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Citocinas

Hola a todos, este es el Dr. Vishal Trivedi del departamento de biociencias y bioingeniería IIT, Guwahati. Y en este módulo en particular, estábamos discutiendo sobre los diferentes tipos de las herramientas inmunológicas, que se basan principalmente en la interacción entre el antígeno y los anticuerpos. Por lo tanto, lo que hemos discutido hasta ahora es el siguiente.
Si el antígeno es de naturaleza insoluble entonces usted puede ser capaz de realizar las reacciones de aglutinación, si el antígeno es insoluble en la naturaleza, entonces usted puede ser capaz de realizar las reacciones de precipitación o la inmunodifusión radial y en la conferencia anterior, también hemos discutido acerca de las inmunoprecipitaciones. Aparte de eso, también hemos discutido sobre los diferentes tipos de inmunoensayos como la Eliza, el blot occidental y así sucesivamente.
Por lo tanto, con estas herramientas, usted puede ser capaz de realizar diferentes tipos de experimentos y usted puede ser capaz de responder a muchos tipos de preguntas inmunológicas o las preguntas que están relacionadas con la biología. Aparte de eso, hay una cosa adicional que usted también puede explorar con la ayuda de las herramientas inmunológicas.
(Vea el tiempo de la diapositiva: 02:17) Así que, usted puede imaginar que una respuesta celular de células inmunológicas como macrófagos o células B o células T, por ejemplo, en esta célula en este caso, es la célula T que realmente está respondiendo al ligando extracelular y en respuesta a eso, en realidad está conduciendo una señalización corriente abajo y está involucrando todas estas moléculas de señalización y al final, está activando el factor de transcripción NF kappa B.
Por lo tanto, NF kappa B va dentro del núcleo y luego está activando sus genes objetivo. Y en respuesta, en realidad está produciendo los diferentes tipos de proteínas, en realidad está cambiando las actividades transcripcionales dentro de la célula. Y como resultado, en realidad va a hacer una respuesta celular completa, si esto va a ser una respuesta celular humoral o a la respuesta celular celular.
Si va a ser una inmunidad humoral o la inmunidad mediada por células, pero al final, lo que usted va a ver es que en el caso de cualquier señalización de este tipo, lo que va a pasar es que en realidad va a cambiar la expresión génica de esa célula en particular, en realidad va a cambiar el metabolismo de esa célula en particular o también va a cambiar las proteínas de la célula y si esta célula en particular es una célula inmune.
Por ejemplo, las células T o la célula B, también va a cambiar la secreción de citoquinas de esta célula en particular. Por lo tanto, si tienes estos 4 parámetros en particular, que te gustaría monitorear tienes diferentes tipos de técnicas. Por ejemplo, si desea supervisar la creación de perfiles de expresión de genes, puede hacerlo simplemente utilizando los chips de micromatriz. Si usted quiere estudiar la metabolómica o los cambios metabólicos, entonces eso se puede hacer simplemente con la ayuda de las técnicas de RMN.
Y si usted está interesado en ver los cambios dentro de las proteínas, entonces usted puede ser capaz de hacer con la proteómica, pero cuál sería la técnica si le gustaría estudiar el perfil completo de la citoquina de una célula bajo una respuesta celular particular. Por lo tanto, a esto tenemos las múltiples opciones. Una de las maneras más fáciles es que puedas realizar la Eliza's.
(Vea el tiempo de la diapositiva: 04:51) Así que, creo que en la conferencia anterior también discutimos acerca de los diferentes tipos de Eliza lo que están disponibles para que usted explore y. Por lo tanto, las citoquinas son en realidad las moléculas de señalización. Por lo tanto, las citoquinas o la quimiocina son las moléculas de señalización que median en la célula a las comunicaciones celulares, son liberadas de las células y tienen el papel crítico en muchos procesos biológicos tales como el crecimiento celular, diferenciaciones y expresiones de genes.
Migraciones, inmunidad y las inflamaciones. En la mayoría de los procesos biológicos, las múltiples citocinas operan en una gran red, donde la acción de una de las citoquinas está regulada por la presencia o la ausencia de las otras citoquinas, esto significa, las citoquinas son en realidad muy, muy versátiles en la naturaleza. Por lo tanto, se pueden segregar de una célula, pueden ir a las 5 células más, y entonces es así como en realidad pueden ser capaces de hacer una red muy, muy complicada donde la una citosina está regulando la secreción, así como la acción de las múltiples citoquinas.
