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Sandwich y ELISA competitivo

Hola a todos, este es el Dr. Vishal Trivedi del Departamento de Biociencias y Bioingeniería IIT Guwahati y así, lejos lo que hemos discutido hemos discutido acerca de los diferentes tipos de interacciones de anticuerpos de antígeno, donde hemos discutido acerca de las reacciones de explicación que hemos discutido acerca de los inmunoensayos de radio que hemos discutido acerca de las reacciones de precipitación y en la conferencia anterior, también hemos discutido sobre los inmunoensayos. Así, dentro del inmunoensayo hemos hablado de la Elisa directa así como de la indirecta Elisa. Así que, ahora, posterior a eso también vamos a discutir sobre el sándwich Elisa (Referir Slide Time: 01:42) Sandwich Elisa es en realidad un tipo diferente de configuración esta configuración se utiliza para medir el nivel de antígeno como la insulina en el suero y en la configuración directa de Elisa una cantidad conocida de anticuerpo es anticuerpo específico para capturar el antígeno. El antígeno es entonces reconocido por el anticuerpo secundario vinculado a la enzima. Se utiliza un sustrato colorimétrico para medir el nivel de antígeno. Así, que en el sándwich Elisa se usan los 2 anticuerpos uno es el anticuerpo de captura.
Por lo tanto, lo que puedes hacer es primero tomar el pozo y luego recubrir esto bien con un anticuerpo de captura y luego agregas tu antígeno de interés. Por ejemplo, en este caso es la insulina. Por lo tanto, usted agrega su muestra de paciente y luego la insulina o el antígeno va a unirse a este anticuerpo de captura, entonces usted hace un paso de lavado y luego agrega el anticuerpo primario adicional. Por lo tanto, eso realmente va a reconocer el antígeno de nuevo. Y luego se agrega el anticuerpo secundario que en realidad va a reconocer este anticuerpo en lugar de este anticuerpo.
Y entonces usted va a añadir el sustrato y que en realidad le va a dar el producto que va a ser de color en la naturaleza y que es cómo usted puede ser capaz de medir el nivel de antígeno presente en la muestra del paciente o el líquido biológico. Por lo tanto, el propósito de la Elisa sándwich es medir el antígeno, mientras que el propósito de la Elisa indirecta es medir el nivel de anticuerpos presentes en la sangre.
(Consultar el tiempo de la diapositiva: 03:19) Por lo tanto, en este método de captura de anticuerpos se utiliza para recoger el antígeno de la muestra. Después se utiliza un segundo anticuerpo para detectar el antígeno unido al anticuerpo de captura. El segundo anticuerpo se dirige contra el antígeno utilizando un epítopo distinto único. El anticuerpo está vinculado a la biotina y que puede ser reconocido por el complejo de avidina o estreptavidina-HRP. En el último paso se usa el sustrato de próstata para obtener una lectura. Por lo tanto, cuando los usa, cuando inmoviliza los anticuerpos de captura, el antígeno va y se une al anticuerpo de captura.
Luego se utiliza el anticuerpo de detección, que en realidad va a utilizar el epítopo diferente presente en el mismo antígeno. Y entonces usted tiene la opción de utilizar el anticuerpo secundario o puede utilizar el tipo evidente de biotina del sistema de reconocimiento y entonces usted va a añadir el sustrato y que en realidad el sustrato va a ser procesado por el HRP. HRP significa, peroxidasa horseradish y que en realidad le va a dar el producto de color y ese producto de color puede ser reconocido por los ácidos calorimétricos.
(Consulte la hora de la diapositiva: 04:34) Así que, veamos cómo hacerlo y cuáles son los materiales necesarios. Por lo tanto, en primer lugar si usted requiere un anticuerpo de captura por lo que, en este caso, le estamos mostrando la Elisa para el TNF alfa de la muestra del paciente. Por lo tanto, usted está usando el anticuerpo monoclonal anti-TNF alfa. Se utiliza la dilución de 1 a 250 para recubrir en el tapón de recubrimiento utilizando la placa Elisa. Luego se requiere un anticuerpo de detección.
