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Amplificación del ADN

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Amplificación del ADN


Hola a todos, este es el Dr. Vishal Trivedi del departamento de biociencia y bioingeniería IIT Guwahati y hoy vamos a iniciar un nuevo módulo y nuestro nuevo módulo va a tratar con las herramientas de biología molecular. Por lo tanto, las herramientas de biología molecular normalmente se ocupa de las moléculas que son importantes para el sustento o para el mantenimiento de la vida. Por lo tanto, hay 4 moléculas principales que son importantes para mantener la vida uno su ADN, el segundo es el ARN, el tercero es la proteína y el cuarto son los lípidos.
Por lo tanto, la biología molecular normalmente trata con toda la macromolécula especialmente el ADN, el ARN y las proteínas. Por lo tanto, cuando hablamos de un ADN se amplifica el ADN con una técnica conocida como reacciones en cadena de la polimerasa.
(Véase el tiempo de la diapositiva: 01:56) Por lo tanto, el, como su nombre indica, la reacción en cadena de la polimerasa es una técnica que se utiliza para amplificar una gran cantidad de moléculas de ADN de doble cadena con el mismo tamaño idéntico y la secuencia por el método enzimático y las condiciones cíclicas. Lo que significa es que ustedes tienen ADN original, que es el ADN original y este ADN original está siendo amplificado para múltiples ciclos.
Y así es como usted realmente va a tener las múltiples copias como usted tiene las 4 copias múltiples que en realidad van a ser idénticos.
Lo que significa que la secuencia de todos estos fragmentos va a ser idéntica a la secuencia original y también van a ser amplificados con la ayuda de las enzimas. Así que, si quieres entender el proceso de reacciones en cadena de la polimerasa, tienes que entender los 2 componentes básicos. Uno, hay que entender sobre el ADN. El segundo que hay que entender sobre la maquinaria enzimática, ¿qué es importante para amplificar el ADN?
Entonces, empecemos por entender primero el ADN y luego vamos a entender sobre la maquinaria y luego posteriormente también vamos a entender cómo la gente ha desarrollado la técnica y entonces también vamos a entender todos los aspectos técnicos relacionados con las reacciones de cambio de la polimerasa.
(Consulte el tiempo de la diapositiva: 03:27) Por lo tanto, el ADN es un ácido nucleico y que está compuesto por las 2 cadenas de bloques de unión de nucleótidos de cortesía que significa en un ADN típico, usted tiene las 2cadenas, una es la 5 prime a 3 prime y la 3 prime a 5 prime. Ambos son hilos conectados por los nucleótidos que están presentes en el interior y el nucleótido se compone de un grupo de fosfato, 5 de azúcar de carbono y una base de nitrógeno.
Por lo tanto, como usted sabe que cuando la base se está sumando con el azúcar, en realidad está formando el nucleósido. Y cuando el nucleósido se une con el fosfato, se llama como nucleótido. Así que el ADN está hecho de los nucleótidos. Por lo tanto, en realidad es una macro molécula donde se tiene la cadena 1 de los nucleótidos conectados a otra cadena de nucleótidos y estas 2 nuevas cadenas de los nucleótidos son complementarias entre sí.
(Ver Diapositiva: 04:47) Así, el ADN tiene las 4 bases de nitrógeno, usted tiene las 2 purinas como las 2 bases anilladas como la adenina y la guanina. Y luego tienes las 2 pirimidinas como la citosina y la timina. Estas 2, 4 bases están unidas en un patrón repetido por la unión de hidrógeno entre las bases de nitrógeno. El enlace de las 2 hebras complementarias se llama como la hibridación. Así, A está haciendo un par con T y G siempre está haciendo un par con C.
Por lo tanto, lo que ves es que el A está haciendo un par con T con la ayuda de la unión de 2 hidrógeno mientras que el G está haciendo nuestro enlace de hidrógeno con C con la ayuda de la unión de 3 hidrógeno que significa, la fuerza de la interacción de A a T es más débil en comparación con la interacción de G a C.