Entonces, cuál es la opción qué tenemos para medir estas muchas citocinas de una sola célula que a en un momento particular. Por lo tanto, si usted recuerda en nuestra conferencia anterior, discutimos acerca de los diferentes tipos de herramientas inmunológicas, lo que usted puede utilizar realmente para medir el anticuerpo o los antígenos.
(Ver Diapositiva Tiempo: 06:18) Así, Eliza es una de las herramientas inmunológicas que hemos discutido y hemos discutido acerca de los diferentes tipos de Eliza como el directo Eliza, indirecta Eliza, el sándwich Eliza, así como la eliza competitiva. Por lo tanto, si recuerdas que el sándwich Eliza es algo que puedes usar para medir el nivel del antígeno. Por lo tanto, el sándwich Eliza puede ser una herramienta inmunológica potencial, que en realidad se puede utilizar para medir el nivel de las citoquinas.
Pero el número de citoquinas son muy, muy grandes. Así que, si realizas el sándwich Eliza para las citoquinas individuales, en realidad va a ser un trabajo muy, muy laborioso, y por otro lado, en realidad te va a dar es tiempo de consumir y así como en realidad te va a costar mucho dinero. Así que, en lugar de hacer un sándwich Eliza, la gente ha desarrollado las matrices de citoquinas, donde se puede medir el nivel de citoquinas en un momento particular de una célula.
Por lo tanto, ya sea que use las células o el sobrenadante celular o si usa el lisado celular o si usa un tejido, puede ser capaz de medir los diferentes tipos de citoquinas. Por lo tanto, cómo funciona la matriz de citoquinas.
(Consulte el tiempo de la diapositiva: 07:39) Por lo tanto, en una matriz típica de citoquinas, lo que tiene es que tiene una membrana en la que los anticuerpos están siendo inmovilizados. Por lo tanto, estos anticuerpos individuales se dirigen contra una citocina particular como. Por lo tanto, un anticuerpo es para una sola citocina y usted tiene múltiples anticuerpos, y entonces lo que va a hacer es una vez que agregue las muestras, estas muestras son las diferentes moléculas de citoquinas.
Por lo tanto, irán y se unirán a sus respectivos anticuerpos. Y una vez que se hace con estos, entonces se puede hacer un lavado y entonces en realidad se va a añadir los anticuerpos biotinilados, estos anticuerpos biotinilados también son anticuerpo monoclonal y también estarán en contra de esta citoquinas en particular. Por lo tanto, en realidad va a tener los múltiples anticuerpos monoclonales que son biotinilados.
Y todos estos anticuerpos múltiples van a unirse a sus respectivas citoquinas. Y en última instancia en esta etapa de nuevo se va a lavar y luego se va a añadir realmente la estreptavidin que en realidad está vinculado ya sea con un fluoróforo o está vinculado a una enzima y que en realidad le permitirá con la para hacer las reacciones para visualizar las muestras y lo que vamos a ver en el chip de la matriz, que usted va a ver los puntos individuales brillando después de las reacciones.
O te van a dar la señal de fluorescencia o te van a dar la matriz quimioluminiscente 09:15 en algunos casos también puedes usar las películas de rayos X para adquirir la imagen o adquirir los datos de estos chips de matriz de citoquinas. Y en última instancia lo que puedes hacer es simplemente capturar la imagen y puedes ser capaz de hacer el análisis de esta señal en particular. Por lo tanto, la pregunta es cómo la matriz de citoquinas es diferente del sándwich Eliza.
(Consulte el tiempo de la diapositiva: 09:43) Por lo tanto, en la matriz de citoquinas, los anticuerpos de captura cuidadosamente seleccionados se están viendo por duplicado en una membrana de nitrocelulosa. La muestra o la mezcla de anticuerpos se incuba entonces con la membrana de arreglo de citocina, cualquier complejo de deteccion de citocina presente se une por su anticuerpo de captura inmovilizada de cognato sobre la membrana despues de un lavado para remover el material no enlazado.