Por lo que se utiliza el anticuerpo monoclonal TNF alfa de HR biotinilado y se requiere la dilución recomendada de 1 a 500 en el amortiguador de reacción para detectar el TNF alfa en la muestra, entonces se requiere el sustrato enzimático. Por lo tanto, el conjugado de peroxidasa estreptavidin-horseradish se está utilizando como un sistema de detección y luego se requieren los estándares. Por lo tanto, en el caso de esto usted realmente necesita los estándares del ratón TNF alfa.
Por lo tanto, eso; usted puede ser capaz de realizar la reacción estándar. Por lo tanto, usted será capaz de medir el nivel de TNF alfa en las muestras de pacientes y el tratamiento enzimático HRP conjugado. Por lo tanto, este es el sustrato que usted necesita para usar y la dilución recomendada es de 1 es a 250 en a para detectar el TNF alfa en la muestra.
(Consulte la hora de la diapositiva: 05:53) Aparte de que necesita un almacenamiento intermedio de revestimiento. Por lo tanto, esta es la composición del buffer de recubrimiento. El tampón de recubrimiento tiene que ser preparado fresco y usted tiene que usar eso en el lapso de 7 días. Luego se requiere el diluyente de Assay. Por lo tanto, el diluyente de ensayo es un PBS que realmente puede utilizarse para preparar las diferentes diluciones de muestras. A continuación, necesita el almacenamiento intermedio de lavado. Por lo tanto, el buffer de lavado contiene el PBS más tween-20 y luego se requiere la solución de sustrato que es el TMB y el peróxido de hidrógeno.
Y luego, una vez que la reacción ha terminado, entonces usted requiere la solución de parada que contiene el H3PO4 o el ácido sulfúrico. A continuación, se requiere la placa de pozo de 96 para hacer la Elisa y luego se requiere el lector de microplaca que en realidad puede ser capaz de capturar la absorbancia a 450 nanómetro y luego se requieren los tubos de micropipeta y la placa o el parafilm.
(Ver Diapositiva: 06:50) Paso uno en el paso que tiene que recoger el espécimen o la muestra del paciente o el líquido biológico. Por lo tanto, en el paso uno hay que hacer una colección de muestras y el manejo. El espécimen debe ser claro, no hemolizado y no lipémico. En el caso del cultivo celular, retirar cualquier partícula por centrifugación y ensayo inmediatamente o almacenar la muestra a -20 grados centígrados. Evite los ciclos repetidos de congelación-deshielo.
Así que, incluso si se conserva la muestra a -20, no se debe repetir el ciclo de congelación de deshielo porque como muchas veces se va a hacer el ciclo de congelación de deshielo en realidad va a dañar los antígenos, lo que está presente dentro de la muestra y que en realidad va a reducir su reactividad cruzada. Mientras que, en el caso de la sangre del paciente, utilizar un tubo de separación de suero y permitir que la muestra se coagule durante 30 minutos y luego enviar un fusible durante 10 minutos.
Por lo tanto, en el caso, si usted está procesando con la sangre del paciente, usted no necesita el componente de sangre que sólo requiere el componente de suero o el componente de fluido. Por lo tanto, lo que usted hace es simplemente permitir que la sangre coagule y luego tomar el sobrenadante claro para detectar el antígeno ya sea TNF alfa o insulina o cualquier otro antígeno. Usted retira el suero y el ensayo inmediatamente o los almacena en -20 grados. Evita los ciclos de congelación de congelación repetidos. Así que, eso es muy importante que no se debe hacer el ciclo de congelación-deshielo repetido porque eso en realidad va a reducir la reactividad del antígeno contra el anticuerpo.
(Consulte el tiempo de la diapositiva: 08:25) Paso 2 tiene que preparar las diluciones estándar del TNF alfa. Así que lo que tienes que hacer es empezar con el 1000 Pico gramo por ml y luego haces las diluciones en serie como como comentábamos para la Elisa indirecta también, y en última instancia vas a conseguir las diluciones de 15,56 Pico gramo por ml. Así que esto es exactamente lo que tienes que hacer, tienes que empezar con las soluciones de stock y luego primero para preparar el 1000 pico gramo por ml. Se toma el microlitro de 300 que diluye y así es como en realidad se está diluyendo cada vez que se diluye la mitad en el eppendorf individual.