(Consulte la hora de la diapositiva: 05:46)
Y debido a que el A está haciendo un par con T y G está haciendo un par con C, el ADN es de cortesía en la naturaleza. Lo que es medio de cortesía en la naturaleza es que si usted tiene una primera secuencia que se llama como la hebra primaria, entonces usted puede ser capaz de deducir la secuencia complementaria. Por ejemplo, en este caso, tenemos una secuencia primaria que es GGC TAT GTG y lo que se ve es que donde quiera que tenga la G es en realidad tener una C en una línea de cortesía.
Por lo tanto, esa es la forma en que realmente va a mantener la complementariedad. Cómo la complementariedad te va a ayudar en términos de lo que sabes vienen conservando las moléculas porque, si tienes la hebra 1, puedes ser capaz de generar la hebra 2, porque la hebra 1 es complementaria entre sí o si tienes la hebra 2, puedes ser capaz de generar una hebra 1 y ese es el principio básico al que está funcionando el mecanismo de PCR.
Por ejemplo, si tengo esta secuencia en particular y si quiero sintetizar el apartado 2 lo que puedo hacer es simplemente unir unas bases de nucleótidos cortas y luego puedo poner maquinaria T y que la maquinaria realmente va a sintetizar las secuencias complementarias que significa, estoy buscando una maquinaria que realmente pueda reconocer esta secuencia de ADN y entonces esa maquinaria podría ser capaz de entender que el ADN es de cortesía en la naturaleza.
Entonces, lo que sucederá es, si tengo esta secuencia, la maquinaria se va a sentar en esta secuencia y entonces realmente va a aceptar el nucleótido de lo que usted va a suministrar y entonces realmente va a sintetizar la hebra complementaria. Y una vez que llegue al final de la secuencia, sabrá que ahora, la síntesis ha terminado. Por lo tanto, en realidad va a terminar. Así que, ahora, hasta ahora lo que hemos discutido hemos discutido sobre la molécula que en realidad va a ser amplificada durante las reacciones en cadena de la polimerasa.
Y ahora, lo que vamos a entender que vamos a entender acerca de la maquinaria para la maquinaria de síntesis de ADN es la base de la vida en la tierra o la maquinaria de síntesis de ADN es muy crucial para la duplicación del ADN.
(Consulte la hora de la diapositiva: 08:23)
Y la síntesis del ADN está vinculada a la división celular, así como al crecimiento. Así que este es un ejemplo de la bacteria. Por lo tanto, lo que se ve es que tenemos la bacteria que en realidad está teniendo una sola copia del genoma del gen. Y lo que sucederá es que el primer evento en sí es que el genoma en realidad va a duplicarse en 2 copias. Por lo tanto, en última instancia va a tener 2 copias del genoma y entonces en realidad va a ser dividido por longitudinalmente y es como en realidad va a tener las 2 colonias bacterianas.
De manera similar, para en el prokaryote, tiene los múltiples eventos a través de los cuales realmente pasa y entonces realmente va a ser dividido en 2 y que todos los eventos en realidad están siendo llamados como el ciclo celular. ¿Cuáles son estos acontecimientos? Usted tiene un G1. Por lo tanto, en el G1, usted realmente va a aumentar la cantidad de citosol y realmente va a preparar la célula para la fase de síntesis y entonces usted está realmente entrando en una fase de síntesis.
Así que, en la fase de síntesis o en la fase S, ustedes realmente van a hacer una síntesis de ADN que significa que van a hacer una primera copia del ADN y van a sintetizar la segunda copia del ADN que significa ahora que el ADN va a ser duplicado, lo que significa que ahora van a tener los 2 genomas. Al igual que en esta etapa y ahora entrará en la fase G2. G2 también es etapa de preparación.