Los reactivos de detección de estreptavidina-HRP y quimioluminiscentes se agregan subsecuentemente, la luz se produce en cada punto en proporción a la cantidad de citocina presente. Por lo tanto, esto es en realidad una matriz de citoquinas donde usted tiene una membrana donde los anticuerpos están siendo inmovilizados y estos anticuerpos se unen a las citoquinas que están presentes en su muestra. Esa matriz de citoquinas y la idea completa de hacer una matriz de citoquinas es muy similar al sándwich Eliza excepto que en este caso, estás usando los diferentes anticuerpos.
Y así como usted es en realidad es igual que usted está realizando las reacciones de 40 o 50 Eliza al mismo tiempo, pero el único problema es que los anticuerpos están inmovilizados en la membrana de nitrocelulosa y usted está usando 2 anticuerpos al igual que un sándwich Eliza. Si recuerdas en un sándwich Eliza también tenemos un anticuerpo de captura, que en realidad va a capturar el antígeno de las reacciones.
Y entonces usted está realmente añadiendo el anticuerpo monoclonal adicional que en realidad va a reconocer el antígeno, pero no con el mismo epítopo que va a reconocer con el epítopo diferente y entonces usted está realmente añadiendo el anticuerpo secundario que se acopla con la enzima y entonces usted está añadiendo el sustrato y que en realidad le va a dar la señal.
Por lo tanto, es exactamente lo mismo que la matriz de citoquinas no es más que el sándwich Eliza que es usted está realizando, pero está presente en una hoja delgada de membrana en lugar de hacerlo en el pozo. Vamos a ver cómo realizar esto.
(Consultar Tiempo de Slide: 11:51) Así que, para realizar la matriz de citoquinas, lo que necesitas es que necesitas la matriz de citoquinas de una empresa en particular que necesitas los búferes, diferentes tipos de búferes, entonces necesitas los búferes de Bosch, necesitas un anticuerpo de detección, el anticuerpo de detección también va a ser el anticuerpo monoclonal dirigido contra un conjunto de citoquinas para las cuales también se ha diseñado la matriz.
Entonces usted necesita un complejo streptavidin-HRP que en realidad va a reconocer el anticuerpo de detección y entonces usted requiere que los agentes de quimio para generar la señal. Por lo tanto, esto lo requiere para generar la señal y luego requiere el pozo o plato donde va a hacer las incubaciones con las matrices de citoquinas o también requiere una cubierta. Por lo tanto, usted protegerá la evaporación y otras cosas.
(Consultar tiempo de la diapositiva: 12:57) Entonces cómo reconstituir los diferentes tipos de reactivos. Por lo tanto, en el paso 1, o cuál es el procedimiento. Así que, en el paso 1 se van a preparar las muestras y se van a tener los múltiples tipos de muestra como cultivos celulares, lisado celular, se puede tener el suero, se puede tener el plasma y se puede tener los tejidos y el procesamiento de todas estas muestras son diferentes excepto que se tiene diferente dependiendo del tipo de los agentes contaminantes lo que está presente y cómo procesar.
Por ejemplo, en el caso del sobrenadante de cultivo celular usted no necesita hacer nada excepto que usted elimina el material particulado y entonces usted simplemente puede usar estos sobrenadantes en el ensayo de la matriz de citoquinas. Lo único que hay que evitar es que hay que evitar los repetidos ciclos de deshielo de congelación. De manera similar para el lisado celular que usted podría tener que saber pasar a través del lisado celular a través de filtros de 0.2 micrones y otro tipo de cosas.
Por lo tanto, que no habrá agentes interferentes presentes y entonces usted tiene que hacer la estimación de proteínas. Por lo tanto, eso no va a añadir muchas citoquinas y muy pequeñas citoquinas de lo contrario las detecciones van a ser no perfectas. Del mismo modo, lo similar de lo que tienes que hacer por el suero, así como el plasma y el análisis de tejido también se está haciendo con un conjunto de protocolos, que tienes que seguir.
Y en última instancia lo que vas a conseguir siguiendo cualquiera de estos procesos es que vas a conseguir una mezcla de las proteínas y donde están presentes tus citoquinas. Y entonces la idea es que debes usar esa mezcla de células en particular o la mezcla de proteínas de inmediato o simplemente guardarla en un-20, evitas el ciclo de congelación de deshielo y luego también deberías hacer las estimaciones de proteínas. Por lo tanto, no debe ver mucha variabilidad de sus resultados de un lote a otro por lotes.