Y así es como van a preparar las diluciones completas. Por lo tanto, usted toma lo que el contenido viene junto con el kit en un agua desionizada para obtener un stock de 30 nanogramos por ml. Y entonces puedes hacer las diluciones como esta. Y usted vórtice la mezcla para que va a ser una diluciones homogéneas y entonces sólo usted realmente va a preparar las diluciones en serie. Porque una vez que añades las cosas, tienes que mezclar esto muy a fondo para que en realidad vaya a ser homogéneo y entonces solo sacas un adicional de 300 microlitros diluido para hacer las diluciones adicionales.
(Hora de la diapositiva: 09:45) El paso 3 tiene que hacer el recubrimiento. Así que añadir los 100 microlitros de anticuerpos de captura diluidos a cada pozo. Y luego se incuba de la noche a la mañana a 4 grados y Aspirate y se lava 3 veces con el buffer de lavado. Así que ahora has recubierto tu anticuerpo de recubrimiento. Entonces usted hace el bloqueo. Por lo tanto, exactamente de la misma manera que usted tiene que hacer el bloqueo, de modo que no habrá interacción no específica del antígeno al plástico de ese pozo en particular. Y luego se añaden los 100 microlitros de TNF alfa estándar o de muestra e incubarlo durante 2 horas a temperatura ambiente.
Luego en el paso 5, aspiras la muestra y lavas la placa 5 veces con el buffer de lavado, y luego paso 5, tienes que hacer la detección. Por lo tanto, añadir los 100 microlitros de detectores a cada pozo. Por lo tanto, el detector es un conjugado estreptavidin-HRP. Incubar durante una hora a temperatura ambiente aspirando la solución del detector lavarla y luego se incuba con las soluciones de sustrato y que en realidad le va a dar las reacciones después de la alguna vez y que en realidad se puede leer con la ayuda del espectrofotómetro.
(Consultar Tiempo de Slide: 10:57) Ahora, la determinación del nivel alfa de TNF, así que, sólo le estamos dando un ejemplo de TNF alfa, pero que se puede hacer con cualquier antígeno, la absorción media de cada conjunto de la muestra y restar la absorbancia de fondo de la cada media. Dibuje una calibración trazando la consulta estándar de TNF alfa contra la absorbancia. Por lo tanto, usted realmente absorbe que puede trazar la absorbancia en el eje y y trazar la concentración de TNF alfa en el eje x.
Y eso en realidad le va a dar curva y utilizar un análisis de regresión y se puede poder dibujar la ecuación de esta curva en particular y luego se utiliza esta ecuación para determinar la concentración de TNF alfa en las muestras desconocidas. Por lo tanto, todo esto se trata del sándwich Elisa para determinar el nivel de antígeno en la muestra de paciente o el líquido biológico.
(Tiempo de Slide: 11:56) Ahora, esta es la Elisa competitiva. Por lo tanto, la Elisa competitiva se basa realmente en la unión de la competencia para el anticuerpo primario entre el antígeno objetivo en una muestra y el mismo antígeno que se recubre sobre la placa de pozo múltiple. En este caso, lo que está haciendo el anticuerpo primario se añade por primera vez a la muestra para formar los complejos de anticuerpos de antígeno. La muestra se agrega entonces al pozo que se recubre con el antigeno objetivo, solamente el anticuerpo primario no enlazado en la muestra puede unirse al antigeno recubierto en el pozo.
Por lo tanto, cuanto más antígeno en la muestra, menos anticuerpo está disponible para atar el antígeno en el pozo resultante en una reducción de señal que significa, qué es lo que esto significa que usted primero hace que los complejos de antígeno de antígeno de antígeno en la muestra. Por lo tanto, lo que hace es tomar la muestra que agrega el anticuerpo, por lo que, lo que sucederá es que el anticuerpo irá y se unirá al antígeno. Por lo tanto, como he dicho, saben que los anticuerpos de antígeno siempre están haciendo un complejo en la proporción equimolar. Así que, supongamos; usted añadió el 10 microgramos de anticuerpo.