Por lo tanto, aquí también habrá algunas etapas adicionales de preparación. Y entonces la célula entrará en la fase mitótica. Y en esta fase, la célula se va a dividir en 2. Así que la célula original volverá a pasar con el ciclo celular mientras que en realidad le va a dar la 1 copia más de la célula. Para eso si realmente bloquean la síntesis del ADN, si bloquean este paso, realmente van a interrumpir el ciclo celular. Y así es como ustedes realmente van a detener la multiplicación, así como el crecimiento de una célula en particular.
(Consultar Tiempo de Slide: 10:37) Así, proceso de duplicación de todo el genoma antes de la división celular. Por lo tanto, la replicación del ADN es un proceso que ocurre en la célula antes de la duplicación de las células. Y eso ocurre dentro de la fase S. Por lo tanto, tiene un significado biológico que la replicación del ADN es un proceso muy preciso. Y requiere, para preservar la integridad del genoma en una generación sucesiva, lo que significa que si realmente va a generar las mutaciones.
O si usted está comenzado a generar las modulaciones dentro de la secuencia del genoma, lo que obtuvo de la célula original, eventualmente va a seguir alterando las secuencias de ADN y eso en realidad no le va a saber, lleve la misma información porque la función principal del ADN es llevar la información genética. De modo que en realidad va a permitir que las células hijas sigan ejecutando el tipo de metabolismo similar.
Por eso es importante que la replicación del ADN sea exacta. De modo que debe producir la copia idéntica a fin de preservar la secuencia del ADN, así como debe preservar la integridad del genoma. Y eso debería continuar durante varias generaciones. En eucariotas, la replicación sólo ocurrió durante la fase S del ciclo celular. La velocidad de replicación en un eucariote es más lenta dando como resultado una mayor precisión de fidelidad de la replicación en eucariotas.
(Consultar Tiempo de Slide: 12:15) Ahora, la replicación del ADN está teniendo las diversas características. Por ejemplo, la replicación del ADN es semi conservadora, lo que significa que la replicación del ADN va a ser un medio semi-conservador cuando usted realmente va a sintetizar por ejemplo, si este es el 2 de los capítulos 1 y 2, en realidad le va a dar las 4 copias de 4 hebras. Pero en este apartado 4 se van a separar los 1 y 2 y en realidad se van a sintetizar los 3 y 4.
Por lo tanto, la nueva hebra, lo que se sintetiza en realidad va a hacer un par con las hebras originales y este proceso se llama como los modos semi-conservadores. Así que este es el 1 y 2 son en realidad viniendo de los padres, mientras que los 3 y 4 son en realidad las cepas recién sintetizadas. Esto significa que la información que usted tiene en el ADN original se va a dividir en 2.
Y por eso no va a ser conservador lo que significa que no va a hacer que la pareja sea 1, 2 y 3, 4. En realidad va a hacer un par como 1 y 3 y 2 y 4.
Eso es en realidad un modo semi conservador de replicaciones. Si quieres estudiar más sobre o si estás interesado en estudiar más sobre cómo las personas han descubierto el modo semi-conservador, puedes pasar fácilmente por alguna de las reservas de biología molecular y puedes leer sobre los algunos del experimento clásico qué se ha diseñado y cómo la gente ha descubierto que la replicación del ADN es semi conservadora en la naturaleza. Se inicia en el origen de la réplica.
Para la síntesis de ADN no comienza en lugares aleatorios, requiere un lugar donde realmente puede comenzar para que el lugar sea llamado como el origen de las replicaciones. En la célula bacteriana, usted tiene el único origen de la replicación, mientras que en la célula eucariota, usted tiene los múltiples lugares del origen de las replicaciones porque el genoma bacteriano es más pequeño en la naturaleza. Por lo tanto, en realidad no requiere el origen múltiple de replicaciones en comparación con que los genomas eucariotas son más grandes en tamaño.