(Consulte el tiempo de la diapositiva: 14:55) Por lo tanto, el reactivo que necesita para preparar una región es que tiene que preparar la matriz de citoquinas. Por lo tanto, usted va a obtener la membrana de nitrocelulosa que en realidad contiene los anticuerpos de citocina, lo único que tiene que hacer es porque se trata de membranas de citoquinas muy sensibles. Por lo tanto, no debes manejar las membranas solo con la mano enguantada y usas las pinzas en lugar de la mano o los guantes.
Por lo tanto, utilizas los guantes y además de usar las pinzas, entonces tienes que preparar el anticuerpo de detección. Así que, lo que la empresa te va a dar, te va a dar un stock concentrado y luego hay que simplemente diluir el stock concentrado y reconstituir con la ayuda del buffer para que la mesa proporcione o se pueda utilizar el agua destilada, entonces hay que preparar el buffer de lavado, hay que preparar los reactivos de chemi.
Y todo esto que vas a utilizar o vas a preparar según las instrucciones lo que te va a dar la empresa en los folletos.
(Hora de la diapositiva: 15:55)
Y luego cómo realizar los ensayos. Así que, traigan todo antes de empezar este proceso hay que asegurarse de que todos los reactivos estén en la temperatura ambiente y luego los incuba y su muestra esté en el hielo, para evitar la descontaminación hay que usar los guantes mientras se realizan los procedimientos. Porque usted sabe que las manos humanas también están conteniendo los diferentes tipos de está hecho de piel.
Así, las células de la piel son muy frágiles. Por lo tanto, cuando usted está haciendo todos estos procedimientos, la célula de la piel también puede realmente ser pelado y también pueden ser capaces de contaminar su muestra y que en realidad le va a dar la variabilidad. Por eso hay que ponerse los guantes por si acaso. Por lo tanto, que no debe añadir las proteínas de su cuerpo. Primero preparas todo el reactivo y como comentamos.
Entonces usted realmente va a hacer lo que sabe que tiene que mojar el buffer y entonces usted tiene que usar el buffer de ensayo 6 como un buffer de bloques. Luego tienes que usar las pinzas de punta plana y retirar la cada membrana para que se utilice entre las láminas protectoras y colocarla en un pozo o para un plato bien multi, el número en la membrana debe estar orientado hacia arriba. Por lo tanto, la membrana cuando usted está se ha mantenido en una entre la hoja 2 de polietileno.
Y eso tiene que ser eliminado y entonces esta membrana tiene el material impreso y ese material impreso debe ser orientado hacia arriba. A continuación, incuba esto con el con su muestra en una plataforma de balanceo y oriente las bandejas. Por lo tanto, que cada membrana de la membrana final para terminar en el oleaje. Mientras que las membranas están bloqueando la preparación de la muestra mediante la adición de 1 ml de cada muestra, 2,5 ml de almacenamiento intermedio 4 en los tubos separados.
Ajuste al volumen final de 1,5 ml con el buffer 6 de la matriz según sea necesario. Luego agregas 15 microlitros de array de citoquinas reconstituidas, anticuerpos de detección, cocktail a cada muestra preparada, mezcla e incuba por temperatura ambiente durante 1 hora.
(Consulte el tiempo de la diapositiva: 18:02) Después de haber incubado la noche en un agitador de la plataforma, retire cuidadosamente cada membrana y colóquela en el recipiente de plástico individual con 20 ml de búfer de lavado 1X. Enjuague los 4 bien multi desionizados o secos a fondo. Lave cada membrana con un búfer de lavado 1X durante 10 minutos en una plataforma balanceadora. Repetir 2 veces para un total de 3 lavados, entonces usted va a hacer una detección.
Por lo tanto, con esto se va a hacer una detección de la muestra. Por lo tanto, ahora su membrana está lista para ser detectada por el sistema streptavidin-HRP. A continuación, pipeta los 2 ml de mezcla de HRP diluida en el bien de los 4 platos múltiples. Luego retira cuidadosamente cada membrana de su recipiente de lavado, permite que el exceso de tampón drene de la membrana. Devolver la membrana al envase de 4 platos bien múltiples, la escucha diluida que.
Tapado el pozo con la tapa, incubar durante 30 minutos. Por lo tanto, que el complejo estreptavidin-HRP irá y se unirá a los anticuerpos biotinilados.