Entonces, ¿qué pasará? El microgramo de anticuerpos en realidad va a formar el complejo con el microgramo de antígeno de 10. Así que, ahora, imagina que tienes más cantidad de anticuerpos. Por lo tanto, supongamos que añadí el anticuerpo de 100 microgramos de antígeno y el nivel de antígeno que presenta su muestra es sólo de 20 microgramos. Por lo tanto, lo que sucederá es que el resto de los anticuerpos de los 80 microgramos todavía están disponibles, por lo que, ellos irán y se unen al antígeno lo que está disponible en la placa y es así como ellos realmente van a darle los readouts.
Pero si tienes más cantidad de antígeno por ejemplo, si tienes 80 microgramos de antígeno, entonces solo tienes disponibles las 20 moléculas de anticuerpos, lo que significa, ya que la cantidad de antígeno en el líquido biológico está disponible. En realidad va a seguir reduciendo el anticuerpo disponible para hacer una interacción con el antígeno que está presente en la placa. Esto significa que habrá una competencia de antígeno entre el antígeno que está presente en la placa y el antígeno lo que está presente en la muestra y por eso se llama así como la Elisa competitiva.
Ya sea directa o la detección indirecta se puede utilizar en la Elisa competitiva que significa, usted tiene un antígeno que en realidad se ha recubierto sobre la placa. Y usted tiene un anticuerpo que está unido al antígeno que está en la muestra y luego cuando se agrega a este, por lo que, anticuerpo más antígeno es así, la estrella de antígeno está haciendo un complejo como el antígeno de anticuerpos complejo estrella. Por lo tanto, cuando usted tiene el antígeno que está recubierto sobre la placa, este antígeno es en realidad menos.
Así que tienes el exceso de anticuerpos y ese exceso de anticuerpos va a reaccionar con este antígeno y que así, este anticuerpo tiene una enzima así, que en realidad va a procesar el sustrato y te dará el color. La ventaja de este ensayo es que es altamente sensible que se puede utilizar con la muestra de crudo y usted puede ser capaz de utilizar el mute la señal lo que se puede cuantificar con la curva estándar de dilución estándar.
Por lo tanto, en realidad se puede utilizar la diferente cantidad de antígeno en la solución y que en realidad le permitirá medir el nivel de antígeno. La desventaja es que usted requiere un anticuerpo primario que es muy específico para en ese antígeno en particular. No debe tener la cruz reactiva.
(Consulte el tiempo de la diapositiva: 15:45) Por lo tanto, esto es todo acerca de las interacciones de los anticuerpos del antígeno. Discutimos acerca de la aglutinación que discutimos acerca de las precipitaciones que discutimos acerca de los aminoácidos de radio y discutimos acerca de las inmunoprecipitaciones. Dentro del ensayo de inmuno también discutimos sobre la Elisa. Y ahora, vamos a discutir sobre la mancha occidental.
(Vea el tiempo de la diapositiva: 16:09) Así que, la mancha occidental es una técnica para detectar las proteínas lo que está siendo hinchado sobre la membrana de nitrocelulosa. Por lo tanto, el blotting occidental es una técnica popular para detectar la proteína específica presente en el lisado crudo o la homogeneización. Utiliza la separación de diferentes proteínas en la electroforesis en gel preferiblemente SDS-PAGE y luego en la transferencia de las proteínas a un soporte sólido tal como la membrana nitrocelulosa.
Un anticuerpo primario dirigido contra la proteína del interés y luego un anticuerpo secundario se usa para detectar el anticuerpo primario y dar el color o el sustrato quimioluminiscente. Por lo tanto, lo que usted tiene es que tiene las proteínas presentes en el SDS que usted transfiere a la membrana de nitrocelulosa, entonces usted agrega los anticuerpos primarios, el anticuerpo primario se va y se une a los antígenos de su objetivo, entonces usted elimina el paso con el lavado.
Por lo tanto, el lavado eliminará los anticuerpos no específicamente vinculados, entonces usted va a añadir los anticuerpos secundarios y que en realidad va a unirse al anticuerpo primario y luego en última instancia puede ser capaz de añadir el sustrato colorimétrico o el sustrato quimioluminiscente. Y eso en realidad le va a dar la señal junto a la proteína donde está atado el anticuerpo anti primario. Así que, veamos cómo realizar el blotting occidental.