Por lo que requieren el origen múltiple de la replicación. De modo que la aplicación; puede iniciarse en varios lugares. Y así es como en realidad puede ser capaz de completar las replicaciones en un plazo determinado. Porque usted sabe que la replicación es importante para hacer una segunda copia del genoma. Para que la célula entre en la fase G2 y M y así es como en realidad va a dividir y darle el mayor número de células.
Así que es por eso que la y como fase es en realidad el cuello de botella de todo el proceso y que por lo que la replicación del ADN tiene que ser en sincrónica con la fase mitótica, así como la fase G2. La síntesis de ADN por la ADN polimerasa siempre ocurre en la dirección que se llama como las 5 primeras a 3 direcciones principales. Por lo tanto, usted sabe que ese ADN es en realidad un polímero de los nucleótidos y nucleótidos tienen 2 hebras como 5 prime y 3 prime.
Por lo tanto, si dibuje una estructura de nucleótidos típica, lo que usted verá es que esto es realmente un azúcar entonces esta es la base. Así, por ejemplo, he puesto A y aquí tienes el azúcar y en este cuarto carbono, tienes el quinto carbono y luego tienes el CH2 y luego tienes el grupo de fosfato. Por lo tanto, este es en realidad el 5 prime end y este es el 3 prime end porque aquí tienes el OH. No, este es el 3 prime end y este es el 2 prime end. Entonces, esto es en realidad ustedes van a tener OH y eso es OH, lo que realmente pueden ser capaces de usar.
Por lo tanto, si la síntesis de ADN está ocurriendo, en realidad está utilizando este 5 prime OH o el 3 prime OH lo que significa que es por eso que el ADN tiene una direccionalidad que en realidad va de 5 prime a 3 prime y 3 prime a 5 prime porque este es el hilo complementario. Por lo tanto, la síntesis de ADN siempre ocurre en una dirección que es llamada como el 5 primo a 3 prime lo que significa que realmente va a iniciar la síntesis en la hebra, la hebra que está teniendo los 3 primeros extremos.
Y así es como en realidad va a sintetizar en esta dirección porque las frases estarán en la dirección. Podría ser unidireccional o bidireccional, lo que significa que puede ser en esta dirección o puede ser en ambas direcciones simultáneamente. Es un semi discontinuo. Por ejemplo, por lo tanto, semi discontinuos significa que en realidad va a continuar durante algún tiempo y luego va a parar y luego va a continuar de nuevo por eso y es por eso que en realidad va a crear los 2 tipos diferentes de hebras.
1 se llama como la cadena principal, la otra 1 se llama como la hebra rezagada. Por lo tanto, esta es la hebra que se llama que es en realidad sintetizando el ADN en los múltiples pasos se llama como la hebra rezagada mientras que la hebra que parte de un extremo y va continúa así se llama como la cadena líder. Y para cualquier proceso de replicación del ADN, se requiere un imprimador y ese cebador se sintetiza mediante una enzima que se llama como el imprimador de ARN. Los primers de ARN y los cebadores que se han utilizado en la replicación del ADN están hechos fuera del ARN y esto ha sido sintetizado por la ARN polimerasa.
(Hora de la diapositiva: 18:01) La replicación del ADN tiene 3 pasos. Tiene como iniciación. Por lo tanto, en la iniciación el ADN se va a preparar para la síntesis. Lo que significa la iniciación es que en el paso de iniciación la proteína se unirá al ADN. Así que, ya saben, el ADN es una estructura doble helicoidal. Por lo tanto, esta doble estructura helicoidal primero tiene que ser recta, por lo tanto, que primero usted tiene que quitar la helicidad de este ADN en particular. Por lo tanto, usted va a generar primero el ADN como el ADN de doble hebra y entonces usted tiene que realmente romper las 2 hebras por separado.
Por lo tanto, que en realidad va a estar listo para aceptar esto es maquinaria y eso es lo que están sucediendo los acontecimientos cuando realmente van a los estados de iniciación. En los estados de iniciación, la proteína se unirá al ADN y entonces habrá una abertura del ADN de doble hélice. Por lo tanto, que en realidad va a ser un solo ADN varado. Por lo tanto, el ADN único varado se va a generar en la etapa de iniciación entonces usted tiene los pasos de alargamiento.