(Hora de la diapositiva: 19:12)
Y luego se quita la membrana de la cada bien permitiendo que el exceso de agua de lavado para drenar apagado por el borde inferior en la toalla de papel. Coloque cada membrana en la hoja inferior del protector de láminas de plástico con el número de identificación hacia arriba. A continuación, pipeta 1 ml de los reactivos de la quimii en cada membrana y luego cubra cuidadosamente con las hojas superiores del protector de papel plástico.
Alisar suavemente cualquier burbuja de aire y asegurarse de que se va a extender de manera uniforme a todos los rincones de la cada membrana, incubado durante 1 minuto y luego se va a adquirir la imagen. Porque una vez que añades los reactivos de chemi que tienes que hacer para el minuto 1. Por lo tanto, que el sustrato lo que está presente en los reactivos de la quimii van a ser procesados por la enzima y luego te va a dar la señal y luego hay que capturar la imagen.
(Consulte el tiempo de la diapositiva: 20:06) Entonces, usted va a envolver la membrana de exceso de plástico alrededor de la parte posterior del protector de la hoja. Por lo tanto, que la membrana y los protectores de hoja están completamente envueltos. Por lo tanto, esto es todo acerca del protocolo lo que tienes que seguir y me gustaría llevarlo a mi laboratorio donde los estudiantes en realidad van a mostrar cómo utilizar la matriz de citoquinas para medir los diferentes tipos de citoquinas.
Y con esta demo, en realidad te van a decir todas y cada una de las precauciones qué tienes que tomar y cuáles son los diferentes pasos que tienes que seguir. (Video Starts: 20:41) Hoy voy a demostrar cómo realizar una matriz de citoquinas. La matriz de citoquinas no es más que una matriz de proteínas donde se puede detectar mis contactos completos de la toma de muestras. Las muestras pueden ser de un sobrenadante de cultivo celular o de propietarios de tejidos o de células.
También puede usar suero o sangre. Por lo tanto, generalmente pongo detrás de estas matrices de citoquinas cuidadosamente seleccionados los anticuerpos de captura son vistos en una membrana de la matriz, cuando estos anticuerpos de captura entran en contacto con el contrario que se adjuntan, entonces de nuevo usted tiene que proporcionar un anticuerpo de detección, que formará un complejo con su analito que se detecta simultáneamente con el sustrato de quimioluminiscencia.
Por lo tanto, hoy vamos a utilizar los sistemas R y D más citoquinas (()) (21:46). Así que, solo gire, así que voy a abrir este panel de citoquinas, verter paneles de la matriz de citoquinas, como se puede ver hay puntos azules, cada punto azul indica el anticuerpo de captura. Entonces, lo que tenemos que hacer, primero tenemos que bloquear este índice. Por lo tanto, para hacer eso, utilizamos un buffer de array 6 dispense, hemos formado el buffer 6 de la matriz en cada pozo en este 4 panel de pozo.
Por lo tanto, lo siguiente es que tiene que colocar estas matrices en este buffer de matriz 6. Por lo tanto, saca cuidadosamente la membrana fuera de esa bolsa en esta película, este número lo que puedes ver debe enfrentarse al lado hacia arriba. Por lo tanto, cuando me mantengo en el buffer 6, como puedes ver el color azul gradualmente desaparece. Así que, ese color de desenfoque apareció lo que tenemos que hacer es que tenemos que cubrir este y mantener en un agitador durante 1 hora a temperatura ambiente, Mientras el bloqueo de la matriz está pasando, tenemos que prepararnos para las muestras, estos son los sobrenadantes de la cultura celular. Por lo tanto, primero tenemos que centrifugar para eliminar cualquier escombro. Y de eso tenemos que sacar 1 ml de muestra y hacerla hasta 1,5 ml usando buffer de array 4 bien. Así, ya centrifugado. Ahora voy a añadir el buffer 4 de la matriz a las muestras. Una vez que ha añadido el almacenamiento intermedio 4 a muestras.
A continuación hay que preparar el cóctel de anticuerpos de detección mediante la adición de 100 microlitros de agua destilada a anticuerpos de detección. Así que, esto lo he preparado añadiendo 100 microlitros hay que suspender correctamente. Así que, de esto hay que sacar 15 microlitros y añadir cada muestra. Así que, hagamos esto, aquí ahora mantendremos estas muestras bajo una plataforma mecedora con agitación constante durante 1 hora a temperatura ambiente.