(Hora de la diapositiva: 17:30) Así, el material lo que requiere el material lo que necesita. Si las celdas. En este caso, las células de E. coli que están sobreexplotando el GFP, se requieren los amortiguadores de transferencia de estándares de proteínas, membrana de transferencia como las membranas de nitrocelulosa, la bandeja de plástico, espátula, láminas de blotting, unidades de electrocoagulación semi secas, que se requiere para electro blot las proteínas del gel a la membrana de nitrocelulosa entonces se requiere el reactivo para realizar la electroforesis se requieren los anticuerpos primarios para detectar el GFP en las proteínas que requieren los anticuerpos secundarios que se acopla con HRP y luego se requieren los reactivos en desarrollo.
(Tiempo de la diapositiva: 18:12) En el paso 1, hay que preparar las muestras para que la preparación de la muestra dependa del tipo de célula para un tejido Primero, el tejido siguiente, como el tumor o todo el hígado o el cerebro, primero se descompone mecánicamente en las células individuales usando una licuadora y luego homogeneiza para las sonaciones. Una vez obtenidas las celdas individuales, se procesará como se describe a continuación. Para la célula, las células individuales se incuban con el amortiguador lisis que contiene detergente junto con la proteasa, así como el cóctel inhibidor de fosfato para proteger la muestra de la degradación.
Por lo tanto, el cóctel inhibidor de fosfato sólo se utilizará si está interesado en investigar los anticuerpos o agrupar el antígeno que es fosforilado. Por lo tanto, debido a que no desea una fosfatasa para eliminar el fosfato de las proteínas fosforiladas. Paso 2 usted tiene que electroforesis la muestra. Por lo tanto, su muestra está bien resuelta en la página de SDS, luego el paso 3 usted transfiere el gel de proteína a la membrana de la mancha.
Y luego el antes de hacer la transferencia de la membrana de blotting, usted tiene los múltiples pasos como usted tiene que preparar la membrana de transferencia. Así que hay que cortar la membrana en el mismo tamaño que el gel como si se tiene un gel de este tamaño hay que cortar la membrana de este tamaño. Y luego tienes que procesar la membrana de manera diferente dependiendo de la membrana que estés usando. Así, por ejemplo, si no está usando la membrana de nitrocelulosa, coloque la membrana en el papel de transferencia.
Y observado que el líquido tiene perversa la membrana en la suya apareció como un punto blanco necesita una consideración especial que significa si usted agrega el buffer de transferencia, esta membrana va a estar completamente mojada. No habrá ninguna mancha blanca presente en esta membrana, lo que significa que esta membrana no será visible. En realidad se va a sumergir en la transferencia y tomará el mismo color que su buffer de transferencia que indicará que la membrana es que ha tomado el buffer de transferencia.
Si estás usando la membrana de PVDF, que en realidad es una membrana hidrofóbica, entonces lo que tienes que hacer es sumergir la membrana en etanol al 100% etanol, porque entonces tienes que hacer un paso de carga porque la membrana PVDF tiene que ser porque es una membrana hidrofóbica. Por lo tanto, no enlazará muy bien la proteína. Por lo tanto, tiene que ser cargada con un solvente polar. Por lo tanto, lo que usted tiene que hacer es primero incubar la membrana de PVDF en el 100 por ciento de metanol durante algún tiempo y luego usted agrega la transferencia.
Y luego añade la transferencia el esfuerzo de transferencia debe tomar el PVDF el buffer y también debe ser no puede mostrar ningún color blanco. Decantar el metanol y sumergir la membrana en un amortiguador de transferencia y de 10 a 30 minutos adicionales. Así que, con esto la membrana de transferencia va a estar lista y luego hay que configurar el electrochapado.