Por lo tanto, en los pasos de elongación, la maquinaria del ADN va a ser puesta en esto y así como en esto y entonces realmente va a empezar a agregar los nucleótidos y así es como en realidad va a comenzar la síntesis de las segundas hebras. Por lo tanto, en los pasos de elongación la proteína conectará la secuencia correcta del nucleótido en nuevas hebras continuas de ADN. Y una vez que la maquinaria de ADN va a ser alcanzada a las esquinas como el final de la secuencia, en realidad va a detener la síntesis.
Y eso es lo que el tercer paso que es el tercer paso es la terminación que realmente va a detener la síntesis del ADN. Y una vez que la síntesis del ADN ha terminado, el ADN tiene que volver a recuperar su forma original y ese es el paso que se requiere si usted una vez que usted antes de que usted hace la terminación, lo que significa una vez que la síntesis ha terminado, el ADN se va a convertir primero en una estructura doble helicoidal y luego de la estructura doble estándar, usted tiene que generar una estructura doble helicoidal.
Entonces, esa es la razón por la que la síntesis del ADN es un proceso muy, bien controlado donde primero tienes que hacer la iniciación, donde el ADN tiene que ser roto en las 2 hebras diferentes y entonces las 2 diferentes hebras van a ser sabidas ocupadas por la maquinaria de síntesis de ADN y lo que la maquinaria de síntesis de ADN va a hacer? Por lo tanto, la maquinaria de síntesis de ADN involucra las polimerasas de ADN que realmente van a sentarse en la enzima.
Y entonces en realidad van a leer la secuencia original y en base a la secuencia original, en realidad van a añadir los nucleótidos a la segunda hebra y así es como en realidad va a iniciar la síntesis de la segunda hebra y una vez que lleguen al final, eso es lo que la fase de elongación y una vez que llegan al final de la secuencia, en realidad van a iniciar los pasos de terminación. Entonces, una vez que la síntesis haya terminado, en realidad va a generar el ADN estándar doble y entonces el ADN estándar doble realmente va a ser enrollado y entonces va a generar las estructuras helicoidales.
(Ver Diapositiva: 21:20) Hay diferentes enzimas que están involucradas en este proceso de replicación del ADN. Por lo tanto, usted requiere las helicoidasas que en realidad van a separar las 2 diferentes hebras. Entonces usted requiere la primasa que es en realidad nuestra ARN polimerasa. Por lo tanto, en realidad va a ser necesario para hacer una síntesis de los primers de ARN. Entonces usted requiere de las proteínas de ADN de cadena única. Por lo tanto, las proteínas de ADN de una sola hebra en realidad van a unirse a las 2 hebras como esta, de modo que no deben unirse y de nuevo reanneals.
Y así es como en realidad va a mantener el ADN estándar único. Entonces usted requiere la ADN polimerasa que en realidad va a hacer una síntesis de nueva hebra y luego se requiere la proteína tethering que en realidad va a estabilizar las polimerasas en las hebras.
(Consulte el tiempo de la diapositiva: 22:10) Por lo tanto, la síntesis del ADN tiene los 3 pasos. 1 es llamado como la iniciación que realmente va a preparar el ADN para la síntesis. Por lo tanto, lo que están haciendo, en realidad están tomando un ADN y luego están realmente generando las 2 hebras entonces en los pasos de elongación, estamos haciendo la síntesis del ADN. Por lo tanto, una vez que sus 2 hebras están listas, entonces lo que usted puede hacer es en realidad va a tomar y añadir los cebadores. Por lo tanto, en este caso los primers de ARN y así, los dos primers se van a sentar y luego se va a añadir las enzimas.