Después de bloquear la matriz enmendada tenemos que quitar el papel negro. A continuación, cómo si el anticuerpo de detección se incuba con estas muestras. Ahora tenemos que introducir las muestras en un miembro. Por lo tanto, voy a verter todo esto en esta membrana, para cada muestra tenemos que usar la punta separada. Por lo tanto, que no obtendremos ninguna señal cruzada. Una vez que introduzca esta muestra, cierre cuidadosamente la tapa y la mantenga a 4 grados centígrados en una sacudida constante durante la noche.
Así que, después de eso tenemos que desarrollar incubado con el anticuerpo conjugado streptavidin-HRP entonces vamos a incrustar, pero eso será más adelante, ahora mantendremos esta plataforma oscilante durante la noche para 4 grados centígrados. Así que hemos incubado de la noche a la mañana con la muestra y ahora tenemos que eliminar la sección del bloque, después de eliminar la solución de la muestra, tenemos que añadir el búfer de lavado para eliminar los anticuerpos no vinculados.
Cubre la tapa y tú cómo guardar 10 minutos en un sacudidor de la plataforma mecedora, después de lavar aquí retiramos el buffer de lavado de eso, una vez que quites todo el buffer de lavado tienes que añadir solución diluida de estreptavidin-HRP a esta bandeja. Por lo tanto, lo que usted tiene que hacer tiene que preparar estreptavidina-HRP diluida según las instrucciones del fabricante, este es el sustrato de estreptavidin-HRP.
Como se puede ver diluir 1 es a 2000. Por lo tanto, ya preparé solución diluida, esta es la solución diluida Streptavidin-HRP. Por lo tanto, después de este 2, 2 ml hay que añadir a cada matriz. Por lo tanto, voy a añadir esta. Por lo tanto, durante este proceso, no deje que el blat se seque, una vez que ha añadido este estreptavidin-HRP mantener esta placa en una plataforma de balanceo durante 30 minutos. Por lo tanto, después de la incubación con estreptavidin-HRP ahora tenemos que lavar al menos 3 veces usando buffer de lavado.
Entonces vamos a desarrollar el caldo. Por lo tanto, estos son lavados y listos para desarrollarse. Por lo tanto, utilizaremos el agente de reactivo de quimii suministrado por el fabricante. Por lo tanto, tenemos que mezclar un reactivo de quimii 1 con el reactivo de quimii 2 en 1 es a 1 razón, entonces lo agregaremos a la matriz, entonces lo veremos en datos de chemi. Por lo tanto, usted tiene que añadir el reactivo de la quimii encima de él, permitir que se enrolle sobre el blat, entonces usted desliza suavemente para eliminar el exceso de reactivo quimii, sólo vamos a desarrollar la muestra.
Por lo tanto, mientras se expone tiene que mantenerse constante para cada muestreo para evitar cualquier desajuste de señal. Por lo tanto, estas son la exposición de la señal sólo que vamos a utilizar la normalización de las citoquinas presentes en la muestra. Así que, como puedes ver aquí, esta es la citoquina real. ¿Cuáles son los puntos rojos que muestran que esos son realmente píxeles saturados? Por lo tanto, podemos eliminar esa simplemente. Por lo tanto, esta es la matriz de citoquinas como podemos ver, cada punto representa 1 citocina y esquinas uno. Este ángulo uno, estos 3 representa un punto de control que podemos utilizar para la normalización.
Y aquí 2 puntos realmente no podemos ver, eso es en realidad PBS 1. Por lo tanto, esta es la matriz de citoquinas. Durante este proceso, a veces no podemos obtener señal o podemos obtener un exceso de señal. Así que, en ese caso, tienes que mirar con cuidado en tu protocolo y todos los búferes, ya sea que preparaste concentración correcta de buffer. Y así siempre use guantes. (Fines de vídeo: 35:15) Así que, con demo, estoy seguro de que podría haber entendido el protocolo qué tiene que seguir y cómo detectar las citoquinas en el uso de la matriz de citoquinas.
(Hora de la diapositiva: 35:30) El resultado que usted ve después de que usted está haciendo con este ensayo es el número de puntos que usted va a ver en la membrana. Por lo tanto, puede imaginarse que tiene 2 muestras, una es una muestra no tratada, la otra es una muestra tratada. Y lo que van a ver son estos puntos, lo que hay en la esquina, y estos puntos son en realidad los puntos de referencia. Entonces, lo que tienes es que tienes una hoja de matriz de citoquinas donde te han dado que lo que es medio por el A 1 A 2 y todo eso.