(Hora de la diapositiva: 21:07) Así, montaje del casete de transferencia. Por lo tanto, lo que tienes que hacer es retirar el gel de apilamiento de la página e incubar el gel en un transformador durante 10 a 30 minutos. Coloque un par de láminas de borrado en las placas del ánodo. Por lo tanto, los operadores de transferencia están teniendo un ánodo en un lado y el cátodo en un lado y luego tienes que configurar las cosas como esta, tienes que poner primero los papeles de filtro entonces tienes que mantener tu membrana de nitrocelulosa o luego tienes que mantener tu gel.
Y entonces usted mantiene su membrana de transferencia o puede hacer reversa que puso primero poner el papel de filtro entonces usted puso el gel entonces usted puso la membrana y entonces usted guarda la capa siguiente de los papeles de filtro. Hay que asegurarse de que no haya ninguna burbuja presente entre el gel y la membrana nitrocelulosa porque sí habrá una burbuja de aire presente esa zona no va a ser no va a permitir la transferencia de proteína del gel a la membrana nitrocelulosa.
Por lo tanto, coloque la membrana de la tanceta en la parte superior de las láminas de borrado y retire el aire atrapado rodando el tubo de ensayo o la varilla de vidrio. A continuación, coloca el gel de PAGE en la parte superior de la membrana y retira suavemente la burbuja de aire atrapado rodando el tubo de ensayo que coloca las otras láminas de borrado en la parte superior. Y luego retirar la burbuja de aire atrapado rodando el tubo de ensayo o la varilla de vidrio y finalmente mantener la placa de cátodo generalmente la placa de cátodo de color rojo y marea la transferencia capturada por los 4 tornillos.
Así que, una vez que hayas hecho eso, tienes el tornillo de 4 en todos los lados y que en realidad vas a poner para atornillar el cassette de este particular gel y luego lo conectas al electrodo a la tarjeta de potencia y eso en realidad permitirá la transferencia de la proteína del gel al a la membrana de nitrocelulosa.
(Ver Diapositiva: 23:08) Entonces usted transfiere la proteína del gel a la membrana más que coloca el casete de transferencia en el tanque lleno con el buffer de transferencia conectar los operadores de transferencia a la fuente de alimentación y aplicar el voltaje constante después de que la transferencia desmonte todo el cassette y retire cuidadosamente la membrana de transferencia y compruebe la transferencia por la mancha de la zapata use un lápiz y la etiqueta de la manera diferente, lo que significa que si usted tiene estos carriles y esta membrana usted tiene que escribir el número de carril.
De modo que ese número de carril se puede utilizar posteriormente cuando se está haciendo el desarrollo de la planta química o se está utilizando la autoradiogramy o cualquier otro método, este número en realidad le permitirá identificar el carril en particular.
(Consulte la hora de la diapositiva: 23:54) El paso 4 tiene que hacer el bloqueo del bloqueo exactamente igual y luego el paso 5, tiene que hacer el sondeo. Por lo tanto, en el Western blot la proteína se puede hacer de 2 maneras. En el sondeo de 2 pasos hay que añadir primero el anticuerpo primario seguido de los anticuerpos secundarios. Por lo tanto, hay que tomar la dilución adecuada del anticuerpo primario que tiene para agregar el anticuerpo primario seguido por el lavado y luego tuvo que agregar los anticuerpos secundarios o en un sondeo de 1 paso.
Lo que usted tiene que hacer en un solo paso usted agrega el anticuerpo primario que está conteniendo la enzima que significa el anticuerpo primario que está etiquetado con la enzima o la sonda fluorescente, y que puede ser utilizado. Un análisis de un paso es muy poco común, porque el sondeo de un paso no le permite hacer porque el nivel de sensibilidad es muy bajo con el sondeo de un paso.
(Consultar Tiempo de Slide: 24:49) Entonces tienes que hacer el desarrollo de bloques. Hay múltiples maneras de desarrollar el bloque que está presente en la membrana. Usted tiene los sustratos cromogénicos basados en HRP como 4-cloro-napthol DAB o TMB o también puede tener la enzima fosfatasa alcalina. Por lo tanto, usted puede usar el sistema BCIP/NBT o tener los sustratos luminiscentes como para la HRP, tiene la luminol y el H2O2 o para la fosfatasa alcalina que tiene el fosfato de 1 2 dioxetano sustituido.