Así que la enzima va a estar sentada a estas hebras. Y así es como en realidad va a comenzar la síntesis y una vez la terminación, para que usted pueda detener la síntesis del ADN. Entonces, lo que sucederá, una vez que llegue a este punto, esa enzima va a caer de las hebras y que en realidad va a completar la síntesis del ADN y entrará en las terminaciones. Así que ahora lo que ves es que estos son los procesos que hacemos bajo la síntesis del ADN.
Y lo que sucede dentro de la célula puede ser imitar incluso fuera de la célula porque todos estos eventos pueden ser controlados incluso sin pasar por usted conoce algunas de las enzimas lo que usted requiere. Por ejemplo, usted requiere las helicoidasas, de modo que en realidad va a generar el ADN único varado y que es como en realidad va a hacer lo suficiente y entonces se requiere el único estándar de proteínas de unión de ADN.
De modo que las hebras de ADN que han sido generadas por las helicoidasas permanecerán como el único varado. Para estos 2 procesos puede ser simplemente hecho por si usted calienta estas hebras en particular. Así que si calientan este hilo en particular, lo que sucederá es que el ADN estándar doble va a estar abierto en las plantillas de una sola cadena. Y así es como usted puede ser capaz de utilizarlos. Ahora en la fase de elongación, lo que puedes hacer es simplemente añadir los pequeños tramos de secuencias de ADN, que en realidad va a ser llamado como la imprimación.
Y así es como es y luego se puede agregar la enzima. Así que, así es como usted realmente va a iniciar el proceso de síntesis. Y una vez que llegue al final, en realidad va a ser una caída de la plantilla y por lo tanto en realidad va a terminar en las terminaciones. Así que mantener estos eventos y darse cuenta de que estos eventos se pueden hacer bajo las condiciones del invitro. La gente ha conceptualizado el proceso de reacción en cadena de la polimerasa y es así como en realidad comenzaron a desarrollar la técnica. Pero hay múltiples pasos y múltiples fases en las que se desarrollan las reacciones en cadena de la polimerasa.
(Consultar tiempo de la diapositiva: 25:08) Así, hay múltiples eventos que la gente ha hecho incluso para desarrollar la PCR para el. Así que en la década de 1950 la gente ha descubierto cómo está sucediendo la replicación del ADN y eso lo está haciendo el Arthur Kornberg y descubrió la primera ADN polimerasa y otros factores como la helicoidasa en y los Primers. Así, en la década de 1950, cuando el Arthur Kornberg descubrió realmente las polimerasas de ADN, así como el mecanismo de replicaciones y helicasas y primasas de ADN, es así como la gente sabe que el ADN en realidad se ha replicado.
Y requiere una enzima y hay una enzima. Pero, ¿cuál es el problema? El problema es la ADN polimerasa lo que ha sido descubierto por Arthur Kornberg es en realidad la temperatura sensible que significa que no es capaz de soportar una temperatura muy alta. Y usted sabe, que, como dije en la última diapositiva en sí, que cuando usted quiere imitar estas condiciones bajo las condiciones del invitro, la única manera que usted puede ser capaz de escapar de las helicasas y todas las otras proteínas es que usted puede realmente calentar el ADN.
De modo que el ADN llegará a las 2 hebras y esas 2 hebras se mantendrán como una sola hebra estándar sólo si se mantiene la temperatura muy alta. Pero una vez que usted trae la temperatura alta, la enzima, lo que ha sido reportado por el Dr. Kornberg en realidad va a ser inactivado. Y por eso no pasó nada hasta que en 1976 la gente ha descubierto la primera polimerasa termoestable de ADN del thermo aquaticus y que la polimerasa termo ADN se llama como la taq ADN polimerasa y esa taq ADN polimerasa es muy, estable.
Puede ser resistente a la temperatura de 95 grados centígrados lo que significa que usted puede ser capaz de usar esta enzima en múltiples rondas. Y usted no necesita, usted sabe, usted no necesita agregar la enzima en, usted sabe, para cada ciclo usted tiene que continuar. Luego en 1983, Kary mullis sintetiza que las sondas de ADN oligo para la anemia de células falciformes. Y luego 1983, sólo hizo el repetido ciclismo térmico se utilizó por primera vez para clonar un pequeño segmento del ADN del genoma.