Entonces, lo que ves es que tienes la numeración en el lado izquierdo, que es como A B C D así, y tienes los números en este lado. Por lo tanto, todos estos números son en realidad correspondientes a las citoquinas individuales. Por ejemplo, lo similar A 3 es correspondiente a algo y de manera similar, el A 4 es correspondiente a algo. Así que, usted sabe, que es parte es correspondiente a lo que.
Y estos son los puntos de referencia. Por lo tanto, estas referencias se utilizan para alinear la membrana con la hoja de referencia. Por lo tanto, que usted sabrá qué puntos es en realidad corresponde a qué y puntos de referencia también se han utilizado para la ecualización de los propósitos. Por ejemplo, si usted está tratando de comparar esto y versus esto, entonces todas las intensidades tienen que ser comparadas entre sí usando esto como factores igualadores.
Así que, cómo analizar estos resultados, así que, lo que vas a ver es, vas a ver un tipo diferente de spots y lo que tienes que hacer eres tú. Así, por ejemplo, estos 2 puntos son una parte del par como las 2 citoquinas, una vez una sola citocina en duplicados. Por lo tanto, hay que medir la intensidad de este lugar en particular. Y de manera similar, usted tiene que ir al lugar en la muestra tratada también y luego tiene que medir.
Y luego usando estos puntos de referencia, usted tiene que calcular cuál será el pliegue de multiplicaciones que tengo que usar para igualar este punto con este punto y entonces sólo usted puede ser capaz de trazar la intensidad de esta citocina en particular, ya sea que esté regulando o regulando.
Así, la señal positiva de lo que se ve en la película desarrollada se puede identificar la colocación en la plantilla de superposición transparente en la imagen de la matriz y alinearla con el par de puntos de referencia en la esquina 3 de cada matriz, se incluyen puntos de referencia para alinear la transparencia y demostrar que la matriz se ha incubado con la estreptavidina-HRP durante el procedimiento de ensayo.
Por lo tanto, esto realmente hace referencia a las manchas se están haciendo simplemente porque en realidad van a ser un control positivo que la nada está mal con el sistema de detección de estreptavidin-RP o sistema de detección y usted realmente está recibiendo las reacciones de trabajo. Pero por ejemplo, en algunos casos si usted no obtiene los resultados, entonces el punto de referencia definitivamente debería darle la señal independientemente de si la muestra le está dando una señal o no.
Debido a que el punto de referencia no tiene los anticuerpos primarios, simplemente están teniendo los otros anticuerpos y es por eso que la estreptavida definitivamente irá y se unirá a estos puntos, entonces usted tiene que medir la intensidad del píxel en cada punto y entonces usted tiene que utilizar cualquier software de análisis de imagen para comparar la intensidad de pixel de la muestra no tratada versus la muestra tratada, usted tiene que utilizar estas referencias spot como los factores de ecualización para multiplicar o para dividir las señales.
Y así es como usted puede ser capaz de comparar para saber si la señal es sobre la expresión o qué señal es la expresión hacia abajo. Por ejemplo, si te muestro que, esta imagen que lo que ves es que esta señal en realidad no está presente en esta muestra no tratada en particular, pero es muy intensa en la muestra tratada. Del mismo modo, esta señal es débil en comparación con la señal es muy alta.
Y lo que ves es todo esto en señal de círculo todas estas señales son bastante altas en comparación con eso, son muy, muy débiles en la muestra no tratada, lo que significa que estas son las citoquinas que en realidad están aumentando cuando usted está tratando las células con un particular con un tratamiento. Esto significa que estas citocinas probablemente podrían tener algún papel en la conducción de los procesos biológicos o podrían tener un papel en la conducción de las respuestas inmunológicas.
Por lo tanto, todo esto se trata de los diferentes tipos de herramientas inmunológicas lo que hemos desusado en base a las interacciones de antígenos y anticuerpos, también hemos discutido algunos de los inmunoensayos lo que también puedes usar para monitorear las reacciones inmunológicas o también puedes usarlas para responder algunas de las preguntas biológicas. Así que, con esto me gustaría concluir mi conferencia aquí, en una conferencia posterior vamos a discutir en realidad algún aspecto más relacionado con la biotecnología experimental, gracias.