ADN erróneo que en realidad va a ser no la copia idéntica porque el objetivo final de la PCR es proveerte la copia idéntica, pero te va a dar el ADN con mutaciones que en realidad va a ser alteración de las bases.(Referir Slide Time: 13:02)Entonces, ¿cuál es el remedio para eso? El remedio es que puedes usar las nuevas enzimas y una de la nueva enzima lo que puedes usar es una polimerasa de ADN de Pfu, que es del Pyrococcus furioso y que en realidad posee la actividad de corrección de 3 a 5 principales exonerucleasas que significa que esta enzima si lo usas realmente va a volver atrás y comprueba si ha agregado el nucleótido derecho o no.La tasa de error es de solo 3,5% si recuerdas la tasa de error fue del 33% en el caso de la polimerasa Taq DNA pero aquí la tasa de error es solo 3.5% después de los 20 ciclos. El único problema es que requiere más cantidades de primers porque y si lo haces así es que en realidad va a empezar a producir los dímeros de imprimación así que para los genes inexplorados, se utiliza el imprimador utilizado en especies estrechamente relacionadas.(Consulte el Tiempo de Slide: 13:59)Ahora cómo configurar las reacciones de PCR, por lo que lo que usted requiere que requiera el ADN de la plantilla según el requisito si es un ADN genómico debería estar en el rango de microgramos. Si es un ADN corto como los plásmidos o el virus, entonces usted tiene que tomar los primers como los cebadores de avance, así como el cebador inverso entonces usted requiere el cloruro de magnesio. Usted requiere los dNTPs que requiere los búferes de la polimerasa del ADN Taq y el agua, la secuencia en la que usted va a añadir todo esto es muy simple.Usted tiene que tomar primero el agua entonces usted tiene que agregar el buffer y entonces usted va a agregar la plantilla entonces usted va a agregar el cloruro de magnesio entonces usted va a agregar los dNTPs. Entonces usted realmente va a añadir los cebadores y, por último, finalmente va a añadir las enzimas en algunos casos lo que la gente también hace es que en realidad hacen una mezcla maestra utilizando todos estos y luego añaden las diferentes plantillas.Así que si supongamos que tiene diferentes plantillas y desea utilizar entonces lo que puede hacer es sólo excluir los cebadores, así como la plantilla hacer la mezcla maestra alícuota y luego se añade la plantilla, así como los cebadores y luego se acaba de poner en las máquinas de PCR y es como es en realidad va a hacer la PCR.(Vídeo Comienza: 15:28)En este vídeo vamos a demostrar cómo establecer una reacción de PCR y analizar los resultados utilizando electroforesis de gel de agarosa. La PCR o la reacción en cadena de la polimerasa es un uso ampliamente utilizado en las técnicas de biología molecular para amplificar un segmento particular del ADN. También está implícito en la investigación biomédica y la medicina forense. La principal aplicación de esta reacción de la cadena de la polimerasaes la clonación para establecer una reacción PCR que necesitamos el ADN de la plantilla, los cebadores específicos del sitio, la mezcla de dNTPs, el agua libre de núcleo.Y la polimerasa Taq para una reacción de 50 microlitros en una concentración típica de 10 a 100 nanogramos de uso de ADN de la plantilla y 5 picosoles de cada cartilla se utilizará. Esta es una versión anterior del ciclador térmico que contiene la unidad de visualización donde podemos observar los parámetros y cambiar los parámetros. Este es el protector caliente que es el soporte de la muestra y en el interior hay un sistema de peltier.Que puede mantener las fluctuaciones de temperatura para la configuración de una reacción de PCR en la desnaturalización inicial a 95 grados, celsius 3 minutos y este paso, vamos a utilizar 30 repeticiones donde la desnaturalización inicial será de 30 segundos y la recocido. El tiempo de las extensiones debe ser dado 1 minuto por kb y aquí la extensión final debe ser dada 10 minutos y sujetarla 4 grados Celsius 10 minutos.(Video Ends: 19:23)(Consultar Tiempo de Slide: 19:24)Y luego tienes que hacer la configuración de la optimización de las reacciones también tienes que hacerlo hay múltiples lugares donde puedes hacer la optimización por ejemplo en el interior de los ciclos de reacción. En la etapa 2 usted puede ser capaz de optimizar simplemente mirando la temperatura de recocido, así como la temperatura de extensión porque la temperatura de recocido en realidad va a permitir el recocido de la imprimación a las plantillas.Así que el paso es muy crucial si usted toma si mantiene la temperatura de recocido demasiado baja que en realidad va a generar un DNAs no específico si usted mantiene la temperatura de recocido demasiadoalto. En realidad no va a unirse a la plantilla y por lo que en realidad va a no dar productos aparte de eso, en