Y luego en 1984, el mullis Kary y Tom White intentaron el experimento de diseño para probar PCR en el ADN genómico pero el producto amplificado no era visible en el agarosa. Luego, en 1985, se presentó la primera patente para su aplicación con respecto a la detección de las mutaciones de anemia de células falciformes. Y el 1985, el primer uso de la polimerasa de ADN termoestable en PCR se inició de sólo 2 enzimas, la polimerasa de ADN taq, conocida en el momento en que la taq se encontró más adecuada para la PCR.
Y 1985 a 1987 la gente ha descubierto mucho sobre los diferentes tipos de instrumentos y por lo que hay un montón de descubrimientos y el desarrollo más adelante con la ayuda de las instrumentaciones.
(Consultar Tiempo de Slide: 28:29) Entonces, lo que básicamente la gente está haciendo en una reacción en cadena de la polimerasa. Por lo que la PCR es una reacción ciclista repetida que implica el mecanismo de replicaciones de ADN. Resulta en la producción de múltiples copias de ADN de un solo 1, todo el proceso involucra 3 eventos, uno se llama desnaturalización, recocido y elongación. Así que lo que sucede así como puedes imaginar que empezaste con copia original del ADN de doble cadena.
Así que bajo la desnaturalización, cuando se ha calentado la muestra a 95 grados centígrados, lo que sucederá es que las 2 hebras de la copia original se van a separar y le dará las 2 hebras. Ahora lo que vas a hacer es que vas a entrar en la fase de recocido donde realmente vas a bajar la temperatura. Por lo tanto, que los primers van a comprar y entonces usted realmente va a tener los primers.
Así que en realidad va a añadir los primers y así es como en realidad va a unir la imprimación en 1 extremo de este ADN, así como el 1 extremo de este ADN. Y entonces la enzima entrará en la fase de elongación. Y la enzima en realidad va a utilizar este pequeño ADN de imprimación y así es como en realidad va a sintetizar toda la hebra y así es como usted realmente va a obtener el ADN de doble hebra al final.
Entonces, esto en realidad va a constituir el primer ciclo o el primer ciclo. Después del primer ciclo, desde que usted comenzó con el ADN, usted realmente va a obtener 2 ADN. Pero como se puede ver, en realidad es un semi-conservador, lo que significa que la 1 hebra es del ADN original. Y la segunda hebra es la nueva hebra de ADN sintetizada. Ahora, puedes imaginar que lo mismo sucedió en el segundo ciclo.
Pero ahora, este también es estos 2 hebras también van a servir como una plantilla. Y así es como usted realmente va a obtener las 4 copias y en el tercer ciclo, usted va a obtener las 8 copias que significa un fragmento de ADN de interés se utiliza como una plantilla a partir de la cual un par de cebador o oligonucleótido corto complementarios a ambos la doble hebra del ADN se hacen para prime la síntesis de ADN donde la dirección de síntesis o la extensión es de 5 prime a 3 prime como fue en el caso de las replicaciones de ADN el número de ADN amplificado.
O los amplicones aumentan exponencialmente por ciclo por ejemplo, si comienzas con la molécula de 1 ADN, después del primer ciclo, va a ser a ADN, después de segundo ciclo va a ser 4, después del tercer ciclo va a ser 8. Así que, si contináis que en realidad está continuando como este ciclo así. Por lo tanto, en realidad se está duplicando después de cada ciclo y así es como en realidad le va a dar una amplificación muy alta incluso de la molécula 1.