Por lo tanto, todos estos sustratos le están permitiendo detectar las proteínas lo que está siendo hinchado en la membrana de nitrocelulosa ya sea que usted tiene los métodos colorométricos o usted tiene los métodos quimioluminiscentes. Por lo tanto, ambos métodos están realmente permitiendo que usted pueda detectar las proteínas que la detección colorimétrica tiene la sensibilidad más baja en comparación con las detecciones quimioluminiscentes.
(Consulte el tiempo de la diapositiva: 25:49) Por lo tanto, se trata de la mancha occidental. Por lo tanto, hemos discutido todos estos pasos y luego también hemos discutido sobre cómo realizar estos pasos. Y ahora, para mostrarte cómo hacer este experimento, me gustaría llevarte a mi laboratorio y donde los estudiantes van a realizar estos experimentos, donde en realidad van a discutir todos y cada uno de los pasos cómo realizar y cuáles son los diferentes pasos que debes tomar, cómo quitar el aire atrapado de las burbujas de aire o el aire atrapado entre el gel, así como el sándwich.
¿Cómo procesar la membrana? Así, que en realidad va a ser útil para la transferencia de las proteínas de la página de SDS a la membrana de nitrocelulosa o la membrana de PVDF. Y con estos pasos, podrás entender el cómo realizar el blotting occidental en tus laboratorios.
(Video Starts: 26:40) En este video, le demostraremos cómo hacer un blot occidental y cómo analizar el resultado utilizando el sustrato de electro-quimioluminiscencia de ACL. Por lo tanto, aquí lo que haremos tendremos que ejecutar en primer lugar gel, luego transferiremos el método de transferencia cómo hacer la transferencia se mostrará en este vídeo. En el vídeo anterior ya hemos demostrado que cómo ejecutar cómo preparar las páginas de SDS y cómo ejecutar muestras de proteínas. Por lo tanto, en este video, particularmente estamos interesados en factores asociados con el blotting occidental.
Para hacer blot occidental necesitamos membrana y buffer de transferencia y el Medium de transferencia este es el uso para transferir este gel de ejecución a la membrana. Por lo tanto, aquí la membrana puede ser de 2 tipos. Una es nitrocelulosa que tiene baja eficiencia de unión a proteínas y la naturaleza hidrofóbica otra membrana es PVDF esta es membrana hidrofóbica y mayor capacidad de unión a proteínas. Por lo tanto, el procesamiento para el blot occidental es diferente de diferente para nitrocelulosa y PVDF.
Si usted está usando la membrana de PVDF, tenemos que tomar tenemos que cortar la parte si si usted ha preparado precortados precortados precortados, entonces normalmente si usted tiene si usted está tomando de una unión, usted tiene que cortar con precisión cuántos pozos desea. Por lo tanto, después de eso, tienes que etiquetar el frente en el negro donde el lado frontal se puede utilizar para transferir la proteína y que se puede utilizar en el paso anterior pasos adicionales también como la incubación de anticuerpos. Así que aquí para si quieres usar la membrana de PVDF tienes que cargar con el metanol.
Por lo tanto, dado que el PVDF es una membrana hidrofóbica, no se puede transferir directamente la transferencia en la primera que tiene que mantener en metanol durante al menos 20 minutos. Así que después de esto se puede llamar como carga. Así que después de esto, vamos a utilizar eso para la transferencia. Así que esto está impregnado en metanol y equilibrado en el buffer de transferencia. Por lo tanto, aquí al hacer la transferencia tenemos que considerar algunas cosas que el buffer siempre debe estar en condiciones de refrigeración.
De lo contrario durante esta transferencia a alta tensión generará altas temperaturas para que pueda degradar su proteína o disminuir la eficiencia de la transferencia. Es por eso que tenemos que mantener el buffer siempre en estado de refrigeración y dejar que comience la presentación. Así que necesitamos un gel por lo que ya estamos terminados el gel, además de eso, también necesitamos esponjas, que darán cojín al gel, para que el gel no se destruya durante el traslado.