algunos casos las personas también hacen un arranque caliente como por ejemplo si usted recuerda lo que estábamos discutiendo que en realidad usted sabe que va a hacer todo esto y entonces usted va a mantener en las reacciones.Pero lo que pasó es incluso durante que usted sabe temperatura ambiente cuando estamos haciendo todas estas reacciones e incluso si usted lo está haciendo en el grado 4. Algunos productos iniciales están siendo formados y una vez que los productos iniciales están siendo formados, realmente va a interferir en sus amplificaciones. Así que, si, habrá algún producto no específico, que se está produciendo y entonces en realidad va a afectar a su productividad general.Porque, en última instancia, es una reacción en cadena de la PCR o de la polimerasa; donde, la cantidad de su producto final, así como la precisión de esa secuencia es muy importante. Así que si usted realmente va a añadir las reacciones y lo va a mantener en el bloque si el bloque normalmente toma algún tiempo para que se caliente pero durante ese proceso, algunos de los no específicos que sabe el producto se va a formar.Y eso en realidad va a empezar a comer sus enzimas primers y toda esa maquinaria y por eso la producción en general va a ser menos y por otro lado en realidad va a darle el producto no específico. Por lo tanto, lo que la gente hace en caliente es que mantienen el ciclo en funcionamiento y luego dejan que la máquina llegue a una temperatura de 100 grados celsius o 95 grados celsius una vez que la máquina llegue a esa temperatura en particular.Entonces mantienen las reacciones en la máquina entonces en realidad ponen la reacción que es cómo realmente se llama el inicio caliente porque usted está comenzando la reacción o usted está incubando las reacciones sólo cuando está en las condiciones de calor. Aparte de eso también se puede jugar mucho con los primers porque los cebadores son la corteza o usted sabe el cuello de botella mayor si usted no está recibiendo el producto amplificado que podría ser debido a que usted sabe los primers.Debido a que el primer lo que usted está sintetizando puede tener múltiples problemas. Por lo tanto, todo eso de todos modos vamos a discutir entonces las enzimas de todos modos ya hemos discutido que si usted está recibiendo las mutaciones, entonces usted puede utilizar la polimerasa de ADN de Pfu en lugar de la polimerasa de ADN Taq. Y luego también tienes los algunos de los aditivos como puedes usar el DMSOpuedes usar la betaína y todo ese tipo de aditivos para que en realidad pueda romper las estructuras secundarias.(Referir Slide Time: 22:43)Ahora puedes hacer optimizaciones para que lo que sea la optimización si supones no ver productos o si no ves un producto de tu tamaño correcto. Así que cuando se inicia una PCR normalmente se sabe que qué producto debería esperar por ejemplo, si estoy esperando un producto de 1.3 kB si estoy obteniendo una amplificación de 0,6 kb que significa que no estoy obteniendo el producto adecuado. Así que, lo que tienes que hacer es en ese caso, primero tienes que hacer es que debes comprobar la calidad del ADN de la plantilla que significa tu ADN de la plantilla que reduce la temperatura de recocido.Porque esa puede ser la razón de que la imprimación no es vinculante a la temperatura de recocido que el cebador no es vinculante para el ADN objetivo, se aumenta el cloruro de magnesio por lo que, en realidad va a proporcionar la energía en el sistema y por lo tanto, en realidad está pidiendo a la polimerasa Taq ADN para trabajar más eficientemente se puede añadir el DMSO, así como la betaína que en realidad va a afectar a la estructura secundaria de la usted puede usar otros en enzimas termoestables o en última instancia si nada funciona entonces usted puede realmente lanzar sus cebadores existentes y usted puede en realidad la síntesis de la nueva imprimación porque lo que sucede es en algún momento cuando los primers están siendo suministrados y usted está configurando las reacciones los primers son un solo ADN varado. Por lo tanto, estos ADN de una sola hebra son muy susceptibles para los DNases.Así que si usted tiene cualquier tipo de degradación de esos ADN, en realidad va a afectar a las amplificaciones generales. En segunda condición es que si usted tiene los productos adicionales como si usted está esperando 1.3 kb, pero en lugar de eso usted también está obteniendo pocos productos más en ese caso. Usted aumenta las temperaturas de recocido que reduce el cloruro de magnesio y reduce el número de ciclos.Y usted intenta otra enzima que intenta la enzima que en realidad está teniendo la alta fidelidad que significa la enzima que va a proporcionar más especificidad. Por lo tanto, en ese caso la enzima va a ser específica para su secuencia de destino específica en comparación con la secuencia objetivo no específica y es decir, cómo podría ser capaz de eliminar estas bandas no específicas.