Así que, si te imaginas que si empecé con 1 microgramo de ADN, en realidad va a ser varios microgramos de ADN e incluso dentro de ese 20, 25 ciclos. Por lo tanto, la cantidad de ADN amplificado que puede ser capaz de calcular simplemente poniendo esta fórmula que es la C es igual a C0 1 más E a la potencia n donde la C es la cantidad final de ADN, C0 es la cantidad inicial de ADN, E es la eficiencia y n es el número de ciclos y S es la pendiente de la fase exponencial y que usted puede ser capaz de calcular a partir de las ecuaciones en particular.
Así que, usted puede ver que la reacción en cadena de la polimerasa en realidad utiliza el concepto similar lo que está sucediendo en el durante las replicaciones de ADN, pero en lugar de utilizar los múltiples factores y mecanismos tan complicados, lo que usted está haciendo es simplemente calentar las reacciones, está haciendo las 2 hebras, entonces usted está añadiendo los primers, lo que significa que el pequeño ADN se extiende y entonces usted está pidiendo a la enzima utilizar estos primers para sintetizar y luego una vez que la síntesis ha terminado, entonces otra vez usted está trayendo la temperatura de vuelta y continuando el mismo ciclo y que es como usted está realmente haciendo el múltiples reacciones.
(Consultar Tiempo de Slide: 32:58) Así que la reacción en cadena de la polimerasa requiere los 4 eventos. Así que si usted configura las reacciones en cadena de la polimerasa, usted requiere la desnaturalización inicial que significa que usted tiene que calentar la mezcla de PCR en 94 a 95 degree durante 10 minutos para desnaturalizar completamente el ADN de la plantilla. Así que cuando vas a iniciar las reacciones de PCR, tienes que traer primero las reacciones y luego vas a hacer primero la desnaturalización inicial donde en realidad vas a calentar la mezcla a 95 grados centígrados durante 5 a 10 minutos.
Y entonces en realidad vas a entrar en la etapa 2 donde vas a volver a calentar la plantilla durante 30 segundos a 45 segundos. Y eso en realidad va a ser nuestros pasos de desnaturalización. Así que en los pasos de desnaturalización, este es el primer paso en el que el ADN de doble hebra va a ser desnaturalización para formar el ADN estándar único al calentar el ADN a 95 grados centígrados durante 15 a 30 segundos. Ahora, usted va a bajar la temperatura.
Así que eso va a ser pasos de recocido. Así que en el paso de recocido, este es el paso de recocido donde la temperatura más baja como 50 a 65 grados centígrados, los cebadores están permitidos para unirse a la plantilla de ADN y el tiempo de enlace es de 15 a 30 segundos y depende de la longitud y las bases de los cebadores. Así que lo que usted va a hacer es que usted es que usted tiene más abajo de la temperatura para que los cebadores que realmente están flotando y que son pequeños estiramiento de ADN ahora van y se unen a su ADN complementario presente en la plantilla.
Y ahora, la enzima reconocerá este complejo D en particular y es así como la enzima iniciará la síntesis. Así que después del recocido entrará en la fase de elongación. Así que este es el paso de síntesis donde la cadena de la polimerasa realizó la síntesis de la nueva hebra en las 5 primeras a 3 direcciones principales utilizando los cebadores los dNTPs o los trifosfatos de nucleótidos desoxirribo.
Y la polimerasa de ADN promedio agrega alrededor de 1000 pares base por minuto lo que significa, después de que el recocido ha terminado y los dímeros de imprimación han formado el complejo, usted va a aumentar de nuevo la temperatura. De modo que usted se asegurará de que el ADN de la plantilla no debe unirse entre sí y entonces la enzima vendrá a sentarse en estos complejos y en realidad va a hacer una síntesis de ADN.
Y como un promedio de 1000 pares base se va a sintetizar dentro del minuto donde si usted suministra la cantidad adecuada de los nucleótidos desoxirribo en la mezcla. Así, los pasos 1 y 2, 3 harán 1 ciclo. Así que esta etapa a través de medios como el paso 1, 2 y 3 está realmente constituyendo el primer ciclo. Y usted puede pedir a la máquina que continúe el ciclo para otro