Así que este es el Cassette que usaremos para la transferencia. Por lo tanto, este es el lado negativo de Cassette y este es el lado positivo. Por lo tanto, vamos a mantener gel en el lado negativo y el lado positivo la membrana del blot. Por lo tanto, cuando aplicamos el voltaje de este lado a este lado, la proteína negativa que será transferida, se moverá a lado positivo y será un capturado en la membrana. Así que primero por hacer estas esponjas que necesitamos mantener y también esto tal vez dar alguna unión no específica a la membrana.
Por lo tanto, lo que haremos, pondremos hojas de borrón encima de esto. Por lo tanto, después de esto hay que eliminar las burbujas de aire si hay algún presente. Por lo tanto, una vez insertas la hoja borrada, entonces tienes que mantener tu gel. Por lo tanto, aquí cuando tenemos que recordar que el gel después de terminar el SDS está funcionando hay que mantener en el buffer de transferencia. Por lo tanto, que dará idéntica condición o equilibrio tipo de cosa durante la transferencia. Por lo tanto, esa transferencia de proteínas puede ser fácil. Por lo tanto, este es el gel y mantenerse en el lado negativo.
Así que, después de eso tenemos que superponer con la membrana. A continuación tenemos que eliminar cualquier burbuja de aire. Tenemos que recubrir otra hoja de manchas y eliminar las burbujas de aire. Todos y cada vez que se introduce algo hay que eliminar una burbuja de aire. Por lo tanto, esta es la hoja final. Por lo tanto, este es el lado positivo de la Casete. Sólo como así, estos son los tornillos que tenemos que apretar para arriba, entonces sólo el contacto entre el gel y la membrana será suficiente para ser transferido.
Primero no se aprieta inicialmente sólo mantener y después de que la prensa el lado positivo de ese cassette luego apretada el tornillo. Por lo tanto, todas estas cosas se deben hacer en el almacenamiento intermedio de transferencia sólo a menos que se especifique. Así que este es el búfer de transferencia refrigerado. Ahora vamos a hacer transferencia. Verter suficiente almacenamiento intermedio. Y mantener este paquete de hielo también si la refrigeración no es suficiente, entonces puede haber generación de calor. Por lo tanto, con el fin de evitar eso, usaremos este paquete de hielo. Por lo tanto, esto mantendrá el buffer fresco hasta el final de transferencia de la transferencia.
Así que, una vez que eso acabe, sacas directamente el cassette y guardes. Si hay una insuficiencia de almacenamiento intermedio, puede añadir encima de eso. Asegúrate de que el casete se sumerja completamente, de modo que la transferencia sea adecuada y no haya burbujas de aire. Por lo tanto, una vez que la configuración haya terminado, ahora, usted puede transferir. La transferencia va bien. Así que cuánto voltaje necesitamos dar, depende de la transferencia para transferirlo varía. Generalmente en nuestro laboratorio le daremos al menos 2 horas de transferencia 120 voltios que es suficiente para transferir cuando las proteínas de bajo peso molecular también.
Pero, de instrumento a instrumento también varía. Necesitamos que sea necesario optimizar antes de realizar la transferencia. Después de 2 horas, tenemos que quitar el blot e incubar con el buffer de bloqueo. Por lo tanto, voy a parar aquí para quitar el casete guardar que en una bandeja, quitar los tornillos correctamente suavemente quitar las esponjas. Sacar el blot y mantenerlo en el buffer de bloqueo. En esta condición, tenemos que mantener si usted está manteniendo la temperatura ambiente, es por 2 horas por lo menos.
Si se mantiene en 4 grados centígrados, puede mantener durante la noche el contenido del buffer de bloqueo de leche descremada o BSA junto con tween-20. La transferencia de blot occidental es todo depende de la eficiencia, de cómo precisamente usted está haciendo la transferencia. Por ejemplo, usted no debe usar sus manos desnudas mientras maneja el blot o gel. Por lo tanto, cualesquiera que sean las proteínas presentes en sus dedos, se transferirá en gel o membrana que dará un fondo alto durante el desarrollo del blot.
Por lo tanto, siempre use guantes. Aparte de eso, mientras maneja el instrumento, asegúrese de que puede haber posibilidad de electricidad el choque puede suceder en algún momento. Por lo tanto, también tenemos que utilizar guantes y después de finis