(Consulte el tiempo de la diapositiva: 25:01)Entonces usted tiene que analizar la PCR para que tenga que hacer el análisis de la reacción PCR de modo que una vez que un ciclo de PCR es completo, el producto amplificado se carga en gel de agarosa y se observa después de que el bromuro de etidio con la fuente de luz UV una reacción en blanco de agua también se ha añadido. Por lo tanto, que usted puede ser capaz de monitorear si habrá una pregunta no específica. Así que en lugar de añadir una plantilla también se puede añadir el agua.Por lo tanto, que sabrá qué tipo de amplificación obtendrá si sólo habrá agua presente y lo ideal es lo que hace es correr con el marcador de 1 kb. Por lo tanto, este es el marcador de ADN es una amplificación negativa, donde se ha añadido el agua y esta es la aplicaciones positivas donde realmente se va a conseguir la banda única. Por lo tanto, este es el ADN amplificadode su interés y entonces usted puede ser capaz de calcular si estoy obteniendo el tamaño deseado o no.Así que por ejemplo en este caso estoy consiguiendo una banda de 1.3 kb por lo que es una banda deseable y lo que usted verá es que usted está recibiendo un reductor de luz de los primers porque los primers no se están utilizando en la reacción negativa, por lo que es por eso que se están presentando en las reacciones. Por lo tanto, todo esto se trata de la PCR y de cómo configurar la PCR y hemos preparado una demostración muy pequeña para mostrarle cómo configurar las reacciones de PCR cómo analizar las mezclas y cómo analizar los productos y en esta demostración en particular los estudiantes han discutido diferentes pasos relacionados con la PCR.(Consulte el tiempo de la diapositiva: 26:28)Ahora cuáles son las ventajas de la PCR por lo que las ventajas de la PCR es que en realidad es un proceso rápido es fácil de realizar, lo que significa que es realmente muy fácil que usted puede simplemente tomar las plantillas y usted mezcla todas estas recetas en una especie de conocimiento de un orden particular y luego usted acaba de ponerlo en la máquina y que en realidad le va a dar el producto deseado es muy sensible, lo que significa que si usted puede modular usted realmente va a obtener los resultados deseables.Y es muy robusto, lo que significa que en realidad va a darle los resultados reproducibles así que si usted tiene la misma secuencia de primers, usted tiene la misma plantilla y usted tiene la misma enzima. En realidad es muy, muy robusto le seguirá dando los resultados y es por eso que usted puede ser capaz de utilizar el imprimador para muchas aplicaciones como usted puede utilizarlo para el diagnóstico y todo eso porque es muy robusto por lo que realmente va a dar los resultados deseables.(Consulte el tiempo de la diapositiva: 27:22)¿Cuáles son las limitaciones de la PCR? La limitación de la PCR es que requiere el objetivo de la necesidad de una secuencia de la información objetivo como usted tiene que diseñar un primer. Así que hasta que no tenga la secuencia de destino, es muy difícil para el primer diseño. Entonces usted requiere la fidelidad de la replicación del ADN, por lo que Taq ADN polimerasa es un ADN de baja fidelidad. Así que en realidad no te va a dar una amplificación suficiente y el error va a ser alrededor del 40%.Así que, en realidad va a ser bueno para los pequeños tramos de ADN pero no es bueno para los largos tramos de ADN y luego la PCR teniendo una limitación en términos de la que conoces amplificación de los diferentes tamaños de ADN hasta 5 kb de ADN se puede amplificar fácilmente con la ayuda de la PCR. Pero si vas más allá de los 5 kb como hasta 40 kb todavía el ADN puede ser amplificado con algunas modificaciones.Pero si vas más allá de eso no puede ser capaz de amplificar el gen que es de 100 kb lo que significa que en realidad está teniendo las limitaciones y esa limitación en realidad está causando mucho problema porque no se puede usar la PCR para secuenciar los genomas y no se puede usar ese PCR para esa aplicación en particular. Así que es por eso que la PCR siempre se ha limitado a aquellas aplicaciones en las que tienes un muy pequeño tramo de ADN y como por ejemplo 1 kb, 2kb para que realmente te va a dar los productos amplificados.Así que, todo esto se trata de las reacciones en cadena de la polimerasa y hemos discutido sobre los diferentes tipos de aspectos técnicos, cómo configurar las reacciones y cuáles son los diferentes parámetrosque debes tener en cuenta mientras estás configurando la PCR y al final también te vamos a mostrar una demo que en realidad vamos a mostrar todos los pasos que vas a hacer y con esto me gustaría concluir mi conferencia aquí. Gracias.